Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant RO1 AI067979 NWA unterstützt. YK ist Bachelor Fellow der Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland, College Park.

Alle experimentelle Verfahren wurden von den National Institutes of Health im Einklang mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der University of Maryland IACUC angenommen wurden. Alle Schritte in den Abschnitten 1 bis 4 beschriebenen werden aseptisch in biologischen Laminar-Flow Schränken durchgeführt. Persönliche Schutzausrüstung sollte verwendet werden, und Vorsicht bei der Handhabung der live Leishmania -Parasiten in allen Phasen des Experimentierens.
1. Isolierung und Differenzierung von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs)8,30,31
<ol><li>
Tag 0: 4 - 6 Wochen alten weiblichen C57BL/6 oder BALB/c Maus in einer CO-2 -Kammer zu Opfern und Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen. Sterilisation von Scheren und Pinzetten zu gewährleisten, indem man sie in 70 % igem Ethanol getränkt. Sprühen Sie Handschuhe mit 70 % Ethanol um sterile Handhabung während des Knochenmark Zelle isoliert Prozesses zu ermöglichen.</li>
	<li>Geopferten Maus Dissektion Board durch seine Vorderbeine festhalten zu sichern und durch Sprühen reichlich mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit einer Schere in der Nähe des Hüftgelenks. Legen Sie die Schere unter der Haut an die darunter liegenden Muskeln zu trennen und schneiden Sie die Haut rund um das Hüftgelenk. Hinweis: Die Dissektion Board kann gedreht werden, um besseren Zugang zum Hüftgelenk zu ermöglichen.</li>
	<li>Sorgfältig deglove Haut vom Bein durch ziehen in Richtung Knöchel und entfernen. Am Knöchel, sehr vorsichtig zu schneiden bei oder unterhalb des Knöchels gemeinsame Tibia völlig intakt verlassen geschnitten Sie den Fuß ab. Hinweis: Die Fibula in diesem Stadium ist locker befestigt und mit der Zange leicht getrennt werden kann.</li>
	<li>Suchen Sie manuell das Hüftgelenk durch die Manipulation der Oberschenkelknochen um den Punkt der Rotation zu identifizieren. Vorsichtig mit einer Schere durchtrennen das Bein oberhalb des Hüftgelenks, die proximalen Kopf des Oberschenkelknochens intakt verlassen.</li>
	<li>Entfernen Sie so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich aus dem Bein mit einer Schere. Entfernen Sie jede verbliebene Haut aus den Knöchel und jede überschüssige Knochenmaterial oberhalb des Hüftgelenks.</li>
	<li>Legen Sie die gereinigten Beinknochen in sterilen RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) in einer Petrischale auf Eis.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6, Tibia und Femur aus dem anderen Hinterbein zu isolieren.</li>
	<li>Entfernen Sie alle verbleibenden Muskel und Bindegewebe aus den Knochen einweichen in RPMI sterilisierte Pinzette mit sterilen #10 Klinge.</li>
	<li>Stellen Sie Knochen auf der Petrischale Deckel. Schneiden Sie die Tibia vorsichtig mit der Klinge unmittelbar oberhalb des Sprunggelenks auf das Knochenmark. Entfernen Sie die Tibia vom Rest des Beines durch Schneiden direkt unterhalb des Kniegelenks.</li>
	<li>Ziehen Sie 10 mL sterile RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) in einen 10-mL-Spritze und befestigen Sie eine 25G Nadel.</li>
	<li>Festhalten der Tibia mit Zangen, vertikal über eine 50 mL konische Röhrchen auf dem Eis. Verwenden Sie die Spritze ca. 5 mL RPMI sanft in das Ende des Knochens, das Knochenmark aus dem anderen Ende in das konische Rohr zu spülen zu injizieren. Spülen Sie das Knochenmark mit insgesamt 10 mL RPMI, bis die Knochen weiß wird. Hinweis: Nach dem gründlichen spülen, sollte der Knochen weißen schalten. Wenn dies nicht der Fall ist, weiter spülen um Knochenmark zu entfernen. Das distale Ende des Schienbeins müssen wieder mit der Klinge gekürzt werden, wenn es zu eng, um die Nadel eingesetzt wird.</li>
	<li>Schneiden Sie das Femur sofort über das Kniegelenk und sofort unter das Hüftgelenk, beide Enden des Knochens auf das Knochenmark verfügbar zu machen. Spülen Sie Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen mit insgesamt 10 mL RPMI in der gleichen Weise wie der Tibia.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Reinigung und Spülung Schritte 1.6 durch 1.13 mit den verbleibenden Knochen und sammeln Knochenmark gespült Zellen in einem einzigen 50 mL konische Röhrchen Hinweis: Bricht ein Knochen zu jedem Zeitpunkt während der Präparation vor Knochen Spülung, verwenden Sie nicht das Knochenmark aus dieser Knochen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Rohr zur Erhebung des Knochenmarks gespült aus allen vier Knochen für 10 min bei 4 ° C bei 300 X g.</li>
	<li>60 mL steriles BMM Medium zu platzieren (RPMI mit einer Endkonzentration von 20 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1,2 mM Na-Pyruvat, 25 µg/mL menschlichen M-CSF) in eine 175 cm2 Zelle Kultur Flasche mit Filterkappe.</li>
	<li>Verwerfen Sie der Überstand folgende Zentrifugation und aufzuwirbeln Sie Zelle Pellet durch sanfte auf und ab pipettieren mit 5 mL Medium BMM aus der Flasche.</li>
	<li>Übertragen Sie Zellsuspension auf den Kultur-Kolben und spülen Sie das konische Rohr zweimal mit BMM Medium aus der Kultur-Flasche um maximale Zelle Erholung zu gewährleisten. Sicherzustellen Sie, dass die Zellsuspension in Medium gut durchmischt ist und verteilen Sie 30 mL aus der ersten 175 cm2 Zelle Kultur Flasche auf eine zweite 175 cm2 Zelle Kultur Flasche mit Filterkappe zu.</li>
	<li>Inkubieren Sie beide Fläschchen mit 30 mL Zellsuspension jede Übernachtung bei 37 ° C, 5 % CO2 Trennung von jedem kontaminierenden Fibroblasten, resident Makrophagen und andere adhärenten Zellen ermöglichen.</li>
	<li>
Tag 1: Übertragen des Überstands mit undifferenzierten Knochenmarkzellen von Flaschen zu 100 x 15 mm TC-unbehandelte Polystyrol Petrischalen bei ca. 10 mL/Teller und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2. Entsorgen Sie die Fläschchen.</li>
	<li>
Tag 3 oder 4: Jede Petrischale eine zusätzliche 5 mL BMM Medium (37 ° c vorgewärmt) hinzufügen und weiter Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
</ol>(2) Beschichtung BMMs auf Deckgläsern für Infektion (Tag 7 oder 8)
<ol><li>Bereiten Sie 6-Well-Zellkultur-Platten durch Platzieren von vier 4 steril 12 mm Glasdeckgläser (autoklaviert und gespeichert in einem geschlossenen Glasbehälter) im unteren Teil jeder leer gut vor. Hinweis: Holen Sie jede sterile 12 mm Deckglas mit Absaugnadeln Spitze ausgestattet, um eine Vakuumleitung ab. Platzieren Sie Deckgläsern in die Vertiefungen ohne Überlappung, Freigabe an der gewünschten Position durch Kneifen das Rohr um Vakuum zu unterbrechen.</li>
	<li>Aspirat Medien (und nicht-anhaftende Zellen) von Petrischalen beschichtet mit anhaftenden Knochenmark abgeleitet Makrophagen und sanft spülen adhärenten Zellen 2 X mit sterilen Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium Chlorid (PBS- / -) vorgewärmt auf 37 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie tropfenweise, 5 mL sterilen 1 x PBS- / - mit einer Endkonzentration von 1 mM EDTA zu jeder Petrischale und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C, anhaftende BMMs. überprüfen zu lösen, dass die Zellen unter dem Mikroskop getrennt sind.</li>
	<li>Sammeln Sie alle freistehende Zellen in 1 X PBS- / - ergänzt mit 1 mM EDTA in einem 50 mL konische Rohr aufgehängt. Spülen Sie jedes Gericht 2 X mit 5 mL PBS- / - und Zelle Aussetzung Pool hinzufügen. Hinweis: Zellsuspension kann verdünnt werden, mit zusätzlichen PBS- / -, Makrophagen aus EDTA Toxizität während die Einziehung von Forderungen zu schützen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Makrophagen in 5-10 mL BMM Medium durch pipettieren. Ort Nukleinsäuretablette Zellen auf Eis, Befestigung an Rohren und verklumpen zu verhindern.</li>
	<li>Anzahl der lebensfähige Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung in der Hemocytometer. Hinweis: Um BMM Zellen in 5 mL Medium Nukleinsäuretablette zählen, kann eine Verdünnung-Mischung aus 25 µL Zellsuspension in 445 µL PBS- /- und 30 µL 0,4 % Trypan blau Lösung in der Regel leicht Quantifizierung in eine Hemocytometer (unter Berücksichtigung einer 20 X Verdünnungsfaktor für die endgültige Berechnung ). Zählen Sie nur Zellen, die nicht mit Trypan blau (lebensfähige Zellen) gefärbt bekommen. Das Volumen der Zellsuspension kann geändert werden, wenn diese Mischung zu konzentriert oder verdünnt ist. Der Ertrag der BMM pro Vorbereitung unterschiedlich in der Regel 2 x 107 und 5 x 107 Zellen aus einem einzigen Mausklick.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellsuspension in BMM Medium in gewünschte Beschichtung Konzentration (5 x 105/mL) und zerstreuen Sie Aussetzung zu 6-well-Platten in 2 mL Medium pro Bohrloch zu, so dass jeder gut 1 x 106 Makrophagen erhält. Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, die jeden gut bekommt sorgt für die ausreichende Anzahl von Makrophagen zu die Deckgläsern gleichmäßig bedecken. Überprüfen Sie, dass Deckgläsern in Brunnen sind nicht überlappende oder schwimmend in das Medium. Wenn ja, einstellen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze.</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
</ol>3. Reinigung von infektiösen Formen von L. amazonensis
Hinweis: Bereiten Sie Leishmaniose für Infektionen - von stationären Promastigote Kulturen8,13metacyclic Promastigotes reinigen, oder Promastigotes in der Kultur in Amastigote Form mit standard L. Amazonensis zu unterscheiden axenic Differenzierung Protokoll6,8.
<ol><li>
Reinigung von Leishmania metacyclic Promastigotes mittels Dichte gradient media(Materials) 33<ol>
<li>Bereiten Sie 40 % Stammlösung Dichte Gradienten Medien in sterilen, Endotoxin-freies Wasser.</li>
		<li>Verdünnen Sie Dichte Gradienten Lösung in 10 x M199 Medium (ohne Serum) um 10 % Konzentration im Medium M199 vorzubereiten.</li>
		<li>Filtern Sie alle Lösungen durch 0,22 µm-Filter. Hinweis: Lager-Lösungen können bei 4 oC in der Dunkelheit nicht länger als 1 Monat aufbewahrt werden.</li>
		<li>Im unteren Teil eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen 2 mL 40 % Dichte-Gradienten Media-Lösung zugeben.</li>
		<li>Schicht 2 mL 10 % ige Dichte Gradienten Medienlösung in M199 auf die 40 % ige Dichte Gradienten Medienschicht vorsichtig mit einer Pasteurpipette um zu vermeiden, eine Vermischung zwischen den beiden Schichten.</li>
		<li>Sammeln Sie 1 x 109 Parasiten aus der stationären Phase Kultur durch Zentrifugation bei 1.900 x g für 10 min.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 6 mL Dulbecco geändert wesentliches Medium (DMEM).</li>
		<li>Schicht 2 mL Zellsuspension direkt auf die 10 %-Dichte, die Gradienten Medien mit einer Pasteurpipette um zu vermeiden, mischen zwischen Schichten überlagern, sanft.</li>
		<li>Zentrifugieren des Farbverlaufs für 10 min bei 1.300 x g bei Raumtemperatur. Hinweis: Aufgrund der Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften zwischen Leishmania -Arten, Zentrifugation Bedingungen für jede möglicherweise leicht angepasst werden, um maximalen Ertrag zu gewährleisten.</li>
		<li>Parasiten (angereichert in metacyclic Promastigote Form) aus der Band, die an der oberen 10 % Dichte Gradienten Medien Grenze (Schnittstelle zwischen 0 % und 10 % Dichte Gradienten Medien Schichten) zu sammeln.</li>
		<li>Verdünnen Sie Parasiten mit einem Volumen von DMEM und sammeln durch Zentrifugieren (1.900 x g für 10 min bei Raumtemperatur).</li>
		<li>In 500 µL DMEM Medium Aufschwemmen und zählen in einer Hemocytometer, Ertrag zu quantifizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generation von L. Amazonensis Amastigoten unter axenic Kulturbedingungen (niedriger pH-Wert / Temperatur erhöht)6,8,13<ol>
<li>Mix 5 mL der Log-Phase Promastigote Kultur (pH 7.4 bei 26 oC) mit einem gleichen Volumen Amastigote Medium (pH 4,5), mit 25 cm2 Fläschchen (insgesamt 10 mL Medium) und über Nacht bei 26 ° C inkubieren.</li>
		<li>Verlagerung des Kolbens von 26 ° C bis 32 ° C.</li>
		<li>Nach 3 oder 4 Tage geteilt Kultur 1:5 in Amastigote Medien bei 32 ° C.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Parasiten in den nächsten 3-4 Tagen (max. 7 Tage) zu sehen, ob sie bereit für den Einsatz bei Infektionen sind. Hinweis: Gesunde axenic Amastigoten haben eine ovale Form, ohne sichtbare Flagellen. Teilweise differenzierte Amastigoten haben eine große ovale Form mit kurzen Flagellen. Die Kultur sollte nicht viel Klumpen - viele Klumpen sind ein Hinweis auf nicht-wachsen, sterben Parasiten. Die Amastigote Kultur kann split 1:5 und für maximal 3 Wochen gewartet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Infektion mit L. amazonensis
<ol><li>Verdünnen Sie Parasiten Suspensionen nach gewünschten MOI (in der Regel 3-5 metacyclic Promastigotes pro Makrophagen [MOI von 1:3 oder 1:5]) und 1 Amastigote pro Makrophagen [MOI 1:1]. Fügen Sie Leishmaniose in PBS- / - in einem Volumen von 50-100 µL in jede Vertiefung bereits mit 2 mL Medium.</li>
	<li>1 h mit Amastigoten und 3 h mit metacyclic Promastigotes bei 34 oC für Infektion BMMs inkubieren. Hinweis: Optimale Infektion Temperatur variiert je nach Spezies.</li>
	<li>Nach Inkubation, gründlich abwaschen kostenlose Parasiten in jedem gut 3 X mit 2 mL PBS- / - auf 37 ° c vorgewärmt Hinweis: Zerstreuen Sie PBS vorsichtig, um sicherzustellen, dass Deckgläsern nicht über einander zu schweben. Die Platte vorsichtig schwenken und dann die Flüssigkeit abzusaugen. Verwenden Sie separate Absaugnadeln Tipp, wenn mehrere Stämme von Parasiten zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</li>
	<li>Fix 1 h oder 3 h Zeit-Punkt Proben durch Inkubation jeweils gut mit 1,5-2 mL 2 % PFA in PBS- / - für 10 min. 3 X mit PBS- / - waschen. Nicht aspirieren Sie letzten Waschen und kühlen Sie Platten mit Deckgläsern mit PBS-Puffer bis zu beflecken.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL frisches BMM Medium in jede Vertiefung auf Tellern für weitere Zeitpunkte und inkubieren Sie bei 34 ° C.</li>
	<li>Verbleibenden Zeit-Punkte wie gewünscht wie unter Punkt 4.3 beschrieben, und kühlen Platten bis Färbung zu beheben.</li>
</ol>5. DAPI-Färbung und Deckglas Montage
<ol><li>Aspirieren Sie PBS aus Brunnen mit Deckgläsern und 1,5 mL PBS- / - mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel. 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 X waschen mit 2 mL PBS- / - inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS- / - mit 2 µg/mL DAPI (von 5 mg/mL Stammlösung in Wasser verdünnt) in Brunnen mit Deckgläsern und ein weiteres 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Die Inkubationszeit mit DAPI ist wichtig für die Visualisierung von intrazellulären Leishmania -Parasiten. Makrophagen Kerne Flecken schnell, aufgrund ihrer größeren Größe und DNA-Inhalt aber Färbung der Kerne der intrazellulären Parasiten ist langsamer. So ist es notwendig, DAPI, durch zu durchdringen und der Parasit Plasmamembran und die Kernmembran Parasit ermöglichen, Verlängerung Inkubationszeit über was erforderlich ist, um die BMM-Kerne zu visualisieren. Mit richtigen DAPI-Färbung kann auch die mitochondriale Kinetoplast DNA in der Nähe der flagellar Tasche des Parasiten visualisiert werden, zusätzlich zu den Kern-DNA.</li>
	<li>Waschen mit jeweils gut Deckgläsern 3 X mit 2 mL PBS- / - und dann Aufzug und Flip Deckgläsern mit Pinzette die Zelle Seite nach unten aufgelegt und auf Glas Mikroskop gleitet mit einem handelsüblichen antifade Montage-Reagenz. Hinweis: Deckgläsern äußerst fragil und vorsichtige Handhabung benötigen. Vermeiden Sie Druck auf sie, vor allem gegen die Seitenwand der Brunnen beim Anheben. Ein paar Tropfen PBS- / - reduziert die Oberflächenspannung zwischen Deckglas und gut und erleichtert das anheben. Eine feine Nadel kann verwendet werden, um bei der neugierigen Deckgläsern von der Unterseite des Brunnens. Drücken Sie nach einem Deckgläschen Auflegen der Folie sanft mit der Pinzette um eventuelle Luftblasen in den Montage-Medien verdrängen. Wenn ein Deckglas defekt ist oder hat möglicherweise während des Hebevorgangs umgedreht, montieren Sie nicht; Nutzen Sie einfach die freie vierte Deckglas.</li>
	<li>Kühlen Sie Folien bis Quantifizierung.</li>
</ol>(6) Infektion Quantifizierung
<ol><li>Durch die Fokussierung auf Makrophagen mit 100 X Objektiv mit Immersionsöl DAPI-gefärbten Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen (Erregung bei 358 nm; optimale Emission bei 461 nm). Sicherstellen Sie, dass auf der Ebene von Makrophagen zwischen Objektträger und Deckglas konzentriert.</li>
	<li>Quantifizieren der Anzahl von Makrophagen (große Kerne mit DAPI gefärbt) und die Anzahl der kleineren Amastigote Kerne rund um jedes Makrophagen Kern (siehe Abb. 2ADAPI) für jedes Sichtfeld mittels manuellen Zähler. Hinweis: Amastigote Kerne können nicht alle in einer Ebene der Fokus aufgrund ihrer geringen Größe sichtbar. Zählen Sie jene, die sichtbar, wenn auf Makrophagen Zellkerne gerichtet sind, und verwenden Sie dann Feinfokus für Parasiten Kerne in Ebenen oberhalb und unterhalb der Makrophagen Kerne zu überprüfen.</li>
	<li>Umzug nach ein anderes Sichtfeld zu Quantifizierung zu wiederholen. Verwenden Sie einen separaten Schalter Schlüssel, um die Anzahl der Felder gezählt zu verfolgen. Bewegen sich durch visuelle Felder in parallelen Reihen über jedes Deckglas zu verhindern, dass Überschneidungen zu zählen.</li>
	<li>Ein Minimum von 200 Makrophagen pro Deckglas zu quantifizieren. Jedem Zeitpunkt der Infektion in dreifacher Ausfertigung (3 Deckgläsern) zu quantifizieren. Die vierte Deckglas zu zählen, wenn die vorherige nicht geeignet für die Zählung durch Deckglas Überlappung, schlechte Montage, Glasbruch, etc. gehört Hinweis: Wenn 200 Makrophagen können nicht auf jeden ein Deckglas gezählt werden, zählen Sie das Reserverad Vierter.</li>
	<li>Infektionsraten als Amastigoten/Makrophagen oder Amastigoten/100 Makrophagen zu berechnen und Prozent infizierten Makrophagen aus den rohen Quantifizierung Daten zu bestimmen.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben,

Die quantitative Daten von der BMM Infektion Test oben beschrieben, ermöglicht Ermittler Infektionsraten und eine zuverlässige Bestimmung der Veränderungen der Virulenzeigenschaften in einem relativ kürzeren Zeitraum (maximal 2 Wochen, im Vergleich zu den 2 zu erhalten Monate für in Vivo Experimente erforderlich). Diese Methode beruht auf der DNA-spezifischen Farbstoff DAPI, speziell Flecken Makrophagen und Parasiten Kernen und ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung der infizierten Zellen....

Leishmaniose bezieht sich auf ein breites Spektrum von menschlichen Krankheiten, die durch einzelliger Parasit Arten der Gattung Leishmaniaverursacht. Etwa 12 Millionen Menschen sind derzeit mit Leishmanien weltweit infiziert, und mehr als 350 Millionen sind gefährdet. Die Pathologie der Krankheit hängt von Leishmania -Arten und Host Faktoren und Symptome variieren von harmlosen selbstheilende Hautläsionen zu tödlichen visceralizing Formen. Wenn unbehandelt, viszerale Leishmaniose tödlich ist, Ranking erst nach Malaria als die tödlichsten Krankheiten verursacht durch eine Infektion mit ein einzelliger Parasit-1. Trotz der vielfältigen Unterschiede in Krankheit Pathologie und Symptome haben alle Leishmania -Arten einen Digene Lebenszyklus Promastigote und Amastigote Phasen innen Insekten und Wirbeltiere Gastgeber jeweils abwechselnd. Innen Wirbeltiere, Leishmaniose Ziel Host Makrophagen für Invasion und induzieren die Bildung von Parasitophorous Vakuolen (PVs), saure Kompartimente mit Eigenschaften von Phagolysosomes wo die hoch virulenten Amastigote Formen replizieren. Amastigoten bestehen in Host Gewebe bei chronischen Infektionen und können weitergegeben werden vorwärts, nicht infizierten Sandmücken, Abschluss des Getriebe-Zyklus. Daher sind im Kontext der Entwicklung der menschlichen Krankheit, Amastigoten die wichtigsten Leishmaniose Lifecycle Form2. Untersuchen, wie die Amastigoten innen Makrophagen PVs repliziert ist von entscheidender Bedeutung für Verständnis Leishmaniose Virulenz3,4,5,6,7 und die Entwicklung neuartiger wirksame Therapien.
Wir beschreiben hier eine Methode, die regelmäßig von unserem Labor verwendet, um studieren Leishmaniose Infektion und Replikation im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs), die quantitative Bewertung der Anzahl der intrazellulären Leishmaniose im Laufe der Zeit beinhaltet. Der Prozess umfasst das Ernten von Monozyten aus Maus Knochenmark und Differenzierung zu Makrophagen in der Kultur, in-vitro- Infektion mit infektiösen Formen (metacyclic Promastigotes oder Amastigoten) von Leishmaniose und Quantifizierung der Anzahl der intrazellulären Parasiten an alle 24 h-Intervall für einen Zeitraum von 72-96 h nach Infektion. Dieser Test wurde in unserem Labor verwendet, um ermitteln die Auswirkungen von mehreren Umweltfaktoren und Parasiten Gene, einschließlich Ermittlung der kritischen Rolle des Eisens bei der Förderung von L. Amazonensis Virulenz, die weiter von Straßenräuber validiert wurde Läsion Entwicklungsstudien in Mäusen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle Pathogene Leishmania -Arten ihre replikativen Nische innen Makrophagen Host herstellen, kann dieser Assay universell für Virulenz Bestimmungen in allen Leishmania -Arten verwendet werden.
Durchführung von BMM Infektionen ermöglicht Analyse der Wirt-Parasit-Interaktionen auf der Ebene der einzelnen Zelle und damit eine umfassendere Verständnis der Interaktion von Leishmania -Parasiten und ihre bevorzugten Host Mikroumgebung, PVs von Makrophagen. Makrophagen-Infektion-Assays sind durch mehrere Gruppen16,17,18,19,20,21,22 erfolgreich benutzt worden, um zu erkunden Funktionen der Host Makrophagen und Leishmaniose spezifischer Gene, und ihre mögliche Einbindung in das komplexe Zusammenspiel, das intrazelluläre Infektion charakterisiert. BMM Infektionen erlauben Quantifizierung der Parasit Wachstum als eine Auslesung der Auswirkungen der Host Faktoren, die intrazelluläre überleben, wie mikrobizider Stickoxid-Produktion, Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und andere nachteiligen Bedingungen beeinflussen im Inneren der Lysosomen-wie PVs23begegnet. Makrophagen Infektion Assays wurden auch genutzt, um Anti-Leishmanial Droge Interessenten für therapeutische Entwicklung13,24zu identifizieren.
Die in-vitro- Natur BMM Infektionen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Leishmaniose Virulenz zu beurteilen. Jedoch mehrere frühere Studien, die Mechanismen der intrazellulären Parasiten überleben im Laufe der Zeit nicht quantifizieren Infektion als ein Satz20,21,24. Darüber hinaus Tat viele Studien konzentriert sich auf folgende in-Vivo -Infektionen im Laufe der Zeit dies durch die Messung der Größe der kutanen Läsion und andere physiologische Symptome, die nur indirekt auf Parasiten Replikation25,26 , 27. in-Vivo -Infektion ist einen stringenten Ansatz Parasit Virulenz zu beurteilen, aber Läsion Größenmessungen Straßenräuber Schwellung allein anhand sind oft unzureichend, da sie die Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe widerspiegeln und nicht die absolute Anzahl der Parasiten. Aus diesem Grund Straßenräuber Läsion Entwicklung haben Assays mit anschließendem Quantifizierung der Parasit Last im infizierten Gewebe Proben eine Prozedur, die langwierige begrenzende Verdünnung erfordert28. Darüber hinaus werden in Vivo Studien häufig mehrere Tiere an verschiedenen Punkten in der Zeit von Interesse6,8,9,10, Gewebe zu extrahieren zu Opfern 11 , 13. dagegen zahlreicher BMMs kann nur ein Tier entnommen werden, und diese Zellen können unter Bedingungen, die an verschiedenen Punkten in der Zeit der Infektion bewerten überzogen werden. Darüber hinaus erlaubt im Vergleich zu in-Vivo -Studien, in-vitro- BMM Infektionen mehr Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Quantifizierung der Makrophagen, zusammen mit dem Parasiten selbst angesteckt zu werden, ermöglicht präzise Kontrolle über die Multiplizität der Infektion (MOI) und der Kulturbedingungen. Genaue Kontrolle über diese Faktoren kann Schlüssel Merkmale der diskreten zelluläre Signalwege zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf den Verlauf der Infektion zu verstehen sein.
Angesichts dieser Vorteile, ist es wenig verwunderlich, dass sehr wenige Gruppen studieren Leishmaniose Virulenz bisher voll quantitative Bewertung der intrazelluläre Replikation in Makrophagen ausgenutzt haben. In diesem Artikel besprechen wir häufige Probleme, die möglicherweise behindern die weitergehende Nutzung des Assays, und bieten eine schrittweise Protokoll um seine korrekte Umsetzung zu erleichtern. In Anbetracht seiner Präzision und Vielseitigkeit kann der BMM-Infektion-Assay, die, den wir hier beschreiben, nicht nur genutzt werden, Wirt-Pathogen Interaktionen beeinflussen Leishmaniose Virulenz zu erkunden, sondern auch andere Mikroorganismen zu studieren, die im Inneren zu replizieren Makrophagen29. Wichtig ist, kann dieser Test auch als eine schnelle und kostengünstige prä-klinischen Screening-Methode für die Medikamentenentwicklung Anti-Leishmanial entwickelt werden.

<table><tbody><tr><td>6 well cell culture plate</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &amp;mu;L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &amp;mu;L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &amp;mu;L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide Needle, 25G&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: 12 mm circles</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol 200 proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Isoton II Diluent</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gemini</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&amp;nbsp; Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfactant</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Scissors, 4 1/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Der Lebenszyklus der Leishmaniose, die Erreger der Leishmaniose, wechselt zwischen Promastigote und Amastigote Phasen innerhalb der Insekten und Wirbeltiere Gastgeber, beziehungsweise. Während Pathogene Symptome der Leishmaniose stark und von gutartigen Hautveränderungen sehr tödliche Krankheit viszeralen Formen abhängig von der infektiösen Sorte variieren können befinden sich alle Leishmania -Arten im Host Makrophagen in der vertebrate Phase des Ihren gesamten Lebenszyklus hinweg. Leishmaniose Infektiosität bezieht sich daher direkt auf seine Fähigkeit, einzudringen, überleben und replizieren innerhalb Parasitophorous Vakuolen (PVs) in Makrophagen. Beurteilung der Parasit Fähigkeit, intrazellulär zu replizieren dient als zuverlässige Methode zur Bestimmung der Virulenz. Leishmaniose-Entwicklung mit Tiermodellen zu studieren ist zeitraubend, mühsam und oft schwierig, vor allem mit den pathogenetisch wichtigen viszeralen Formen. Wir beschreiben hier eine Methode um die intrazelluläre Entwicklung der Leishmaniose im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) folgen. Intrazellulären Parasiten Zahlen werden in 24 h-Intervallen für 72-96 h nach Infektion bestimmt. Diese Methode ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der Auswirkungen von verschiedenen genetischen Faktoren auf Leishmaniose Virulenz. Als Beispiel zeigen wir, wie eine einzelne Allel Löschung des Leishmaniose mitochondriale Eisen-Transporter-Gens (LMIT1) beeinträchtigt die Fähigkeit der Leishmaniose Amazonensis Mutante LMIT1/ΔLmit1 , innen BMMs wachsen, eine drastische Reduzierung der widerspiegelt Virulenz im Vergleich zu Wildtyp. Dieser Test ermöglicht auch präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen, die einzeln bearbeitet werden können, um den Einfluss verschiedener Faktoren (Nährstoffe, reaktive Sauerstoffspezies, etc.) auf die Wirt-Pathogen Interaktionen zu analysieren. Daher bieten die geeignete Ausführung und Quantifizierung der BMM Infektion Studien eine nicht-invasive, schnelle, wirtschaftliche, sichere und zuverlässige Alternative zu herkömmlichen Tiermodell Studien.

Leishmaniose hat zwei infektiöse Formen - metacyclic Promastigotes, die an die stationäre Phase der Kultur von prozyklischen Promastigotes unterscheiden und Amastigoten, die den intrazellulären Stadien (Abbildung 1) sind. Bei einigen Leishmania -Arten wie L. Amazonensiskönnen Amastigoten auch in der axenic Kultur unterschieden werden durch die Verlagerung der Promastigote Zellen, um die niedrigeren pH-Wert (4.5) und erhöhter Te...

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Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

quantification-intracellular-growth-inside-macrophages-is-fast

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

10.4K Aufrufe.  University of Maryland. Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.

Serie: Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

In Vivo-Infektion mit Leishmania amazonensis zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Obtainment of Macrophages from Human Monocytes to Assess Leishmania braziliensis Infection Rate and Innate Host Immune Response

Macrophages are multifunctional cells essential to the immune system function, and the primary host cell in Leishmania braziliensis (Lb) infection. These cells are specialized in microorganism recognition and phagocytosis, but also activate other immune cells and present antigens, as well as promote inflammation and tissue repair. Here, we describe a protocol to obtain mononuclear cells from peripheral blood (PBMC) of healthy donors to separate monocytes that then differentiate into macrophages. These cells can then be infected in vitro at different Lb concentrations to evaluate the ability to control infection, as well as evaluate host cell immune response, which can be measured by several methods. PBMCs were first isolated by centrifuging with Ficoll-Hypaque gradient and then plated to allow monocytes to adhere to culture plates; non-adherent cells were removed by washing. Next, adherent cells were cultured with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) for 7 days to induce macrophage differentiation. We suggest plating 2 x 106&#160;cells per well on 24-well plates in order to obtain 2 x 105&#160;macrophages. Fully differentiated macrophages can then be infected with Lb for 4 or 24 hours. This protocol results in a significant percentage of infected cells, which can be assessed by optical or fluorescence microscopy. In addition to infection index, parasite load can be measured by counting the numbers of parasites inside each cell. Further molecular and functional assays can also be performed in culture supernatants or within the macrophages themselves, which allows this protocol to be applied in a variety of contexts and also adapted to other intracellular parasite species.

Obtainment of Macrophages from Human Monocytes to Assess Leishmania braziliensis Infection Rate and Innate Host Immune Response

This protocol describes the process for obtaining human macrophages from monocytes for infection with Leishmania braziliensis. It also allows researchers to evaluate infection rate and parasite viability, ROS production by fluorescence microscopy, and the production of inflammatory mediators in culture supernatants to investigate macrophage response to infection.

Macrophages are multifunctional cells essential to the immune system function, and the primary host cell in Leishmania braziliensis (Lb) infection. These ...

In Vitro Differentiation of Human Dendritic Cells and their Markers in Leishmania Infection

Leishmaniasis comprises a collection of clinical manifestations associated with the infection of obligate intracellular protozoans, Leishmania. The life cycle of Leishmania parasites consists of two alternating life stages (amastigotes and promastigotes), during which parasites reside within either arthropod vectors or vertebrate hosts, respectively. Notably, the complex interactions between Leishmania parasites and several cells of the immune system largely influence the outcome of infection. Importantly, although macrophages are known to be the main host niche for Leishmania replication, parasites are also phagocytosed by other innate immune cells, such as neutrophils and dendritic cells (DCs). 
DCs play a major role in bridging the innate and adaptive branches of immunity and thus orchestrate immune responses against a wide range of pathogens. The mechanisms by which Leishmania and DCs interact remain unclear and involve aspects of pathogen capture, the dynamics of DC maturation and activation, DC migration to draining lymph node (dLNs), and antigen presentation to T cells. Although a large body of studies support the notion that DCs play a dual role in modulating immune responses against Leishmania, the participation of these cells in susceptibility or resistance to Leishmania remains poorly understood. After infection, DCs undergo a maturation process associated with the upregulation of surface major histocompatibility complex (MHC) II, in addition to costimulatory molecules (namely, CD40, CD80, and CD86). 
Understanding the role of DCs in infection outcome is crucial to developing therapeutic and prophylactic strategies to modulate the immune response against Leishmania. This paper describes a method for the characterization of Leishmania-DC interaction. This detailed protocol provides guidance throughout the steps of DC differentiation, the characterization of cell surface molecules, and infection protocols, allowing scientists to investigate DC response to Leishmania infection and gain insight into the roles played by these cells in the course of infection.

In Vitro Differentiation of Human Dendritic Cells and their Markers in Leishmania Infection

Dendritic cells (DCs) are essential components of innate immunity against Leishmania infection. The mechanisms underlying the complex interaction between DCs and Leishmania remain poorly understood. Here, we describe methods to evaluate how Leishmania infection affects the immunobiological function of human DCs, such as migration-related and costimulatory molecule expression.

Leishmaniasis comprises a collection of clinical manifestations associated with the infection of obligate intracellular protozoans, Leishmania. The life ...

Assessment of Leishmania Virulence within Cultured Macrophages

Source: Sarkar, A. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of&#160;Leishmania&#160;Parasites.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video investigates Leishmania&#39;s virulence by treating macrophages with metacyclic promastigotes, resulting in the formation of intracellular amastigotes. The confirmation of Leishmania&#39;s virulence is achieved through nucleic acid fluorescent dye staining. This insight can contribute to the development of new therapies for leishmaniasis.

Bewertung der Leishmanien-Virulenz in kultivierten Makrophagen

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

Quantifizierung der bakteriellen Infektion in Wirtszellen durch den koloniebildenden Unit-Assay

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video ...

Immune Response

Host-Pathogen Interaction

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Source: Sarkar, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the macrophage and parasite nuclei.

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

1. Plating BMMs on Coverslips for Infection 

	Prepare 6-well tissue culture plates by placing four (4) sterile 12 mm glass coverslips (autoclaved and ...

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre

In Vivo-Infektion mit Leishmania amazonensis zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Obtainment of Macrophages from Human Monocytes to Assess Leishmania braziliensis Infection Rate and Innate Host Immune Response

In Vitro Differentiation of Human Dendritic Cells and their Markers in Leishmania Infection

Bewertung der Leishmanien-Virulenz in kultivierten Makrophagen

Quantifizierung der bakteriellen Infektion in Wirtszellen durch den koloniebildenden Unit-Assay

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen