Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie über die Mechanismen der Autoimmunität, Immunschwäche, zentrale Toleranz und Thymus-Involution zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie in vivo Längsaufzeichnung von VorläuferRekrutierung und reife T-Zell-Egression in vaskularisierten und transplantierten Maus-Thymus-Segmenten ermöglicht. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Entwicklung und Funktion des Thymus geben kann, kann auch auf andere Gewebe wie Pankreasinseln oder Nierenglomeruli angewendet werden.
Um den Thymus zu isolieren, legen Sie die Maus auf sterile saugfähige Papierhandtücher in der dorsalen aufrechten Position in einer laminaren Durchflusshaube und sprühen und wischen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol ab. Machen Sie einen oberflächlichen V-förmigen Schnitt im Unterbauch, um die Brusthöhle freizulegen, und verwenden Sie ein Paar gerade 10-Zentimeter-Sezieren der Schere, um einen 0,5 bis 1 Zentimeter großen Schnitt in der Brust entlang der ventralen Mittellinie zu machen. Falten Sie die Haut über jede Seite der Brust, um die Brusthöhle freizulegen, und machen Sie zwei zusätzliche tiefere 0,5 bis ein Zentimeter seitliche Einschnitte durch das Zwerchfell und den Rippenkäfig, um auf das überlegene Mediastinum in der vorderen Brusthöhle zuzugreifen.
Der Thymus sollte als zwei blasse Lappen direkt über dem Herzen erscheinen. Legen Sie gekrümmte Kraftspitzen unter den Thymus und ziehen Sie vertikal, um das komplette Organ zu extrahieren, wodurch das Faltenrücken des Brustkorbs mit einem Paar gerader Zange verhindert wird. Dann tauchen Sie den isolierten Thymus in eine sterile 60-Milliliter-Schale mit kaltem sterilem PBS auf Eis und schneiden Sie den Bindegang, um die Thymianlappen zu trennen, mit einem Skalpell.
Vor der Transplantation jede Empfängermaus markieren und wiegen und das erste Tier in eine seitliche Liegeposition mit einem Auge legen, das direkt der Linse eines Sezierendes Mikroskops ausgesetzt ist. Mit der Vannas-Schere, verbrauchen Sie einen der isolierten thymischen Lappen bis zu einem Millimeter in der Breite nach einem Zickzack-Muster, um sicherzustellen, dass jedes Segment enthält einige thymische Kortex und Medulla Gewebe. Es ist wichtig, den Thymus direkt vor der Implantation zu trimmen, da große Stücke nicht richtig eingraviert werden können.
Als nächstes, beginnend an der Basis der Hornhaut des Operationsbereichs, verwenden Sie die Spitze einer 40-Millimeter 18-Spur-Nadel, um einen kleinen Schnitt in externe Hornhautschichten zu machen, so dass die Spitze einer Sezierenderin eingeführt werden kann. Verwenden Sie die Schere, um einen Fünf- bis 10-Millimeter-Flankenschnitt direkt um die Basis der Hornhaut zu machen, während Sie flache Zangen verwenden, um die Hornhaut fest offen zu halten, um eine Erneutversiegelung zu verhindern. Das geschnittene Hornhautepithel mit den flach endenen Zangen greifen, die Öffnung in der Hornhaut beibehalten, während sie ein thymisches Segment durch die Öffnung einfügen.
Es ist wichtig, das Thymusstück schnell durch die Hornhautöffnung einzufügen, um eine spontane Wiederversiegelung vor dem Einleiten des Gewebes zu verhindern. Achten Sie darauf, die Gewebeintegrität in diesem Schritt zu bewahren. Drücken Sie sanft auf die Augenoberfläche, um das eingeführte Gewebesegment in eine seitliche Position in Bezug auf die Pupille zu schieben, um die Funktion des Auges zu erhalten.
Und verwenden Sie flache Zangen, um beide Seiten der Hornhautöffnung drei bis fünf Sekunden lang fest gegeneinander zu drücken, um die Selbstversiegelung zu fördern. Wenn die Transplantation an beiden Augen durchgeführt werden soll, drehen Sie die Maus auf die gegenüberliegende Seitenseite für eine zweite Implantation, wie gerade gezeigt. Wenn die Operation abgeschlossen ist, kehren Sie die Maus in einen leeren Käfig zurück, der mit einer Wärmelampe mit Überwachung bis zur vollständigen Reemumbency vorgewärmt ist.
Platzieren Sie zum entsprechenden versuchsmäßigen Zeitpunkt eine anästhesierte Empfängermaus auf einer mikroskopischen Plattform mit fester Bühne in einer seitlichen Liegeposition auf einem Heatpad mit einem Auge nach oben. Und setzen Sie den Kopf der Maus in einen stereotaxic Kopfhalter. Stellen Sie den Knopf ein, um den Mauskopf in der seitlichen Seitenposition zurückzuhalten, um den direkten Zugang des Mikroskopobjektivs zum Auge zu ermöglichen, das das Thymustransplantat hält, und ziehen Sie die Augenlider zurück, während Sie das Auge am Hornhautrand mit einem Paar Pinzettspitzen halten, die von einem Polyethylenrohr bedeckt sind, das an einem festen Gelenk gelenk UST-2 befestigt ist.
Fügen Sie ein paar Tropfen steriler Saline oder künstlicher Risse zwischen der Hornhaut und der Linse hinzu, bevor Sie das 5X-Mikroskopobjektiv auf das Mausauge legen und den Thymus im Mikroskopfeld lokalisieren. Wechseln Sie dann zu einem höher auflösenden Wassertauch-Tauchziel mit einem langen Arbeitsabstand und wählen Sie den Erfassungsmodus in der Mikroskopsoftware aus. Starten Sie den Resonanzscanner-Modus und wählen Sie den XYZT-Bildmodus aus.
Schalten Sie den Argonlaser ein und stellen Sie die Leistung für die Fluoreszenzerregung auf 30 % ein. Wählen Sie eine geeignete Anregungslaserlinie aus und stellen Sie die akusto-optische Strahlteilersteuerung für die entsprechenden Emissionswellenlängen ein, indem Sie gleichzeitig Reflexionserkennung verwenden, um Rückstreuung zu erkennen und die Gewebestruktur abzuschrägen. Sammeln Sie die Emission bei der gewählten Wellenlänge und legen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln fest.
Klicken Sie dann auf live, um die Bildgebung zu starten, und passen Sie die Verstärkungsstufen bei Bedarf an. Konzentrieren Sie sich auf die Oberseite des Thymianimplantats und wählen Sie beginnen, den Anfang des Z-Stacks zu definieren. Konzentrieren Sie sich dann auf die letzte Ebene im implantierten Thymus, die visualisiert werden kann, und wählen Sie Ende aus, um das Ende des Z-Stacks mit einer Z-Schrittgröße von fünf Mikrometern zu definieren.
Legen Sie das Zeitintervall für die Erfassung jedes Z-Stacks für 1,5 bis zwei Sekunden fest, und wählen Sie die Option Acquire-until-Stopped für die kontinuierliche Bildgebung aus. Klicken Sie dann auf Starten, um die Aufzeichnung zu initialisieren. Hier werden Hellfeld- und Fluoreszenzbilder aus dem gleichen Bereich des Thymusimplantats gezeigt, die für eine doppelte makroskopische Nachbeobachtung von Gewebewachstum und Involution- und Fortsetzungsstudien dienen können.
Das Hellfeldbild erleichtert auch die Visualisierung der Vaskularisation des implantierten Gewebes und ermöglicht die einzigartige Untersuchung der Abhängigkeit der Thymusphysiologie von der Blutversorgung im Laufe der Zeit. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung der Zelltransmigration aus dem Blutstrom in den implantierten Thymus, die Verfolgung der Kontakte zwischen GFP-positiven Vorläuferzellen, die in das Thymianimplantat mit RFP-markierten ansässigen Thythel- und Stromalzellen während differenzierungs- und Selektionsprozessen eindringen, sowie die Überwachung der egressiven Immunzellen aus dem Thymusmus in periphere Blutgefäße. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gewebeexposition für eine optimale Engraftmentierung zu minimieren und auch die Schnittgröße im Auge zu begrenzen, um eine unversehrte Fragmentexzision durch die Hornhaut zu ermöglichen und gleichzeitig die Fibrose während der Heilung zu reduzieren.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie lokalisierte Kontrollbehandlungen und das Einschnitten anderer Gewebe in das kontralaterale Auge durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über Immunfunktionsstörungen im Zusammenhang mit Infektionen, Involution-Determinanten und Transplantationstoleranzmechanismen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Entwicklung von T-Zellen zu erforschen, einschließlich Derrekrutierung von Vorläufern, Thymus-Augen-Dynamik und reifen T-Zell-Egressionsschritten in vivo.
