والهدف العام للبروتوكول هو توليد نموذج الماوس أنسي مع نظام المناعة البشرية وظيفية والكبد باستخدام الخلايا الجذعية الإنسان الدم وموقع الكبد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الفئران الوراثية للكبد أنماء. توفر هذه الطريقة أداة قوية لدراسة الأمراض المناعية الناجمة عن فيروس نقص المناعة البشرية كما لوحظ في الناس.
ومن خلال إظهار العملية، سيكون من قبل يمين صن، المشرف من قسم علم الأمراض وعلم الأحياء الدقيقة، إلى جانب ويمين وانغ ودريد ماكاروف، أخصائي التكنولوجيات البحثي. للبدء، نقل دم الحبل السري التي تم جمعها في أنابيب heparinized إلى خزانة تدفق اللامينار العقيمة. إضافة برنامج تلفزيوني حتى يتم زيادة حجم إلى 35 ملليلتر.
طبقة العينة على رأس وسيط الفصل اللمفاوي والطرد المركزي 400 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 35 دقيقة مع عدم وجود فواصل. المقبل، وإزالة بعناية طبقة البلازما العليا واستخدام ماصة نقل لنقل واجهة معطف بافي الأبيض إلى أنبوب جديد. إعادة تعليق معطف بافي في 30 إلى 40 ملليلتر من الجليد العازلة الباردة.
باستخدام ماصة، والجمع بين 20 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 20 ميكرولترات من 0.4٪ trypan الأزرق. Pipette 10 ميكرولترات من هذا الخليط في الفتحة الخارجية لأي من الغرفتين من شريحة العد، وإدراج الشريحة في عداد خلية الآلي لحساب الخلايا. الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
الطامح بعناية ونضيف 300 ميكرولترات من الجليد العازلة الباردة. إضافة 100 microliters من مستقبلات FC الإنسان عرقلة الكاشف و 100 ميكرولترات من الماوس أحادية النسيلة المضادة للأجسام المضادة CD34 مترافق MicroBeads لمدة تصل إلى 100 مليون خلية. احتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.
إضافة 10 ملليلتر من الجليد العازلة الباردة لغسل الخلايا والطرد المركزي 300 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بعناية فائقة وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من الجليد العازلة الباردة. بعد هذا، ضع عمود LS التحديد الإيجابي في حقل فرز الخلايا المنشط المغناطيسي ومرره باستخدام ثلاثة ملليلترات من عازلة الجليد الباردة.
تحميل العينة في العمود LS التي يمكن أن rap MicroBeads ملزمة إلى الخلايا الإيجابية CD34 الإنسان في العينات، والسماح لها بالتدفق تحت تأثير الجاذبية في أنبوب جمع. غسل العمود ثلاث مرات مع الجليد الباردة العازلة وجمع eluent في نفس أنبوب جمع. ثم، يغرق العمود مع خمسة ملليلتر من الجليد الباردة العازلة لتلميح الخلايا الإيجابية CD34 في أنبوب جمع جديد.
كرر الإجراء لتحقيق نقاء أكثر من 90٪ المقبل، واستخدام صبغة تريبان الزرقاء ومقياس للهيموسيتلت لحساب الخلايا الإيجابية CD34 تملص. بعد العد، الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من الخلايا المتراكبة وإعادة تعليقها في 125 ميكرولترات من PBS لحقن لاستخدامه على الفور في عملية الزرع.
للتحقق من نقاء مسيل مضغوط CD34 الإيجابي ، خذ 50 ميكرولترات من التعليق واحتضانه مع 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة CD34 المضادة للدماء المضادة للدم البشري PE عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني والمضي قدما في تنفيذ عملية استئصال الخلايا المتدفقة. بعد الحصول على البيانات، قم بتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.
أولاً، استرداد وذوبان خلايا الكبد المبردة كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم، إزالة الغطاء الحيوي وصب خلايا الكبد المذابة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على وسيط ذوبان دافئ. صخرة الأنبوب باليد لبضع ثوان لتعليق الخلايا.
بيليه الخلايا في 100 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة ثماني دقائق. غسل الخلايا بيليه في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ BSA وتجمع لهم إما مع HSPCs الطازجة أو المذابة في برنامج تلفزيوني إلى حجم النهائي من 80 ميكرولترات لكل فأرة. أولاً، قم بتوصيل نهاية واحدة من أنبوب تمديد معقمة بإبرة قياس 30 وأخرى في حقنة مليلتر.
ملء حقنة مع تعليق من الـ HEPs المجمعة وHSPCs. تناسب الحقنة في الشق من ماصة الاستغناء المتكررة وضبط موزع لصرف 10 ميكرولترات في كل الصحافة. حلق كل فأر كما هو مبين في بروتوكول النص وفرك الجانب الأيسر من الجسم من كل فأر مع 10٪ povidone اليود يتبع 70٪ الكحول isopropyl.
باستخدام مقص نوع فاناس ، قم بعمل شق صغير في الجلد والعضلات والصوانيم على يسار الجدار البريتوني للدخول إلى تجويف الصفاق حوالي 5 ملليمترات تحت الحافة السفلية للقفص الصدري. حدد موقع الطحال واستخدم ملقط لسحبه قليلاً إلى منطقة التشغيل لسهولة الوصول إليه وأدخل إبرة القياس 30 في القطب السفلي من الطحال. بعد ذلك، قم بفتح المكبس من الماصات الاستغناء والاستغناء 10 ميكرولترات من حجم في وقت، مع حد من 60 إلى 80 ميكرولترات لكل طحال.
اسحب الإبرة ببطء وقّع الطحال بمقاطع الربط باستخدام جهاز ربط. ثم، استخدام قطن يميل تطبيقية تربيت مع برنامج تلفزيوني عقيم لدفع الطحال مرة أخرى إلى تجويف الجسم. استخدم نمط خياطة متقطع لإغلاق طبقة العضلات من جدار البطن.
إنجاز إغلاق الجلد مع نمط خياطة توقف باستخدام الغرز غير امتصاص. نقل جميع المواد اللازمة إلى مرفق معين للسلامة البيولوجية من المستوى الثاني زائد. ارتداء معدات الحماية الشخصية بما في ذلك غطاء المتاح جميع ثوب، أغطية الأحذية، قناع الوجه والقفازات المزدوجة، بما في ذلك قطع قفازات مقاومة، في جميع الأوقات أثناء العمل مع الفيروس.
الفئران اختيار مع إعادة تشكيل أكثر من 15٪ من الخلايا الإيجابية CD45 الإنسان ومع وجود الزلال البشرية في المصل للعدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1. حقن intraperitoneally الفئران مع 1,000 إلى 10,000 الأنسجة زراعة الجرعات المعدية من 50 فيروس نقص المناعة البشرية-1 ADA في حجم 100 إلى 200 ميكرولترات لكل فأر. بعد القتل الرحيم الفئران، استئصال الكبد من كل فأرة كما هو مبين في بروتوكول النص.
جمع وإصلاح الكبد في 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها. إنشاء نموذج الماوس مزدوجة أنسهانة مع الكبد البشري والخلايا المناعية يمكن رصدها بسهولة في كل خطوة مع اليزا بسيطة جدا وتدفق cytometry، على التوالي. يتم إجراء قياس تدفق الخلايا بانتظام لتقييم تطور جهاز المناعة الوظيفية ونرى تأثير عدوى فيروس نقص المناعة البشرية على الخلايا المناعية.
في الفئران المزدوجة الأنسانية ، يمكن أن يتراوح نمو الخلايا المناعية الوظيفية من 15 إلى 90٪ من بوابة الخلايا الليمفاوية. لتقييم engraftment من الكبدات البشرية، يتم تنفيذ ELIZA لمستويات الزلال الخاصة بالبشر شهريا على مصل الماوس. تظهر الفئران المُنقّعة مع كل من HSPCs وHPS مستويات الألبومين الخاصة بالبشر التي تتراوح بين حوالي سبعة ميكروغرام لكل ملليلتر إلى 377 ميكروغرامًا لكل ملليلتر في شهر واحد ، ويستمر النمو على مدى وقت الملاحظة.
يتم رصد تأثير العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية على الخلايا المناعية البشرية في دم الفئران المزدوجة ذات الطابع الإنساني من خلال عملية استئصال الخلايا المتدفقة وعلى الـ HEPs في الكبد بواسطة الألبومين الخاص بالبشر ELIZA. بحلول خمسة أسابيع، يسبب فيروس نقص المناعة البشرية-1 انخفاضًا في مستويات الزلال البشري في المصل، وهناك استنفاد لل الكبدات الإيجابية CK18 البشرية في أقسام الكبد للفئران ذات الأنسانة المزدوجة. وعادة ما لوحظ انخفاض نسبة CD4 إلى CD8 في الدم والكبد من الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، مقارنة بالمستويات التي لوحظت في نفس الماوس قبل الإصابة.
يجب أن تكون طبقات الدم بعناية على رأس وسيط الفصل اللمفاوية لعزل معطف بافي. لإجراء الجراحة، أمسك الطحال برفق وأدخل الإبرة في القطب السفلي من الطحال. بعد عزل الخلايا الجذعية الدموية، من المهم التحقق من نقاء الخلايا الجذعية المكوّنة لدم الدم CD34 لتجنب الخلايا الإيجابية CD3 والحقن الحادة من الكبد من متبرع مختلف.
كما تظهر الفئران أنسولوجيا الجانب الفسيولوجي من جهاز المناعة البشري والكبد، يمكن استخدام الفئران المتقدمة لدراسة فيزيوباتوجينسيس فيروس نقص المناعة البشرية والالتهابات الجسدية وتليف الكبد.
