Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, ein humanisiertes Mausmodell mit funktionellem menschlichen Immunsystem und Leber unter Verwendung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen und Hepato-Site zu generieren. Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in genetischeleber humanisierten Mäusen zu beantworten. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um Immunpathologien zu studieren, die durch HIV verursacht werden, wie bei Menschen beobachtet.
Den Prozess demonstriert Yimin Sun, ein Betreuer der Abteilung für Pathologie und Mikrobiologie, sowie Weimin Wang und Edwrd Makarov, Forschungstechnologe. Um zu beginnen, übertragen Nabelschnurblut in heparinisierten Röhren in einen sterilen laminaren Flussschrank gesammelt. Fügen Sie PBS hinzu, bis das Volumen auf 35 Milliliter erhöht wird.
Die Probe auf das Lymphozytentrennmedium schichten und 400 Mal G und bei vier Grad Celsius 35 Minuten ohne Pausen zentrieren. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht und verwenden Sie eine Transferpipette, um die weiße Buffy-Beschichtungsschnittstelle auf ein neues Rohr zu übertragen. Das buffy Fell in 30 bis 40 Millilitereiskaltem Puffer wieder aufhängen.
Kombinieren Sie mit einer Pipette 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 20 Mikrolitern 0,4% Trypanblau. 10 Mikroliter dieses Gemischs in die äußere Öffnung einer der beiden Kammern eines Zählschlittens geben und den Schlitten in einen automatisierten Zellzähler einsetzen, um die Zellen zu zählen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Den Überstand vorsichtig ansaugen und 300 Mikroliter eiskalten Puffer hinzufügen. Fügen Sie 100 Mikroliter des menschlichen FC-Rezeptor-Blockierungsreagenz und 100 Mikroliter monoklonaler Maus antihuman CD34 Antikörper konjugierte MicroBeads für bis zu 100 Millionen Zellen hinzu. 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.
Fügen Sie 10 Milliliter eiskalten Puffer, um die Zellen zu waschen und Zentrifugieren Sie es 300 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und hängen Sie das Pellet in 500 Mikrolitereiseis wieder auf. Danach eine positive SelektionLS-Säule in das magnetisch aktivierte Zellsortierfeld legen und mit drei Millilitern Eiskalten Puffer durchgehen.
Laden Sie die Probe in die LS-Säule, die MicroBeads, die an menschliche CD34-positive Zellen gebunden sind, in Proben einfangen und unter dem Einfluss der Schwerkraft in das Sammelrohr fließen lässt. Waschen Sie die Säule dreimal mit eiskaltem Puffer und sammeln Sie das Eluent im selben Sammelrohr. Dann tauchen Sie die Säule mit fünf Millilitereiskaltem Puffer ein, um die CD34-positiven Zellen in ein neues Sammelrohr zu überführen.
Wiederholen Sie den Vorgang, um eine Reinheit von über 90% Next zu erreichen, verwenden Sie Trypan-Blaufarbstoff und ein Hämozytometer, um die ausgewichenen CD34-positiven Zellen zu zählen. Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Zählen fünf Minuten lang bei 300-fachm G. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 125 Mikroliter PBS für eine Injektion, die sofort bei der Transplantation verwendet werden soll, erneut aus.
Um die Reinheit des CD34-Positiveluents zu überprüfen, nehmen Sie 50 Mikroliter der Suspension und inkubieren Sie es mit 10 Mikroliterpe konjugierten Anti-Human-CD34-Antikörper bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Danach waschen und suspendieren Sie die Zellen in PBS und führen Sie die Durchflusszytometrie durch. Analysieren Sie nach der Erfassung die Daten wie im Textprotokoll beschrieben.
Zuerst rufen Sie die kryokonservierten Hepatozyten ab und tauen Sie sie auf, wie im Textprotokoll beschrieben. Entfernen Sie dann die Biokappe und gießen Sie die aufgetauten Hepatozyten in ein 50 Milliliter konisches Rohr mit erwärmtem Auftaumedium. Schaukeln Sie die Röhre von Hand für ein paar Sekunden, um die Zellen aufzuhängen.
Pellet die Zellen bei 100 mal G und bei Raumtemperatur für acht Minuten. Waschen Sie die Pelletzellen in PBS mit 0,1%BSA und bündeln Sie sie mit frischen oder aufgetauten HSPCs in PBS auf ein Endvolumen von 80 Mikrolitern pro Maus. Befestigen Sie zunächst ein Ende eines sterilen Verlängerungsrohrs an einer 30-Spur-Nadel und das andere Ende an einer Ein-Milliliter-Spritze.
Füllen Sie die Spritze mit der Suspension von gepoolten HEPs und HSPCs. Passen Sie die Spritze in die Kerbe einer sich wiederholenden Dosierpipette und stellen Sie den Spender so ein, dass er 10 Mikroliter in jeder Presse ausgibt. Rasieren Sie jede Maus, wie im Textprotokoll beschrieben und schrubben Sie die linke Seite des Körpers jeder Maus mit 10%povidon Jod folgte 70%Isopropylalkohol.
Mit Vannas Typ Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut, Muskel und Peritoneum auf der linken Seite der Peritonealwand, um die Peritonealhöhle etwa 5 Millimeter unter dem unteren Rand des Rippenkäfigs zu betreten. Suchen Sie die Milz und verwenden Sie Zangen, um sie leicht in den Operationsbereich zu ziehen, um einen einfachen Zugang zu erhalten, und setzen Sie die 30-Spur-Nadel in den unteren Pol der Milz ein. Als nächstes entsperren Sie den Kolben der Dosierpipette und geben 10 Mikroliter des Volumens gleichzeitig mit einem Grenzwert von 60 bis 80 Mikrolitern pro Milz aus.
Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und schneiden Sie die Milz mit Ligating-Clips mit einem Ligations-Applier. Verwenden Sie dann mit sterilem PBS benetzte Applikatoren mit Baumwollspitzen, um die Milz wieder in die Körperhöhle zu schieben. Verwenden Sie ein unterbrochenes Nahtmuster, um die Muskelschicht der Bauchwand zu schließen.
Erreichen Sie den Hautverschluss mit einem unterbrochenen Nahtmuster mit nicht resorbierbaren Nähten. Übertragen Sie alle benötigten Materialien in eine ausgewiesene Biosafety Level Two Plus-Anlage. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung einschließlich einer Einwegabdeckung alle Kleider, Schuhbezüge, eine Gesichtsmaske und Doppelhandschuhe, einschließlich schnittbeständiger Handschuhe, zu jeder Zeit während der Arbeit mit dem Virus.
Wählen Sie Mäuse mit einer Rekonstitution von mehr als 15% der menschlichen CD45-positiven Zellen und mit einer Anwesenheit von menschlichem Albumin im Serum für HIV-1-Infektion. Intraperitoneal injizieren die Mäuse mit 1 000 bis 10.000 Gewebekultur infektiösen Dosen von 50 HIV-1 ADA in einem Volumen von 100 bis 200 Mikroliter pro Maus. Nach der Einschläferung der Mäuse, verbrauchen Sie die Leber von jeder Maus, wie im Textprotokoll beschrieben.
Sammeln und fixieren Sie die Lebern in 4%Paraformaldehyd über Nacht. Die Etablierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leber- und Immunzellen kann bei jedem Schritt mit sehr einfacher ELIZA bzw. Durchflusszytometrie leicht überwacht werden. Die Durchflusszytometrie wird regelmäßig durchgeführt, um die Entwicklung eines funktionellen Immunsystems zu bewerten und die Wirkung einer HIV-Infektion auf Immunzellen zu sehen.
Bei dual humanisierten Mäusen kann die Entwicklung funktioneller Immunzellen zwischen 15 und 90% des Lymphozytentors liegen. Für die Bewertung der Transplantation menschlicher Hepatozyten wird ELIZA für humanspezifische Albuminspiegel monatlich auf Mausserum durchgeführt. Mäuse, die sowohl mit HSPCs als auch mit HEPs eingeschrieben sind, zeigen humanspezifische Albuminspiegel von etwa sieben Mikrogramm pro Milliliter bis 377 Mikrogramm pro Milliliter in einem Monat, die während der Beobachtungszeit weiter wachsen.
Die Wirkung einer HIV-Infektion auf menschliche Immunzellen im Blut von dual enhumanisierten Mäusen wird durch Durchflusszytometrie und auf HEPs in der Leber durch das humanspezifische Albumin ELIZA überwacht. Um fünf Wochen verursacht HIV-1 einen Rückgang des menschlichen Albuminspiegels im Serum und es gibt eine Erschöpfung der menschlichen CK18-positiven Hepatozyten in den Leberabschnitten von dual humanisierten Mäusen. Ein niedrigeres Verhältnis von CD4 zu CD8 wird in der Regel im Blut und in der Leber von HIV-infizierten Mäusen beobachtet, im Vergleich zu Den Werten, die in der gleichen Maus vor der Infektion festgestellt wurden.
Blut sollte sorgfältig auf lymphozyten Trennmedium für Isolierungen von buffy Mantel geschichtet werden. Halten Sie für die Operation die Milz vorsichtig und setzen Sie die Nadel in den unteren Pol der Milz. Nach der Isolierung hämatopoetischer Stammzellen ist es wichtig, die Reinheit der CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen zu überprüfen, um CD3-positive Zellen und akute Injektionen von Hepatozyten von verschiedenen Spendern zu vermeiden.
Da die humanisierten Mäuse physiologischen Aspekt des menschlichen Immunsystems und der Leber zeigen, könnten die entwickelten Mäuse genutzt werden, um die Physiopathogenese von HIV und physikalischen Infektionen und Zirrhose zu untersuchen.
