Wir sind dankbar, Qing Xu für die Entwicklung der Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual Reporter mESC Linie und Jennifer Tyson, Asif Maroof, sowie Tim Petros für ihre frühen Arbeiten zu helfen, dieses Protokoll zu entwickeln. Wir danken auch den CHOP Flow Cytometry Kern für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 MH066912 (SA) und F30 MH105045-02 (DT) unterstützt.

Hinweis: Die dual Reporter mESC Linie beschrieben in diesem Protokoll sind auf Anfrage möglich (sande@mail.med.upenn.edu).
(1) Media-Vorbereitung
Hinweis: Warm alle Medien auf 37 ° C vor der Verwendung in der Zellkultur.
<ol><li>
Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>449 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) und Filter durch eine Filteranlage 500 mL 0,22 µm Pore 50 mL fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2-Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>Geben Sie 5 mL L-Alanin-L-Glutamin (100 X) und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) bis 489,5 mL DMEM: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) und Filter durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) und 5 mL N2 Anhang-B nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Serumfreien Wachstumsmedium (KSR) (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>Fügen Sie 75 mL serumfreien Medium Ergänzung, 5 mL L-Glutamin (100 X), 5 mL MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maus embryonalen Stammzellen Medien (für die Zubereitung 500 mL)
	<ol>
<li>75 mL Stammzellen Grade FBS, 5 mL MEM-NEAA hinzufügen (100 X), 5 mL L-Glutamin (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kultivierung mESCs
<ol><li>Platte mitotically inaktiven MEF Feeder Zellen in MEF Medien auf Gewebekultur behandelt Teller mit 3-4 x 104 Zellen/cm2. Lassen Sie mindestens 12 Stunden für sie in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 Regeln vor der Beschichtung der mESCs. Wenn nicht sofort verwendet wird, ersetzen Sie die MEF-Medien alle 3 Tage. Entsorgen Sie MEFs, wenn nicht innerhalb von 7 Tagen nach der Beschichtung verwendet.</li>
	<li>MEF-Platten in mESC Medien Maus Leukämie hemmenden Faktor (mLIF) (1.000 U/mL) mit fügen Sie mESCs (Dichteumfang von 1-4 x 104 Zellen/cm2 hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.</li>
	<li>Durchgang mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) mESCs (1:5-1:10) Sobald das Gericht wird ~ 70-80 % Zusammenfluss oder wenn die Kolonien beginnen zu berühren. Dies in der Regel erfolgt alle 2 Tage, aber kann bis zu 4 oder 5 Tage, je nach der anfänglichen Beschichtung Dichte nehmen.</li>
	<li>Pflegen Sie die mESCs auf einem MEF Feeder Layer mESC Mittel-und Pluripotenz zu halten.</li>
	<li>
Vor Beginn der Differenzierung, die passage der Zellen mindestens einmal auf Gelatine beschichtete Platten ohne MEFs, die MEFs zu verdünnen.
	<ol>
<li>Bereiten Gelatine beschichtete Platten durch Zugabe von 0,1 % Gelatine in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg2 + zu einem Gericht Gewebekultur behandelt und bei 37 ° C für mindestens 1 h Platte 1,5-2 x 106 Zellen/10 cm Platte verlassen (2,7 bis 3,6 x 104 Zellen/cm2) und lassen Sie die Zellen, für 2 Tage vor Beginn der Differenzierung zu erweitern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mESCs in Richtung MGE-ähnliche Teleenzephalischer Stammväter Differenzierung
<ol><li>
Differenzierung-Tag (TT) 0 = "float Zellen"
	<ol>
<li>Nachdem die mESCs gewachsen sind, auf Gelatine beschichtete Platten für 2 Tage, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie genügend Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) bedecken die Oberfläche der Platte (in der Regel 4 mL Trypsin-EDTA für eine 10 cm Gewebekultur Teller), und legen Sie die Zellen wieder in den Brutschrank bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 4 min.</li>
		<li>Stillen Sie nach 4 min die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit mESC Medien. Die Zellen auf eine entsprechend dimensionierte Zentrifugenröhrchen übertragen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie nach 5 min das Rohr und aspirieren Sie die Medien ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen das Pellet in 1 mL KSR:N2 Medien (1:1) mit der BMP-Inhibitor LDN-193189 (250 nM) und der Wnt-Inhibitor XAV-939 (10 µM).</li>
		<li>Messen Sie die Zellkonzentration unter Verwendung eines Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler. Start wachsenden Zellen als Embryoid Körper (EBs) durch Zugabe von 75.000 Zellen/mL in KSR:N2 Medium (1:1) mit LDN-193189 (250 nM) und XAV-939 (10 µM) in Gewebekultur-anhaftende Gerichte. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am DD1 bereiten Sie für Zelle "Landung" durch Beschichtung Gewebekultur behandelt Gerichte mit Poly-L-Lysin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) über Nacht (O/N) bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte oder mindestens 1 h.</li>
	<li>DD2, Aspirieren der Poly-L-Lysin und Beschichten der Platten mit Laminin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) O/N bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit. Hinweis: Während O/N optimal ist, weniger als 2 h kann ausreichend sein. Wenn Platten nicht am nächsten Tag verwendet werden, Aspirieren Laminin, ersetzen mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
	<li>
DD3 ("land Zellen")
	<ol>
<li>Vor Beginn der EB Dissoziation, Aspirieren der Laminin und die Platten trocken in einer Gewebekultur-Haube. Verwenden Sie keine Platten, die glänzende oder sichtbar nass erscheinen. Übertragen Sie die EBs mit Medien in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3-4 min 15 x g oder bis der EBs haben oelletiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie die Medien und 3 mL Zelle Ablösung Lösung mit DNase (2 U/mL) und Inkubation bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO2 für 15 min. sanft flick das Rohr alle 3 min um EB Dissoziation zu erleichtern.</li>
	<li>Sobald der EBs sind nicht mehr sichtbar oder 15 Minuten vergangen sind, fügen Sie 6 mL KSR:N2 (1:1) mit DNase (1 U/mL) und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g.</li>
	<li>Die Zellen in KSR:N2 (1:1) mit LDN-193189 Platte (250 nM), XAV-939 (10 µM), und der ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 µM) bei 4,5-5 x 104 Zellen/cm2.</li>
</ol>(4) SST-Anreicherung Protokoll: "DD12 GFP hohe Sonic Hedgehog (SHH)" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Ändern Sie auf DD5, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SSH (50 ng/mL).</li>
	<li>Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder am Tag 8 (Schritt 4.4) Beschichtung mit in Schritte 3.2-3.3 aufgeführten Anweisungen.</li>
	<li>Ändern Sie auf DD7, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD8 Platte wieder die Zellen. Hinweis: Während dieser Schritt nicht notwendig ist, kann wieder galvanischen Zellen frühen differenziert, unerwünschte Zelltypen reduzieren. Re Beschichtung auch Kugeln aus Zellen, die die nachgelagerten immunhistochemische Analysen erschweren bricht, und erhöht die Effizienz der FACS zu späteren Zeitpunkten.<ol>
<li>Neu Platte Zellen, die Zellen von der Platte mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) für 5 min bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2zu lösen. Die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit KSR:N2 zu stillen und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min. filtern die Zellen durch einen 40 µm Filter Schlauch, Klumpen zu entfernen. Platte wieder die Zellen bei 250.000 Zellen/cm2 N2/KSR (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und Y-27632 (10 µM) mit SHH (50 ng/mL). Hinweis: Wenn stattdessen die Entscheidung getroffen wird, nicht auf die Zellen auf DD8 Re Platte wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL) alle 2 Tage ab DD7, DD12 und IGF-1 hinzufügen (20 ng/mL) und FGF-2 (10 ng/mL) bis DD9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf DD10, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD12, um Zellen zu erhalten, die für SST Untertypen angereichert sind, verwenden FACS, um Lhx6::GFP zu isolieren-Zellen nur zum Ausdruck zu bringen.
	<ol>
<li>Um die Zellen zu entfernen, verwenden Sie eine nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz als Trypsin-EDTA. Waschen Sie Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie vorgewärmt nicht Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz mit DNase (2 U/mL) auf die Zellen. Legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 10-30 Minuten oder bis die Zellen getrennt haben. Klopfen Sie leicht die Platten alle 5 min um die Dissoziation zu unterstützen. Hinweis: Für DD11-12 Kulturen kann nur 10-15 Minuten erforderlich sein. Für DD15-16 Kulturen kann 30 Minuten oder mehr für vollständige Dissoziation erforderlich.</li>
		<li>Sobald die Zellen komplett von der Platte gehoben haben, fahren Sie mit FACS Isolierung unter Verwendung von standard-Protokollen oder verwenden Sie die Zellen in anderen nachgeschalteten Analysen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV-Anreicherung Protokoll: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder Beschichtung auf DD8 (Schritt 4.4) mit die Anweisungen gemäß 3.2-3.3 Schritte.</li>
	<li>Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Auf DD8, neu Platte Zellen wie unter Schritt 4.4 mit folgenden Ausnahmen: Wenn die Zellen neu Plattieren, SHH mit gespachtelten Agonist zu ersetzen (SAG; 30 nM) und atypische PKC-Hemmer (aPKCi; 2 µM) hinzufügen. Zusammengenommen, die erneut Galvanik Medien jetzt N2/KSR (1:1) enthält FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), und aPKCi (2 µM).</li>
	<li>Auf DD10 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM).</li>
	<li>
DD11 Hinweis: an dieser Stelle sind Nkx2.1::mCherry+ Zellen angereichert um PV CIns zu werden.<ol>
<li>Trennen Sie die Zellen aus der Platte für FACS verwenden das gleiche Protokoll in Schritt 4.6 beschrieben. Wenn die Entscheidung getroffen wird, um Nkx2.1::mCherry+ Zellen an einem späteren Tag Differenzierung zu sammeln, ignorieren Sie diesen Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf DD12 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD14 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD16 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Sammeln Sie auf DD17 die Nkx2.1::mCherry+ Zellen unter Verwendung des gleichen Protokolls in Schritt 4.6 beschrieben.</li>
</ol>(6) PV-Anreicherung Protokoll: "DD17 mCherry Low SHH" (Fortsetzung von Schritt 3,7)
<ol><li>Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL). Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
Auf DD9 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1). Ab diesem Zeitpunkt sind keine zusätzliche Wachstumsfaktoren notwendig.
	<ol>
<li>Weiterhin die Medien alle 2 Tage bis zur Ernte der Zellen auf DD17 ändern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence.">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).</li><li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes.">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).</li><li>Fogarty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genetic+patterning+of+the+embryonic+neuroepithelium+generates+GABAergic+interneuron+diversity+in+the+adult+cortex.">Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li><li>Colasante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Conversion+of+Fibroblasts+into+Functional+Forebrain+GABAergic+Interneurons+by+Direct+Genetic+Reprogramming.">Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344, 1240622 (2014).</li><li>Tyson, J. A., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+interneuron+transplants+to+study+development+and+treat+disease.">GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease.</a> Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).</li><li>Donegan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+interneuron+transplants+as+a+treatment+for+schizophrenia:+preclinical+validation+in+a+rodent+model.">Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model.</a> Mol Psychiatry. , (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+naive-like+human+pluripotent+stem+cells+based+on+HERVH+expression.">Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression.</a> Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).</li><li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia.">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).</li><li>Blahos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+site+on+the+Galpha+-protein+that+recognizes+heptahelical+receptors.">A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors.</a> J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während diese Methode ist sehr effektiv bei der Musterung J1 abgeleitet mESCs (SCRC-1010), erlebten wir Variablen Erfolg mit anderen mESC Linien und klonale Isolate. Zum Beispiel, Foxg1::venus mESCs (EB3 abgeleitet; Danjo Et al. 13) reagieren schlecht auf dieses Protokoll und Foxg1 Induktion durch DD12 ist in der Regel in der Größenordnung von 1 %-2 %. Aus Gründen, die wir nicht vollständig verstehen, produziert ein weiteres Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter Klon (genannt JQ59)...

Bei Mäusen und Menschen, rund die Hälfte aller kortikalen hemmenden Interneuronen (CIns) stammen im Rahmen einer vorübergehenden subkortikale Struktur bekannt als mediale ganglionic Eminenz (MGE), wo neuroepithelialer Vorfahren der CIns und anderen neuronalen und Gliazellen Untergruppen Ausdrücken der Transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn Untergruppen oder Subtypen sind durch sich überschneidende morphologische, neurochemische, elektrophysiologische und Konnektivität Merkmale3,4definiert. MGE-abgeleitete CIns in gruppiert werden können meist nicht überlappende Untergruppen basierend auf ihren Ausdruck der PV oder SST, der Ausdruck der welche korreliert mit bestimmten elektrophysiologische und Konnektivität Tendenzen5. Dysfunktion von Interneuronen, insbesondere in der PV-Untergruppe hat in mehreren-neuropsychiatrischen Störungen und Krankheiten6,7verwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, mitotischen Vorläuferzellen Stammzellen abgeleitet und wandernden Vorstufen für PV oder SST CIn Schicksal für kortikale Interneuron Biologie zu studieren und für den Einsatz in zellbasierten Therapien angereichert zu produzieren.
Wir haben eine skalierbare und hocheffiziente Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen von mESCs entwickelt. Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Zeile8, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6 exprimierenden Post-mitotischen Nachkommen über FACS isoliert und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet werden können. Durch die Manipulation einer Anzahl der Signalwege, Dauer der Kultur und Modus der Neurogenese, erhalten wir Millionen von Eindringmittel beschrifteten Interneuron Vorstufen für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen geeignet.
Obwohl einige andere Methoden gibt es zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs9,10,11,12,13,14, unsere Methode, die stützt sich auf die Wnt Antagonist XAV-939 ist besonders effizient zu generieren Foxg1/Nkx2.1 Co Teleenzephalischer Vorfahren zum Ausdruck zu bringen. Stark erhöht die Fähigkeit, für Interneuron Stammväter oder Post-mitotischen Lhx6 exprimierenden Nachkommen über unser dual Reporter-System wählen die Fähigkeit, verschiedene Vorfahren und deren Nachkommen zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>Bottle-top vacuum filter system</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;29&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;35&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;36&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;37&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>N2 supplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Do not filter with base media -- add after filtration</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Also known as L-alanine-L-glutamine. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;38&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Also known as serum-free medium supplement. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>L-glutamine (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>Also known as non-glutamine containing DMEM. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Also known as stem cell grade FBS. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture treated dish (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Non-adherent sterile petri dish (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Do not freeze, store at 4&#039;C. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin Solution</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Resuspend in DMSO and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>Resuspend in DMSO and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Resuspend in DMSO and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>Smoothened agonist (SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>Resuspend in H20 and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>PKC&amp;zeta; Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated</td><td>EMD Millipore</td><td>539624</td><td>Resuspend in H20 and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr></tbody></table>

differentiation of mouse embryonic stem cells into cortical interneuron precursors

Kortikale GABAergen Interneuronen sind eine heterogene Bevölkerung der Zellen, die kritische Rollen bei der Regelung des Ausgang des exzitatorischen pyramidale Neuronen sowie synchronisieren die Ausgänge der pyramidalen Neuron Ensembles spielen. Defizite im Interneuron Funktion haben in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie verwickelt. Die Ableitung der kortikale Interneurone aus embryonalen Stammzellen nicht nur für das Studium ihrer Entwicklung und Funktion ermöglicht, sondern bietet einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese der kortikalen Interneuron-Erkrankungen. Interneuronen haben auch die bemerkenswerte Fähigkeit, überleben, Migration und Integration in Host kortikalen Schaltung nach Transplantation, so dass sie ideale Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. Hier präsentieren wir Ihnen eine skalierbare, hocheffiziente, modifizierte Embryoid Körper-Monolayer-Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6-mit dem Ausdruck nach dem mitotischen Nachkommen isoliert über Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet. Wir bieten auch Methoden bereichern Parvalbumin (PV) oder Somatostatin (SST) Interneuron Untergruppen, die für das Studium Aspekte des Schicksal Bestimmung oder für den Einsatz in therapeutischen Anwendungen möglicherweise hilfreich, die von Interneuron Untergruppe angereicherte profitieren würde Transplantationen.

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen ist eine modifizierte Version von unseren veröffentlichten Protokolle15,16,17 und wurde für den Einsatz mit unseren Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC optimiert. Durch das Hinzufügen der Wnt-Inhibitors XAV-939 DD0-5, kombiniert mit neu bei DD8 Beschichtung, erreichen wir robuste Nkx2.1 Induktion, wobei mehr als 50 % der alle DAPI + Kerne...

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Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.3K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Serie: Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Forschung

Biologie

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Entwicklungsbiologie

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Neurowissenschaften

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Generierung kortikaler Interneuronen-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen der Maus

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus zu einer vernetzten Neuronenpopulation

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...