Diese Arbeit wurde teilweise von Nihon Pharmaceutical University Research Grant von Nihon Pharmaceutical University (2016) und MEXT KAKENHI Grant Nummer JP17854179 unterstützt.

Tierische experimentelle Protokolle waren von der Nihon Pharmazeutische Universität Ethikkommission genehmigt und gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Nihon Pharmaceutical University durchgeführt. Das Protokoll wurde für die Gewebe-Extrakte von ICR Mäusen abgeleitet angepasst. ICR Mäuse wurden von Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan) gekauft.
1. Vorbereitung des Substrats Iminobiotin beschriftet
Das Substrat erfährt Festphasen-Synthese mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Gruppe (Fmoc)-geschützte Aminosäuren wie unten11beschrieben. Verwenden Sie Tabelle 2 um die Fmoc-Verbindung verwendet, je nach der gewünschten Aminosäure und Stadium der Synthese zu bestimmen.
<ol><li>0,2 g der Fmoc-NH-SAL Harz mit 10 mL N, N-Dimethylformamid (DMF) in einer Synthese Spalte hinunterspülen.</li>
	<li>5 mL 30 % Piperidin in DMF hinzugeben. Rock-die Lösung für 10 min in der Fmoc-Gruppe zu Spalten.</li>
	<li>
Fmoc-Spaltung mit der Trinitrobenzenesulfonic Säure (TNBS) testen12: Fügen Sie 10 µL 1 % TNBS in DMF und 10 µL Diisopropylethylamine (DIPEA) eine 10 x 75 mm2 Glasröhrchen, dann Transfer eine kleine Menge des Harzes, das Glas Rohr. Die Fmoc-gespalten Harz sollte eine orange Farbe entwickeln.
	<ol>
<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,2-1,3, wenn dieses Ergebnis negativ ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie das Harz dreimal mit 5 mL DMF.</li>
	<li>
Fügen Sie 5 mL DMF enthalten 0,3 Mmol der Fmoc-Verbindung in Tabelle 2 (beginnend mit der Verbindung, die in Phase 1 verwendet), 0,3 Mmol O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium Hexafluorophosphate (HCTU), 1 - 0,3 Mmol aufgelistet Hydroxy-1H-benzotriazol, Monohydrat (HOBt) und 0,6 Mmol Diisopropylethylamine (DIPEA). Rock-die Lösung für 30 min, mit dem Harz zu koppeln.
	<ol>
<li>Überprüfen Sie diesen Schritt mit dem TNBS-Test. Wenn das Ergebnis positiv ist, bedeutet dies die Reaktion ist nicht ausreichend fortgeschritten und diesen Schritt wiederholt werden muss.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie das Harz dreimal mit 5 mL DMF.</li>
	<li>Wiederholen Sie der Dehnung Reaktion durch Wiederholen der Schritte 1,2-1,6, ändern die Fmoc-Verbindung in Schritt 1.5 nach Tabelle 2verwendet.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 2,5 % Wasser, 1 % Triisopropylsilane (TIS) und 2,5 % Ethanedithiol (EDT) in Trifluoroacetic Säure zu Peptiden aus dem Harz und Schutz Gruppen zu Spalten. Die Lösung für 60 min Rock.</li>
	<li>Filtern Sie und sammeln Sie Filtrat in ein 50-mL-Tube.</li>
	<li>Fügen Sie 40 mL kalte Diethyl Ethanol und laden über Nacht bei-20 ° C.</li>
	<li>Zentrifuge 4.000 x g bei-20 ° C für 30 min. sammeln das Pellet.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Exsikkator für 3 h um den Diethylether entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 50 % Acetonitril auf Wasser und lösen sich die grobe Peptide. Lyophilize die Lösung um Trifluoroacetic Säure zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals.</li>
	<li>
Reinigen Sie die Peptide mit einer C18 Patrone Spalte.
	<ol>
<li>Aktivieren Sie das Harz in der C18 Patrone Spalte mit 3 mL Acetonitril (ACN).</li>
		<li>Equilibrate mit 5 mL 5 % ACN, 0,1 % TFA in H2O.</li>
		<li>Laden Sie die rohe synthetische Peptide in der C18 Patrone Spalte.</li>
		<li>Waschen Sie mit 10 mL 5 % ACN, 0,1 % TFA in H2O.</li>
		<li>Die Proben mit 3 mL 60 % eluieren ACN, 0,1 % TFA in H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überprüfen Sie die Peptide durch die Messung ihrer Molekulargewicht mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
	<ol>
<li>Pipette 1 µL des Elutionsmittels auf eine Zieltafel. Fügen Sie sofort gesättigte α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säurelösung (CHCA) in 50 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoroacetic Säure</li>
		<li>Kristallisieren Sie die Mischung durch Lufttrocknung.</li>
		<li>Massenspektren von Proben gemäß Protokoll des Herstellers das Instrument zu erwerben.<ol>
<li>Manuell einstellen der MALDI-TOF Massenspektrometer zu einer positiven Modus spiegeln.</li>
			<li>Kalibrieren Sie das Massenspektrometer mit CHCA, Bradykinin fragment 1-7 (Monoisotopic Molekulargewicht = 756.3997 Da), und Angiotensin II (Monoisotopic Molekulargewicht = 1,045.5423 Da).</li>
			<li>Die Massenspektren von synthetischen Peptiden zu erwerben, und dann durch den Vergleich mit den theoretischen Molekulargewicht bewerten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Gewebes extrahiert
<ol><li>Männlichen ICR Mäuse in einer Isofluran Inhalation Kammer zu betäuben und Anästhesie Tiefe über Zeh kneifen zu überprüfen. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern.</li>
	<li>Mit Schere, machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt durch die Haut, die sich bis zum Xiphoid Prozeß.</li>
	<li>Schnitt durch das Zwerchfell und sammeln Sie alle Lungengewebe. Schneiden Sie das Gewebe wird in kleine Stücke.</li>
	<li>Waschen Sie das Gewebe dreimal mit eiskalten 50 mM Tris-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4).</li>
	<li>Wiegen Sie das Gewebe und Transfer ca. 100 mg Gewebe in ein Glasrohr 12 x 75 mm2 .</li>
	<li>Hinzugeben Sie 0,3 mL Extraktionspuffer (50 mM Tris-Puffer, pH 7,4, mit 0,1 % Poly (Oxyethylene) Octylphenyl Äther).</li>
	<li>
Die Lunge Gewebeproben mit einer Rührschüssel Homogenisator zu homogenisieren.
	<ol>
<li>Die Proben auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Homogenisieren der Proben bei 20.000 u/min für 30 s in einen Mixer geben. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Proben völlig homogen sind. Hinweis: Homogenisieren Sie nicht länger als 1 Minute kontinuierlich, um eine Erhöhung der Temperatur zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.000 µL der Homogenat eines 1,5 mL Tube und Zentrifuge für 5 min bei 10.000 x g bei 4 ° c zu übertragen</li>
	<li>Eine neue 1,5 mL Kunststoffrohr übermitteln Sie 500 µL des Überstands.</li>
	<li>Verwenden Sie 10 µL der Probe, um Proteinkonzentration, mit Methoden wie der Bicinchoninic Säure (BCA) oder Coomassie Brilliant Blue (CBB) Methode zu bestimmen.</li>
	<li>Fügen Sie 80 % Glycerin um das Einfrieren zu verhindern hinzu, die Proben für eine Endkonzentration von 50 % Glycerin.</li>
	<li>Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>3. Verdauung von Substraten in Modell Protease und Gewebe-Extrakte
<ol><li>
Fügen Sie 10 µL von 0,1 µg/µL des N-Tosyl-L-Phenylalanin Chloromethyl Keton (TPCK)-Trypsin, 0,1 µg/µL Staphylococcus Aureus V8 Protease oder 10 µg/µL Gewebe-Extrakte in 890 µL eines Puffers Verdauung.
	<ol>
<li>Verwenden Sie zur Klärung den Unterschied in der Protease Spezifität je nach der pH-Wert Puffer eingestellt auf pH 3, 5, 7 und 9. Die Zusammensetzung des Puffers Verdauung ist in Tabelle 3dargestellt.</li>
		<li>Führen Sie eine Negativkontrolle mit inaktiven Protease in Gewebe-Extrakte, Inkubation in kochendem Wasser (oder Heizung bei 100 ° C) für 10 min erstellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate (aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), Endkonzentration = 100 Pmol/10 µL).</li>
	<li>3 Stunden bei 37 ° C, mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate zu verdauen inkubieren.</li>
	<li>Stoppen Sie nach der Inkubation die Verdauung von Substraten mit kochendem Wasser (oder durch Erhitzen bei 100 ° C) für 10 min.</li>
	<li>Zentrifugieren der verdauten Substrate für 5 min bei 10.000 x g bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand in eine neue 1,5 mL Tube.</li>
</ol>4. Reinigung des Substrats Iminobiotin beschriftet
<ol><li>
Fügen Sie 50 µL 50 % Streptavidin-Sepharose-Kügelchen in 1 M Tris-Puffer (pH 9) mit 0,1 % poly(oxyethylene) Octylphenyl Äther.
	<ol>
<li>Verwenden Sie pH-Test-Papier, um sicherzustellen, dass die Lösung um pH 9 ist. Wenn der pH-Wert der Lösung niedrig ist, durch Zugabe von 1 M Tris-Puffer (pH 9) mit 0,1 % poly(oxyethylene) Octylphenyl Äther auf ca. pH 9 einstellen. Dieser Schritt ist wichtig, da es Bindung des Substrates Iminobiotin beschriftet Streptavidin beinhaltet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einem Rotator-Rad mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate binden an die Streptavidin. Die Perlen sollten während der Inkubation schweben.</li>
	<li>Zentrifuge für 1 min bei 10.000 x g bei 4 ° C. Den überstand zu entfernen.</li>
	<li>
Waschen Sie die Perlen fünfmal wie folgt:
	<ol>
<li>Die Perlen 1.000 µL einer Waschpuffer (50 mM Tris-Puffer, pH 9) hinzufügen.</li>
		<li>Für 10 min bei 4 ° C mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einem Rotator Rad waschen. Die Perlen sollten während der Inkubation schweben.</li>
		<li>Für 1 min bei 10.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die Perlen 100 µL 0,2 % Trifluoroacetic Säure hinzufügen.
	<ol>
<li>Verwenden Sie pH-Test-Papier, um sicherzustellen, dass die Lösung unter pH 2. Wenn der pH-Wert der Lösung hoch ist, stellen Sie den pH-Wert auf unter 2 durch Zugabe von 1 % Trifluoroacetic Säure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einem Rotator-Rad.</li>
	<li>Für 1 min bei 10.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann des Überstands auf eine neue 1,5 mL Tube.</li>
</ol>5. Probieren Sie Vorbereitung und Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-Massenspektrometrie)
Hinweis: Alle Lösungen in den folgenden Schritten sollten bereit sein, mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Grade oder Aminosäure-Sequenzierung-Grade Wasser.
<ol><li>Pipette 500 µL Acetonitril auf C18 Harz zu aktivieren. Entfernen Sie die gebrauchte Acetonitril. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.</li>
	<li>Equilibrate C18 Harz mit 100 µL 0.1 % Trifluoroacetic Säure. Das Laufmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.</li>
	<li>Um die Proben zu laden, binden Sie die Proben an das Harz mit einer Pipette.</li>
	<li>Waschen Sie das Harz mit 20 µL 0.1 % Trifluoroacetic Säure. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.</li>
	<li>Eluieren Sie die Proben mit 3 µL 60 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoroacetic Säure. Pipette Laufmittel auf eine Zieltafel für MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Fügen Sie sofort gesättigte α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säurelösung (CHCA) in 50 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoroacetic Säure.</li>
	<li>Kristallisieren Sie die Mischung durch Lufttrocknung.</li>
	<li>
Massenspektren von Proben nach Instrument Hersteller Protokoll zu erwerben.
	<ol>
<li>Manuell einstellen der MALDI-TOF Massenspektrometer zu einer positiven Modus spiegeln.</li>
		<li>Kalibrieren Sie das Massenspektrometer mit CHCA, Bradykinin fragment 1-7 (Monoisotopic Molekulargewicht = 756.3997 Da), und Angiotensin II (Monoisotopic Molekulargewicht = 1,045.5423 Da).</li>
		<li>Die Massenspektren von Proben, aufmerksam auf die Massenspektren von 700 bis 900 Da für gespalten Form der Biotin-Label Substrate zu erwerben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifizieren Sie die gefundenen Peaks mit Tabelle 1. Erkennung von entsprechenden Molekulargewicht zeigt Dekolleté am C-Terminus der entsprechenden Aminosäure.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. 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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Dieses Protokoll verwendet MALDI-TOF-Massenspektrometrie Protease Spezifität in grobe Proben von Gewebe-Extrakte abgeleitet identifizieren und kann leicht für mehrere Probenverarbeitung hochskaliert werden. Vor allem manipuliert wir pH-Wert um eine Änderung im Substratspezifität bewirken.
Die Avidin-Biotin Komplex (ABC) Methode, die in der Biochemie aufgrund seiner Bindung Besonderheit verbreitet wurde in unserem Protokoll eingesetzt. Aufgrund der starken Affinität von ABC ist die Bindung...

Proteasen regulieren die physiologischen Prozesse durch Spaltung von Proteinen, und die Einleitung der Protease-Aktivität zu bestimmten Zeiten und Orten geregelten1. Es ist daher wichtig, identifizieren die Expression und Aktivität des Gewebes, die lokal reguliert werden und eine neuartige Methode zur Erkennung von Proteasen zu entwickeln. Die Methode vorgeschlagen, dieser Studie soll Protease Spezifität parallel zur Erkennung von Proteasen zu ermitteln.
Es gibt einige Methoden zur Erkennung von Protease Spezifität. Die Azocasein Methode ist bekannt für seinen Gebrauch bei der Erkennung von Proteasen2 aber beschränkt sich in seiner Fähigkeit, weitere Informationen zu erhalten. Zymography ist eine weitere umfassende Protease-Erkennung-Methode, die verwendet werden kann, um festzustellen, das Molekulargewicht von Proteasen3, aber es kann nicht verwendet werden, zu prüfen, Substratspezifität. Protease-Spezifität kann durch spektrometrische Assays mit Substraten wie p-Nitroanilide-4, und fluorometrischen Assays, Verwendung von Cumarin Substrate5 oder Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays6bestimmt werden. Diese Methoden ermöglichen Einzel-Spezifität Erkennung von Substraten in einem einzigen Brunnen enthalten. In der vorliegenden Studie wird die Protease-Spezifität der Gewebe-Extrakte unter verschiedenen Bedingungen untersucht, da diese Extrakte mehrere Proteasen enthalten. Protease-Aktivität wird durch mehrere Faktoren, einschließlich pH-Wert, Coenzyme und prosthetischen Gruppen Ion Stärke reguliert. Vor kurzem wurden Proteomics-basierte Methoden zur Protease Spezifität zu identifizieren; zum Beispiel die Methode von Biniossek Et al.berichtet. 7 das Proteom Substratspezifität auch auszugsweise grob bestimmen verwendet und ermöglicht die genaue Bestimmung der Spaltung Aktivität von Proteasen, die mehrere Aminosäure-Sequenzen8erkennen. Diese Methode eignet sich jedoch nicht für die Analyse von zahlreichen Proben. Dagegen unsere Methode ermöglicht die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben und die Verwendung von Matrix Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie für die Probenanalyse ermöglicht schnelle und einfache Erkennung von der gespalten Substrate.
Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Evaluierung Protease Spezifität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie, um das Molekulargewicht des einzigartigen Substrate zu messen. Die molekularen Formen gespalten Substrate, zusammen mit ihre theoretischen Molekulargewichte sind in Abbildung 1 und Tabelle 1gezeigt. Frühere Studien haben Substrate mit Polyglycine Spacer und Biotin9verwendet; diese Substrate sind jedoch fehlerhaft, weil die Polyglycine-Sequenz durch Enzyme gespalten werden kann, die die Glycin-Sequenz zu erkennen. Darüber hinaus kann die hohe Affinität zwischen Avidin und Biotin zu einer geringen Quote führen. Um diese Nachteile in dieser Studie zu verbessern wir eine einzigartige Substrat synthetisiert die bestand von Polyethylenglykol (PEG), Iminobiotin und eine Aminosäure, die der spaltstelle (Abbildung 1) identifizieren konnten. Zur Unterscheidung zwischen Aminosäuren von ähnlichen Molekulargewichten wurde D-Serin zwischen den PEG-Abstandhalter und die Aminosäure am gespalten Standort hinzugefügt.
Die N-terminalen des Substrates war mit Iminobiotin, bezeichnet die Affinitätsreinigung von groben Proben ermöglicht. Der Einsatz von Iminobiotin anstelle von Biotin ist entscheidend; Biotin hat eine starke Affinität zu Avidin, das führt zu niedrigen Wiederfindungsraten von Biotin-markierten Substraten von Avidin Harz, während Iminobiotin die Affinität zum Avidin durch den pH-Wert verändert werden kann. Mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate binden an Avidin in Bedingungen oberhalb von pH 9, während Avidin mit der Bezeichnung der Iminobiotin Substrate in Bedingungen unter pH 4 veröffentlicht. Daher wurde Iminobiotin für Affinität Reinigung10verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung von Protease Spezifität mit einzigartigen Substrate.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)&lt;br/&gt;aminomethyl]phenoxy resin)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropylsilane (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 cartridge column</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>mixing homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>polytron homogenizer</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometry</td><td>Bruker Daltonics, Germany</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-amino acids</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteasen haben mehrere biologische Funktionen, einschließlich der Proteinverdauung Aktivierung/Inaktivierung und Essen. Identifizieren Protease Spezifität ist wichtig für die Preisgabe von Protease Funktion. In dieser Studie die vorgeschlagene Methode bestimmt Protease Spezifität durch Messung des Molekulargewichts des einzigartigen Substrate mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie. Die Substrate enthalten Iminobiotin, während die gespalten Site aus Aminosäuren besteht und das Distanzstück aus Polyethylenglykol besteht. Gespalten Substrat erzeugt eine einzigartige Molekulargewicht mit einer Aminosäure gespalten. Einer der Vorzüge dieser Methode ist, dass es in einen Topf mit groben Proben durchgeführt werden, und es eignet sich auch für die Beurteilung mehrerer Proben. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache experimentelle Methode optimiert mit Proben extrahiert aus Maus Lungengewebe, einschließlich Gewebe Extraktion, Platzierung des Verdauungssystems Substrate in Proben, Reinigung des Verdauungssystems Substrate unter verschiedenen pH-Bedingungen , und die Messung der Substrate Molekulargewicht mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Zusammenfassend lässt sich sagen erlaubt diese Technik für die Identifizierung von Protease Spezifität in grobe Proben abgeleitet von Gewebe-Extrakte mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie, die leicht für mehrere Probenverarbeitung skaliert werden kann.

Bewertung der Methode zur Identifizierung von Protease Spezifität durch Modell protease
Die Effizienz dieses Systems wurde bewertet mit TPCK-Trypsin und V8 Protease, dessen Substrat Besonderheiten gewonnen wurden. TPCK-Trypsin und V8 Protease wurden geschätzt, um die Aminosäure-Sequenz am C-Terminal von Lysin und Arginin-Rückständen und Carboxy seitlich der Asparaginsäure und Glutaminsäure Rückstände bzw. Spalten. ...

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The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.7K Aufrufe.  Nihon Pharmaceutical University. Hier präsentieren wir Ihnen Auszüge mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ein Protokoll Protease Spezifität im Rohöl Maus Gewebe zu bestimmen.

Serie: The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Forschung

Biotechnik

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Biochemie

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein phosphatases (PPPs) coordinate over 90% of all cellular serine/threonine dephosphorylation. Deregulation of protein phosphorylation has been implicated in the pathophysiology of various diseases, including cancer and neurodegeneration. Despite their widespread activity, the molecular mechanisms controlling PPPs and those controlled by PPPs are poorly characterized. Here, a proteomic approach termed phosphatase inhibitor beads and mass spectrometry (PIB-MS) is described to identify and quantify PPPs, their posttranslational modifications, and their interactors in as little as 12 h using any cell line or tissue. PIB-MS utilizes a non-selective PPP inhibitor, microcystin-LR (MCLR), immobilized on sepharose beads to capture and enrich endogenous PPPs and their associated proteins (termed the PPPome). This method does not require the exogenous expression of tagged versions of PPPs or the use of specific antibodies. PIB-MS offers an innovative way to study the evolutionarily conserved PPPs and expand our current understanding of dephosphorylation signaling.

Here, we present a protocol for the enrichment of endogenous phosphoprotein phosphatases and their interacting proteins from cells and tissues and their identification and quantification by mass spectrometry-based proteomics.

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Anreicherung von Wirtszellproteinen in monoklonalen Antikörpern

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks associated with drug products, methods have been developed to identify low-abundance HCPs. A crucial approach for developing a sensitive HCP detection method involves enriching HCPs while simultaneously removing monoclonal antibodies (mAbs) before analysis, utilizing liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
This protocol offers detailed instructions for enriching host cell proteins using commercially available proteome enrichment beads. These beads contain a diverse library of hexapeptide ligands with specific affinities for different proteins. The protocol also incorporates limited digestion and subsequent peptide detection using nano LC-MS/MS. By employing these techniques, HCPs with low abundance can be enriched over 7000-fold, resulting in an impressive detection limit as low as 0.002 ppm. Significantly, this protocol enables the detection of 850 HCPs with a high level of confidence using a NIST mAb. Moreover, it is designed to be user-friendly and includes a video demonstration to assist with its implementation. By following these steps, researchers can effectively enrich and detect HCPs, enhancing the sensitivity and accuracy of risk assessment for drug products.

Autor im Rampenlicht: Nachweis von Wirtszellproteinen in geringer Menge in Arzneimitteln mit Hilfe von Anreicherungskügelchen und begrenzter Verdauung 

A protocol is presented for enriching host cell proteins (HCPs) from drug products (DP) and detecting peptides using proteome enrichment beads. The method is demonstrated using an in-house manufactured monoclonal antibody (mAb) drug substance (DS), which is a well-characterized reference material for evaluating and comparing different methods in terms of performance.

Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

Chemie

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Biologie

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that transduce the mechanical energy of sound into an electro-chemical energy processed by the peripheral and central nervous systems. Several proteomic techniques have been developed to study the cochlear inner ear, such as two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), antibody microarray, and mass spectrometry (MS). MS is the most comprehensive and versatile tool in proteomics and in conjunction with separation methods can provide an in-depth proteome of biological samples. Separation methods combined with MS has the ability to enrich protein samples, detect low molecular weight and hydrophobic proteins, and identify low abundant proteins by reducing the proteome dynamic range. Different digestion strategies can be applied to whole lysate or to fractionated protein lysate to enhance peptide and protein sequence coverage. Utilization of different separation techniques, including strong cation exchange (SCX), reversed-phase (RP), and gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (GELFrEE) can be applied to reduce sample complexity prior to MS analysis for protein identification.

Proteome analysis of the cochlear sensory epithelium can be challenging due to its small size and because membrane proteins are difficult to isolate and identify. Both membrane and soluble proteins can be identified by combining multiple preparative methods and separation techniques along with high-resolution mass spectrometry.

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren