Diese Arbeit wurde möglich dank der Unterstützung von: Universität von Pavia BRD 2016; Universität Parma FIL 2014, 2016; und Kinesis für die Versorgung der Kunststoffprodukte notwendig, diese Studie durchzuführen. Wir danken Dr. Shane Windsor (Faculty of Engineering, University of Bristol, UK) für die Bereitstellung der Cell_PIV-Software.

Alle Verfahren, bei denen Tiere stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung und ethischen Komitees an Universität von Pavia. Tiere wurden beibehalten, unter 22 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit und ein hell-dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr.
1. Eierstock Isolation
<ol><li>Injizieren Sie intraperitoneal 2 vier bis elf Wochen alten CD1 weibliche Mäuse mit 10 U der Follikel-stimulierendes Hormon mit einer sterilen 1 mL Spritze mit Insulin.</li>
	<li>Warten Sie 46-48 h.</li>
	<li>Wiegen der Maus und mit einer intramuskulären Injektion von 50 mg/kg der Zoletil (Tiletamina und Zolazepan Cloridrate) zu betäuben. Einschläfern Sie durch zervikale Dislokation.</li>
	<li>Erfassen Sie die Haut der Bauchdecke mit einer Dissektion Pinzetten. Schneiden Sie Haut und Körper Wand mit einer Schere und ziehen Sie den Schnitt mit der Pinzette.</li>
	<li>Bewegen Sie mit der Pinzette die Eingeweide beiseite, lokalisieren die uterine Hörner und die Eierstöcke ihre Spitze zu lokalisieren.</li>
	<li>Sanft halten Sie den Eierstock mit Uhrmacher Pinzette und mit einer Schere schneiden Sie ihre Bänder in die Gebärmutter. Wiederholen Sie mit den anderen Eierstock.</li>
	<li>Übertragen Sie die gesammelten Eierstöcke in einer 35-mm-Zelle Kultur Petrischale mit 1 mL M2 Isolierung Medium bei 37 ° C, 5 % CO2 in Luft vorgewärmt.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fett und die Eileiter mit einer feinen Schere unter einem Stereomikroskop.</li>
</ol>2. Isolierung der Cumulus Eizelle komplexe
<ol><li>Punktion der Eierstöcken Oberfläche mit sterilen Pinzette und eine sterile Insulin-Nadel 1G bis antral Cumulus Eizelle komplexe (CoC) passiv freigegeben werden.</li>
	<li>Kok mit mehr als drei Zellschichten Cumulus mit einer Mund-gesteuerte Hand zog Pasteur Mikropipette (200 µm im Durchmesser) zu sammeln und in einem 300 µL Tropfen frisches M2 Medium überführen.</li>
	<li>Pipettieren sanft ein-und für einige Sekunden, um die Kumuluszellen rund um die Eizellen mit einer Hand zog Pasteur Mikropipette (80 µm im Durchmesser) zu entfernen,</li>
	<li>Immer wieder übertragen Sie Eizellen aus einem Tropfen 20 µL M2 Medium auf ein anderes, bis Kumuluszellen vollständig beseitigt sind.</li>
</ol>(3) Chromatin Organisationsbasis Eizelle Klassifizierung
<ol><li>Bereiten Sie Hoechst 33342 Färbelösung auf eine Endkonzentration von 0,05 µg/mL in M2 mittlerer ab einer Mutter-Lösung von 5 mg/mL in 1 X PBS verdünnt.</li>
	<li>Platzieren Sie 3,5 µL micro Tröpfchen von Hoechst Färbelösung am unteren Rand ein 35 mm-Petrischale-Deckel.</li>
	<li>Jede einzelne Eizelle in ein Hoechst Färbung Drop übertragen, die Schale auf einer Heizplatte vorgewärmt (37 ° C) und bedecken Sie es mit einem dunklen Deckel, Licht Exposition zu vermeiden.</li>
	<li>Beobachten Sie nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur die Eizellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10facher Vergrößerung unter UV-Licht (330-385 nm), für nicht mehr als 1-2 s.</li>
	<li>Klassifizieren Sie Eizellen als ein umgeben Nukleolus (SN) (Abbildung 1A), wenn sie einen Ring von Hoechst-positiven Chromatin die Nukleolus Umgebung präsentieren.</li>
	<li>Klassifizieren Sie Eizellen als eine nicht umgeben Nukleolus (NSN), wenn ihre Nukleolus nicht von Hoechst-positiven Chromatin umgeben ist und zeigt heterochromatischen Flecken innerhalb des Zellkerns (Abbildung 1 b zerstreuen).</li>
</ol>(4) neuronale Netzwerk-basierte Eizelle Klassifizierung
<ol><li>Bereiten Sie vier 2 µL Tröpfchen von α-MEM Medium mit 5 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 5 mM Taurin, 100 U/mL Penicillin, 75 µg/mL Streptomycin und 23,5 µg/µL Natrium Pyruvat in ein 35-mm-Glas ergänzt unten Petrischale und bedecken Sie sie mit vorgewärmte (37 ° C) und Pre-äquilibriert Mineralöl, mittlere Verdunstung zu vermeiden. Hinweis: Wenn eine live-Zelle-Screening-System verwenden, halten Sie die Tropfen in einem bestimmten Abstand mit einem gezeichneten Raster von 7 x 7 mm als Leitlinie.</li>
	<li>Transfer 3-4 Eizellen zu jedem Tropfen.</li>
	<li>Legen Sie den Glasboden Petrischale in ein live Cell-Screening-System, ausgestattet mit Zeitraffer-Aufnahme-Software (siehe Tabelle der Materialien), wodurch die Beobachtung der Eizellreifung in einer Umgebung mit stabilen Temperatur (37 ° C) und CO2 Konzentration (5 %).</li>
	<li>Öffnen Sie die Zeitraffer-Aufnahmesoftware. Auf dem Bildschirm erscheint ein Fenster mit eine live Aufnahme von der Eizelle auf der linken Seite und die Einstellung-Tasten auf der rechten Seite.</li>
	<li>Wählen Sie die Mitte der Eizelle in der Bildschirmmitte positionieren. Stellen Sie die Schärfe, wenn nötig.</li>
	<li>Wählen Sie die Schaltfläche " Ph " und legen Sie die DIA-Lampe auf 192; die Belichtungszeit für 1/125 s; der zu gewinnen um 1,99; und die Auflösung auf 1600 x 1200.</li>
	<li>Wählen Sie FL2 und DIA Lampe auf 5gesetzt; die Belichtungszeit , 3 s; die gewinnen zu 2,37; und die Auflösung auf 1600 x 1200.</li>
	<li>Wählen Sie die Schaltfläche " New point " um die Eizelle Position innerhalb der Kultur-Tropfen zu erfassen. Wiederholen Sie die gleiche Routine für jede Eizelle innerhalb der Kultur-Tropfen.</li>
	<li>Wählen Sie Uhrzeit und den Erwerb Zyklus auf 8 min. und die Gesamtzeit bis 15 h.</li>
	<li>Wählen Sie Zeitraffer starten , um die Aufnahme-Zyklus zu starten.</li>
	<li>Öffnen Sie die MATLAB Software und schreiben >>Cell_piv; und wählen Sie dann die PIV-Tool.</li>
	<li>Wählen Sie den Ordner mit den aufgezeichneten Film und .jpeg-Dateien, die gesamte Bildsequenz zu laden. Wählen Sie für jede Eizelle die Region of Interest (ROI) durch Klicken auf den Bereich auswählen.</li>
	<li>Wählen Sie Prozess PIV in das Menü "Datei". Wählen Sie die Schaltfläche " Viewer-Tool ". Hinweis: Das Programm berechnet die Geschwindigkeitsvektoren innerhalb des ROI und produziert automatisch eine Datendatei als .mat Datei gespeichert.</li>
	<li>Wählen Sie die zu öffnende Datei .mat. Wählen Sie die Schaltfläche Wählen Sie ROI-Tool und zeichnen Sie einen Kreis um den Umriss der Eizelle. Klicken Sie im Menü Datei auf speichern. Hinweis: Die Vektoren in dieser Region werden jetzt angezeigt und die mittlere Größe-Daten im Fenster "Graph" für diese neue ROI aktualisiert.</li>
	<li>Offen die gesammelten mittlere Größe-Daten der gesamten Zeitraffer Frames aufgezeichnet in ein Arbeitsblatt, mit, auf die Zeilen, die Bildfolge und an den Säulen, jede einzelne Eizelle analysiert.</li>
	<li>Organisieren Sie die Daten von NSN und SN Eizellen in 10 Untergruppen.</li>
	<li>Verwenden Sie 9 Untergruppen, um das Feedforward künstliche neuronale Netz iterativ zu trainieren (FANN) und 1 Untergruppe blind zu Testzwecken.<ol>
<li>Wiederholen Sie die anderen 9 Mal, ändern die blinde Teststichprobe (10-divisibel Kreuzvalidierung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Öffnen Sie MATLAB maßgeschneiderte Skript Haupt und, auf Anfrage, geben Sie den Namen der Datei mit den Trainingsdaten (train.txt), die Anzahl der NSN und SN Eizellen verwendet für Training und das Time-Lapse Intervall (in der Regel von analysiert werden # 1-2 Rahmen, Rahmen # 112-113).</li>
	<li>Drücken Sie, geben Sie das Training durchführen.</li>
	<li>Geben Sie den Namen der Datei mit Testdaten (test.txt).</li>
	<li>Öffnen Sie den Vektor Test_outputs_cyt im MATLAB Workspace. Hinweis: Es erscheint ein Fenster auf dem Bildschirm zeigt, in der ersten Zeile, die Wahrscheinlichkeit, richtig positive Ergebnisse (TP oder wahre NSN) und False Positives (FP oder falsche NSN) bzw. für NSN und SN Eizellen zu erhalten; stattdessen in der zweiten Reihe, die Wahrscheinlichkeit falsch negative (FN oder falsche SN) und richtig negativ (TN oder wahre SN) für NSN und SN Eizellen, bzw. zu erhalten.</li>
	<li>Verwenden Sie die Formel: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), um die FANN Genauigkeit, ausgedrückt als Prozentsatz zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die eine kümmern sollte während der Durchführung dieses Protokolls Maus Eizellen sowie mit anderen Arten. Einmal aus den Follikeln isoliert, Eizellen übertragen werden sollte sofort in die Aufnahme sinkt, wie die Trennung von der Begleiter Cumulus löst Zellen Anfang des GV-MII Übergangs. Eine mögliche Änderung dieses Protokolls konnte die Zugabe von 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) M2 Medium für COCs Isolierung verwendet werden. IBMX verhindert die sofortige Auslösung des GV-...

Weiblicher Unfruchtbarkeit ist eine Pathologie, die sich eine steigende Zahl von Frauen auswirkt. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind rund 20 % aller Paare unfruchtbar, mit einer 40 % aufgrund von Unfruchtbarkeit bei Frauen. Darüber hinaus ist ein Drittel der Frauen in der Krebs-Behandlungen (300.000/Jahr und 30.000/Jahr in den USA oder Italien, beziehungsweise) vorzeitige Ovarialinsuffizienz zu entwickeln.
Eine Strategie zur Unfruchtbarkeit bei Krebspatienten zu verhindern ist die Isolation und Kryokonservierung von Eibläschen vor der onkologischen Behandlung, gefolgt von in-vitro- Reifung (IVM) der GV Eizellen auf die MII-Bühne (GV-MII-Übergang). Die Verbesserung der Verfügbarkeit von nicht-invasive Marker der Eizelle Entwicklungskompetenz würde die Befruchtung und Entwicklungsprozesse und die gesamte Schwangerschaft Erfolg1,2.
Anhand ihrer Chromatin-Konfiguration nach der Färbung mit der supravital Fluorochrom Hoechst 33342, beobachtet Säugetier-ausgewachsene Eizellen werden entweder als umgeben Nukleolus (SN) oder eine nicht umgeben Nukleolus (NSN)3eingestuft. Neben ihrer unterschiedlichen Chromatin Organisation zeigen diese beiden Arten von Eizellen viele morphologische und funktionelle Unterschiede3,4,5,6,7,8 ,9, einschließlich ihrer meiotische und entwicklungspolitische Kompetenz. Wenn aus dem Eierstock isoliert und in Vitro gereift, Art von Eizellen Reichweite die MII-Bühne, sowohl nach Sperma Besamung, zu entwickeln, um das 2-Zell-Stadium, aber nur diejenigen mit einer SN Chromatin Organisation können zum Begriff9entwickeln. Obwohl gut wie eine Klassifizierungsmethode für die Auswahl der zuständigen vs. inkompetent Eizellen, ist der Hauptnachteil die mutagene Wirkung, die das Fluorochrom selbst und vor allem das UV-Licht verwendet für seine Entdeckung auf die Zellen haben könnte.
Aus all diesen Gründen suchten wir für andere nicht-invasive Marker, die mit der SN oder NSN Chromatin-Konformation, die die Verwendung von Hoechst unter Beibehaltung der gleichen hohen Klassifizierung Genauigkeit ersetzen könnte. Die Time-Lapse Beobachtung der zytoplasmatischen Bewegung Geschwindigkeiten (CMVs) taucht als ein Merkmal Kennzeichen der Status der Zelle. Zum Beispiel demonstriert neuere Studien, dass die Zuordnung zwischen CMVs zum Zeitpunkt der Befruchtung und die Fähigkeit der Maus und menschlichen Zygoten, komplette Präimplantationsdiagnostik und voll ausgetragenen Entwicklung10,11aufgenommen.
Basierend auf diesen früheren Studien, beschreiben wir hier eine Plattform für die Anerkennung von entwicklungspolitisch zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen5,6,7,8. Die Plattform basiert auf drei wesentlichen Schritten: 1) Oozyten isoliert von antrale Follikel werden zuerst eingestuft anhand ihrer Chromatin-Konfiguration entweder als ein umgeben Nukleolus (SN) oder ein nicht-umgeben Nukleolus (NSN); (2) Zeitraffer Bilder von CMVs, die während des GV-MII Übergangs jede einzelne Eizelle entnommen und analysiert mit Particle Image Velocimetry (PIV); und 3) mit PIV gewonnenen Daten werden mit einem Feed-Forward künstliche neuronale Netzwerk (FANN) für blinde Klassifizierung12,13analysiert. Wir geben die wichtigsten Schritte des Verfahrens für die Maus, um es bereit getestet und verwendet werden für andere Säugetierarten (z. B. Rinder, Affen und Menschen) entwickelt.

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>Hormonal treatment</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>For oocyte heterochromatin staining</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430165</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>For oocyte in vitro maturation</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&amp;nbsp;</td><td>WillCo&amp;nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>Live cell screening system&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>For follicles manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>To prevent contamination and medium evaporation</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>To prevent medium contamination&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P4562</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>For mice anesthesia</td></tr><tr><td>Cell_PIV sofware&amp;nbsp;</td><td>Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>For multi-paradigm numerical computing</td></tr></tbody></table>

a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

Die Möglichkeit, entwicklungsgeschichtlich zuständigen vs. inkompetent Eizellen mit nicht-invasiven Verfahren, so verbessert das Gesamtergebnis der Schwangerschaft wählen würde Unfruchtbarkeit Kliniken profitieren. Wir vor kurzem entwickelt eine Klassifizierungsmethode basierend auf mikroskopische live Beobachtungen der Maus Eizellen während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle (GV) die Metaphase II Stufe, gefolgt von der Analyse der zytoplasmatischen Bewegungen in diesem Zeitraffer Zeitraum auftreten. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle dieses Verfahrens. Eizellen sind von ausgewachsenen antrale Follikel isoliert und kultiviert für 15 h in einem Mikroskop für Zeitraffer-Analyse bei 37 ° C und 5 % CO2ausgestattet. In 8 min Abständen fotografiert. Die Bilder werden analysiert, mit der Particle Image Velocimetry (PIV)-Methode, die für jede Eizelle, das Profil der zytoplasmatischen Bewegung Geschwindigkeiten (CMVs) während der gesamten Kultur vorkommende berechnet. Schließlich werden die CMVs jede einzelne Eizelle durch eine mathematische Klassifizierungs-Tool (Feed-Forward künstliche neuronale Netz, FANN) zugeführt, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gamete entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent mit einer Genauigkeit von 91,03 % prognostiziert. Dieses Protokoll für die Maus einrichten konnten jetzt auf Eizellen anderer Arten, einschließlich des Menschen getestet werden.

Abbildung 2 zeigt eine repräsentative entwicklungsgeschichtlich kompetente und inkompetente Eizelle bzw. am Anfang (GV) und Ende (MII) das IVM-Verfahren. IVM ausgewachsene Maus Eizellen tritt während 15 h Kultur. Die Time-Lapse Beobachtung zeichnet den Verlauf der Meiose und erkennt meiotische Großveranstaltungen, darunter die GVBD und die Extrusion der erste Polkörper.
Die Analyse und den Vergl...

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A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die nicht-invasive Beurteilung der Eizelle Entwicklungskompetenz während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle zur Metaphase II Stufe durchgeführt. Diese Methode verbindet Zeitraffer Bildgebung mit Particle Image Velocimetry (PIV) und neuronale Netzwerkanalysen.

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Aufrufe.  University of Pavia. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die nicht-invasive Beurteilung der Eizelle Entwicklungskompetenz während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle zur Metaphase II Stufe durchgeführt. Diese Methode verbindet Zeitraffer Bildgebung mit Particle Image Velocimetry (PIV) und neuronale Netzwerkanalysen.

Serie: A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identifizierung von DNA-Schäden in prophase-arrestierten Eizellen von Mäusen

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor im Rampenlicht: Verständnis der DNA-Schadensreaktion in Säugetier-Eizellen und Präimplantationsembryonen 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Zusammenfassung

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Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung