Die Autoren bestätigen das Sponsoring von Thermo-Fisher Scientific und danken dem Nikon Imaging Center am Kings College London für die Unterstützung bei der konfokalen Bildaufnahme.

Alle Tierversuche unterlagen einer örtlichen ethischen Zustimmung und wurden unter den Bedingungen einer britischen Regierung Home Office Lizenz durchgeführt. 1. Hauternte und Kryokonservierung <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 25 ml 4% PFA und zwei 100-mm-Kulturschalen mit 25 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. </li><li> Füllen Sie rechteckige abziehbare Kryomaten um zwei Drittel mit optimaler Schnitttemperatur-Verbindung (OCT). </li><li> Legen Sie eine Metallplatte, auf der die Kryoblöcke in einem späteren Schritt platziert werden können, in die -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol></li><li> Hauternte, Fixierung und Kryokonservierung. <ol><li> Clip die dorsale Region der Tier-Leiche mit einem trockenen elektrischen Rasierer. ANMERKUNG: In diesem Beispiel wurden postnatale Tag 21 Wildtyp-Mäuse verwendet. </li><li> Ernten Sie die interessanten Bereiche auf der Haut. HINWEIS: Die dorsomediale Region der Maushaut ( <stronG class = &quot;xfig&quot;&gt; Abbildung 1a) enthält den höchsten Prozentsatz der Haarfollikel, die gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet sind, was eine optimale Ausrichtung für das Schneiden ermöglicht. Die Entfernung des zugrunde liegenden nicht-dermalen Gewebes ist nicht erforderlich, kann aber bei Bedarf durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie die geerntete Haut in rechteckige Stücke von passender Größe, um in den Boden der Kryomold passen, wobei das Richtungswachstum der Haarfollikel Getreide zu berücksichtigen. HINWEIS: Kleinere Hautscheiben sind für Anfänger einfacher zu handhaben, da sie sich während der Inkubations- und Montageprozesse weniger verwickeln. Das hier gezeigte Beispiel ist ein ~ 1 cm 2 Bereich der dorsalen Haut, der in eine 22 x 30 x 20 mm Kryomold passt ( Abbildung 2a ). </li><li> Fixieren Sie die Haut bei Raumtemperatur in 25 ml 4% PFA für 10-30 min, abhängig von der Dicke der Hautproben ( Abbildung 1b ). </li><li> Die Hautproben zweimal in 25 ml PBS waschenFür mindestens 5 min ( Abbildung 1b ). </li><li> Tauchen Sie die Hautproben auf ein Papiertuch, um das Gewebe von überschüssigem PBS sorgfältig abzulassen, was zu einer Kristallisation während des Gefrierprozesses führen kann und die Ergebnisse der Kryosektion beeinflussen kann. HINWEIS: Ein Standard-Saccharose-Gradient ist nicht erforderlich. Dies kann aber auch nach eigenem Ermessen in das Protokoll aufgenommen werden. </li><li> Achten Sie auf die Orientierung der Haarfollikel für jede Hautprobe. Verwenden Sie ein Seziermikroskop für visuelle Hilfe (vor allem jemand, der das Protokoll zum ersten Mal durchführt). Setzen Sie die Hautprobe in die OCT-gefüllte Kryomille ein und entbinden Sie alle Bereiche der Haut mit OCT, indem Sie Luftblasen entfernen, die an der Oberfläche des abgeschnittenen Haares mit einer Pinzette befestigt sind ( Abb. 2a und 2b ). </li><li> Schieben Sie die Haut auf den Boden des OCT gefüllten Blocks, so dass es bündig mit dem Boden liegt. HINWEIS: Die Haut kann in jede Richtung ausgerichtet werdenS lang wie das Korn der Haarfollikel für richtige Schneidverfahren bekannt ist. Die Kryomillen werden neu ausgerichtet, wenn die Blöcke an den Kryostaten zum Kryoschweißen angeschlossen sind. Markiere die Haarfollikelorientierung auf der Kryomold, da dieser Schritt die nachfolgende Orientierung des Kryostatschnittes bestimmt. </li><li> Übertragen Sie die Kryoblöcke auf die Metallplatte in der Gefrierschrank -80 ° C, um das Schwimmen und die Verlagerung des Gewebes zu vermeiden. </li><li> Überwachen Sie den Einfrierprozess, um die Ausrichtung der Haut an der Unterseite der Kryomold aufrechtzuerhalten, da unsichtbare Luftblasen dazu führen können, dass die Haut auf die Oberfläche der Kryomille aufsteigt. HINWEIS: Kryomaten mit gefrorenem Gewebe können für mehr als ein Jahr bei -80 ° C gelagert werden und können für weitere Abschnitte wiederverwendet werden. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ernte und Fixierung der Maushaut. </stroNg&gt; ( A ) Das Hautgewebe wurde aus der dorsomedialen Region des Tierkadaveres geerntet. Haarfollikel in diesem Bereich sind gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet und erlauben somit eine optimale Orientierung während des Schnittes, wie durch die Pfeile angedeutet. ( B ) Nach dem Schneiden von Quadraten einer geeigneten Grße, die in die Kryomille passt, wurde das Hautgewebe für 15 min in 4% PFA fixiert und zweimal in PBS für jeweils 5 min gewaschen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Dickes Gewebe Querschnitt <ol><li> Vorbereitung und Gewebeorientierung auf den Kryostaten aufzubauen. <ol><li> Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 15 ml PBS vor. Legen Sie es auf einen leicht zugänglichen Bereich auf dem Kryostat. Zusätzlich wird eine 12-Well-Platte mit 2,5 ml PBS pro Well hergestellt; Etikett nach den Proben für die Langzeitlagerung der SeBei 4 ° C. Verwenden Sie Pinzette, um die Abschnitte zu behandeln. </li><li> Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -20 ° C ein. HINWEIS: Die Temperatur kann den Schnitt beeinflussen, aber eine gute Anleitung ist bei -20 ° C zu starten. </li><li> Um Abschnitte zu erhalten, die etwa zwei Haarfollikel dick sind, stellen Sie den Kryostaten so ein, dass er 150 μm dick ist. HINWEIS: Die Dicke des Abschnitts kann je nach Bedarf des Benutzers und den Einschränkungen des Mikroskops variiert werden, die für die Analyse verwendet werden. HINWEIS: Die Orientierung der Probe ist entscheidend für die Erzielung von Hautabschnitten mit Haarfollikeln in der entsprechenden Orientierung. Dies wird durch eine ordnungsgemäße Montage am Kryostatblock erreicht. Vergewissern Sie sich, dass die Schnittebene parallel zur Haarfollikelausrichtung ist ( Abbildung 2c ). Wie bereits erwähnt, ist die korrekte Ausrichtung der Sektionsebene in der Hautprobe ein entscheidender Schritt zur Bestimmung der Qualität der Bilder, die in der Haut aufgenommen werdenEinen späteren Schritt </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Abbildung 2. Einbettung, Kryokonservierung und Schnitt. ( A ) Die Markierung der Haarfollikel (HF) Richtung auf der Kryomold, die durch die schwarzen Pfeile angedeutet ist, ist für die richtige Orientierung während der Kryoschaltung wichtig. ( B ) Die Schnittebene muss mit der Haarfollikelorientierung ausgerichtet werden, um Abschnitte zu erzeugen, in denen die gesamte Länge der Haarfollikel intakt bleibt. ( C ) Abschnitte wurden pro Haarfollikelorientierung geschnitten, die durch die schwarzen Pfeile auf der Kryomold ( D ) Die dicken Gewebequerschnitte wurden mit Metallzangen gesammelt und ( e ) in eine 100 mm Kulturschale mit 1x PBS überführt. ( F ) Bei Raumtemperatur löst sich der PBS den OC ab.T. Die die dicken Gewebequerschnitte umgibt, wie durch die weißen Pfeile angedeutet. Die Abschnitte schweben dann frei im PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Kryoschweißen <ol><li> Schneide einen Abschnitt mit dem Kryostaten. Verwenden Sie Pinzette, um den OCT zu sammeln, der das eingebettete Stück der Haut enthält ( Abbildung 2d ). HINWEIS: Verwenden Sie einen Kryostaten, der eine unabhängige Bewegung und Einstellung entlang der X-, Y- und Z-Achsen ermöglicht, um eine optimale Probenpositionierung zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Erzeugung von optimal ausgerichteten Gewebequerschnitten. </li><li> Übertragen Sie den Abschnitt aus dem Kryostat in die 100 mm Kulturschale, die mit PBS gefüllt ist, und fahren Sie mit der nächsten Scheibe fort. Sammeln Sie die Proben nicht auf einer Folie ( Abbildung 2e ). HINWEIS: Bei Raumtemperatur löst sich der PBS abDie OCT, verlassen Hautscheiben, die einfach zu handhaben mit Pinzette ( Abbildung 2f ). HINWEIS: Frische PBS kann in der 100 mm Kulturschale nach dem Auflösen vieler Gewebeabschnitte von 100 μm Dicke benötigt werden und kann entsprechend geändert werden. </li><li> Verwenden Sie Pinzette, um die schwimmenden Hautabschnitte auf die korrekt markierte Vertiefung in einer 12-Well-Platte zu übertragen, die mit 2,5 ml PBS gefüllt ist ( Abbildung 3a , links). HINWEIS: Bei 4 ° C können die Proben für mindestens zwei Tage gelagert werden. Zur Langzeitlagerung von hauthaltigen OCT-Blöcken nach dem Schneiden die Schneidfläche mit einem Tropfen frischen OCT abdichten. Nach dem Einfrieren des OCT-Tröpfchens den gebrauchten OCT-Block in Parafilm einwickeln und in den Gefrierschrank von -80 ° C zurücklegen . </li></ol></li></ol> 3. Immunfluoreszente Kennzeichnung. <ol><li> Bereiten Sie den PB-Puffer (PBS, ergänzt mit 0,5% Magermilchpulver, 0,25% Fischhautgelatine und 0,5% Triton X-100) bei leas vorT 2 h im voraus, wie zuvor beschrieben 5 . HINWEIS: Natriumazid kann dem PB-Puffer zur Antikörper-Konservierung für die wiederholte Verwendung des Färbepuffers zugesetzt werden. </li><li> Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 μl PB-Puffer pro Röhrchen hinzu. Verwenden Sie vorsichtig Pinzetten, um die Hautscheiben aus dem PBS in separate Röhrchen zu bringen, die den PB-Puffer zum Blockieren enthalten ( Abbildung 3a , rechts). Stellen Sie sicher, dass alle Hautscheiben vollständig untergetaucht sind. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 10 Oszillationen pro Minute auf eine Wippe, die die Gewebeintegrität nicht stören sollte, für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Es ist entscheidend, dass die Geschwindigkeit nicht mehr als 10 Schwingungen pro Minute auf der Wippe übersteigt, da es zu Verwicklungen führen wird. <ol><li> Während es möglich ist, mehr als eine Scheibe pro Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen, um Antikörper zu sparen, legen Sie nur eine Scheibe pro Röhrchen. Um den Antikörperverbrauch zu verringern, verwenden Sie ein VolumeVon 250 &amp; mgr; l HINWEIS: Falls erforderlich, ersetzen Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit z. B. 96-Well-Platten. Die Platzierung der dicken Gewebequerschnitte in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ermöglicht jedoch die effektivste Antikörperpenetration in das Gewebe aufgrund der erhöhten Flüssigkeitsstörung. </li></ol></li><li> Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Hautscheibe und fügen Sie 500 μl PB-Puffer und die entsprechende Menge an primärem Antikörper hinzu. Nach 1 h Blockierung die Hautscheiben in die frisch zubereiteten Röhrchen überführen, die die Antikörper enthalten. Die Scheiben bei 4 ° C über Nacht inkubieren. HINWEIS: In diesem Beispiel wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: FITC-Ratten-Anti-Human-CD49f bei einer Konzentration von 1:50 und Ziegen-anti-Maus / Rattenintegrin alpha 8 bei einer Konzentration von 1: 100. </li><li> Am nächsten Tag werden zwei getrennte 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt, die 500 μl PBS pro Probe enthalten. Die Hautscheiben zweimal für 1 h bei Raumtemperatur waschenE. </li><li> Bereiten Sie getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 500 μl PB-Puffer mit der entsprechenden Konzentration an anwendbaren sekundären Antikörpern und 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthalten. ANMERKUNG: Die in diesem Beispiel verwendeten sekundären Antikörper sind Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ratten-IgG und Alexa Fluor 555 Esel Anti-Ziegen-IgG in einer Konzentration von 1: 500. DAPI wurde in einer Konzentration von 1: 100 verwendet. </li><li> Sorgfältig die Hautproben in den PB-Puffer überführen, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält und die Hautscheiben bei Raumtemperatur für 1 h bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rotator oder Schüttler inkubieren. </li><li> Die Scheiben bei 4 ° C im PB-Puffer, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält, für bis zu vier Tage aufbewahren und eventuell länger, wenn Natriumazid dem PBS zugesetzt wird. </li></ol><img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Abbildung 3. ImmunfluoreszenzEtikettierung und Montage. ( A ) Die schwimmenden Gewebequerschnitte können in 12-Well-Platten für mindestens zwei Tage bei 4 ° C gelagert werden. Vor der Immunfluoreszenz-Markierung (IF) können die interessierenden Gewebequerschnitte in 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen, die PB-Puffer zum Blockieren enthalten, übertragen, wie durch Pfeil 1 angedeutet. Für die IF-Markierung haften Sie an dem in Schritt 3 ausgearbeiteten mehrstufigen Verfahren Teil von Schritt 3 erfordert die sorgfältige Übertragung der Gewebequerschnitte in frisch präparierte Mikrozentrifugenröhrchen, die primäre Antikörperlösung, sekundäre Antikörperlösung oder Waschpuffer enthalten, was durch Pfeil 2 angedeutet ist. ( B ) Nach der IF-Markierung wird die Gewebe- Abschnitte werden in einem Tröpfchen von Glycerin unter Verwendung eines Sektionsmikroskops aufgehoben und abgeflacht. ( C ) Sobald der Gewebequerschnitt vollständig auf den Boden eines Deckglases abgeflacht ist, wird ein regelmäßiger Mikroskop-Objektträger zur Befestigung des Abschnitts verwendet. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Montage für mikroskopische Visualisierung <ol><li> Vor der Bildgebung werden die Hautscheiben auf getrennte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, die 500 μl PBS enthalten, um die sekundären Antikörper und DAPI zu waschen. </li><li> Verwenden Sie eine 1000 μl Pipette, aber schneiden Sie die ersten 0,5 cm der Pipettenspitze ab, um das richtige Pipettieren des hochviskosen Glycerins zu ermöglichen. Legen Sie ein 22 x 50 mm Deckglas auf einen dunklen Hintergrund unter einem Sektionsmikroskop ( Abbildung 3b ). </li><li> Füge ein Tröpfchen von 100% Glycerin auf den Deckzettel hinzu ( Abbildung 3b ). Übertragen Sie die Hautscheibe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf das Glycerintröpfchen. Verwenden Sie das Seziermikroskop und spitzen Pinzette, um sorgfältig die Haut Scheiben, die zusammengerollt sind, abwickeln. HINWEIS: Als die Scheibe im Gly schwimmtCerol Tröpfchen, kann es entwirrt werden, indem die natürliche Neigung des Gewebes, um seine normale Form zurückzukehren. Die unnatürliche Begradigung der Scheibe nicht zwingen, da dies das Gewebe beschädigen könnte. </li><li> Montieren Sie das Gewebe, sobald die gesamte Länge des Hautabschnitts richtig ausgerichtet und auf dem Deckel abgeflacht ist; Verwenden Sie eine regelmäßige Mikroskop-Folie. Dieser Schritt wird die Hautscheibe weiter begradigen. HINWEIS: Vermeiden Sie Lufteinschlüsse ( Abbildung 3c ). </li><li> Bild die in Glycerin-montierten Hautabschnitte innerhalb der nächsten zwei Tage. HINWEIS: Eine längere Lagerung wird die Gewebe- und Abbildungsqualität negativ beeinflussen. In diesem Beispiel wurden alle Bilder mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines 20x Objektivs erworben. </li></ol>

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	<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration.">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li><li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells.">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li><li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis:+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis.">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li><li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis.">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li><li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation.">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche.">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li><li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artifacts+in+frozen+section+preparation.">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li><li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+dermal+adipose+tissue.">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li><li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair.">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li><li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment.">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li><li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin.">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li></ol>

Die Autoren möchten zeigen, dass die Veröffentlichung dieses Manuskripts von Thermo-Fisher Scientific Inc. finanziert wurde

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10. 
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 &#181;m used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

Die revolution von mikroskopischen Bildgebungsgeräten sorgt für anspruchsvolle, hochauflösende Bildgebungsinstrumente. Bei der Erfassung eines mikroskopischen Bildes eines kompletten dreidimensionalen (3D) Gewebequerschnitts stellt das Probenpräparat jedoch erhebliche Herausforderungen dar und kann der begrenzende Faktor bei der Definition der Bildqualität sein. Jeder einzelne Schritt verdient eine sorgfältige Betrachtung, um die Gewebemorphologie und die Antigenität von Zielproteinen zu bewahren, um verarbeitungsbedingte Artefakte zu minimieren und die endgültige Bildqualität zu maximieren. Zum Beispiel erfordert die traditionelle Hautanalyse ein Bild mit Blick auf die Epidermis und Dermis, mit Haarfollikeln, die richtig orientiert sind und die anatomische Analyse der Stammzellkompartimentbeiträge zur Hauthomöostase 1 , 2 ermöglichen . Dies erfordert eine gründliche Konzentration, wie die Haut eingebettet und geschnitten ist. Wichtig, Haarfollikel können dicker seinAls 100 μm, was die Standard-Paraffin- oder gefrorene Schnittdicke stark übersteigt, was zu einem niedrigeren Analysengrad im Vergleich zu ganzen Montierungen oder dicken Querschnitten 3 , 4 , 5 führt . Zusammengenommen ist jeder Schritt der Probenvorbereitung für die mikroskopische Analyse eine kritische Determinante, die die Bildanalyse beeinflussen wird. Hier wird ein neuartiges Verarbeitungsprotokoll für eine dicke 3D-Gewebequerschnittsanalyse vorgestellt, die wir als &quot;horizontale Vollmontage&quot; bezeichnen. Das Protokoll bewahrt die Antigenität hoch und ermöglicht die volle Ausnutzung von dicken Abschnitten der Haut durch die Verwendung von konfokalen bildgebenden Geräten. Dies ist ein vollständiger Leitfaden zur Verwendung von Haut für die Verarbeitung und Bildgebung von Gewebequerschnitten, einschließlich Gewebeernte und Paraformaldehyd (PFA) -assistierte Kryokonservierung (Schritt 1), die Erzeugung von 100 μm dicken Gewebequerschnitten mit einem Kryostat (Schritt 2) Und immunfluoreszierende Markierung und Montage (Schritte 3 und 4). Die repräsentativen Ergebnisse vergleichen konfokale Bilder von zwei verschiedenen histologischen Präparationstechniken - klassische Kryosektionierung und dickes 3D-Gewebequerschnitt - Hervorhebung der Vorteile von &quot;horizontalen Gesamtbefestigungen&quot; für den potentiellen Benutzer dieses Protokolls.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>Gelatin, from cold water fish skin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BDH Laboratory Supplies</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>VWR chemicals</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding molds</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Square S-22</td></tr><tr><td>Non-Fat Powdered Milk</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm Culture dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>pointed metal forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 Well plates</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul and 1000 ul Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;micro;l XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&amp;micro;l Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Rocking shaker plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Cover Glasses, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin

Die Verarbeitung eines Gewebes von Interesse, um ein mikroskopisches Bild zu erzeugen, das ein wissenschaftliches Argument unterstützt, kann eine Herausforderung sein. Der Erwerb qualitativ hochwertiger mikroskopischer Bilder hängt nicht ganz von der Qualität des Mikroskops ab, sondern auch von den Methoden der Gewebeverarbeitung, die oftmals mehrere kritische Handlungen oder Schritte beinhalten. Darüber hinaus stellen mesenchymale Zelltypen in der Haut und anderen Geweben eine neue Herausforderung für die Gewebepräparation und die Bildgebung dar. Hier präsentieren wir einen kompletten Prozess von der Gewebeernte bis zur Mikroskopie. Unsere Technik, die so genannte &quot;horizontale Vollmontage&quot;, ist eine, die Anfänger schnell beherrschen können und die Antigenkonservierung und -detektion in 60-300 μm-dicken Abschnitten mit einem Kryostaten abschneiden lassen. Abschnitte dieser Dicke bieten eine verbesserte Visualisierung der Gewebe-Mikroarchitektur in einer dreidimensionalen Umgebung. Darüber hinaus bewahrt das Protokoll mesenchymale Zellen in einer Weise, die die Bildqualität erhöht, wennVerglichen mit Standard-Kryostaten oder Paraffin-Abschnitten, wodurch die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit der Immunfärbung erhöht wird. Wir glauben, dass dieses Protokoll allen Laboratorien zugute kommen wird, die die Haut und möglicherweise andere Gewebe und Organe visualisieren.

Um die Vorteile unserer Technik zu unterstreichen, verglichen wir unsere dicke 3D-Gewebe-Querschnittstechnik, &quot;horizontale Ganzmontage&quot;, zu klassischen gefrorenen Abschnitten. Klassische gefrorene Schnitte wurden geschnitten , wie zuvor 5 beschrieben. Um eine visuelle Struktur für die Epidermis in mikroskopischen Bildern zu schaffen, immunostained für Integrin alpha-6 (Itga6), die eine Komponente ist, die epidermale Zellen an die darunterliegende Basalmembran 6 verankert. Wir haben auch den arrector pili muscle (APM) bezeichnet, der für die Piloerektion verantwortlich ist (auch bekannt als &quot;goosebumps&quot;), mit integrin alpha-8 7 . In den klassischen, gefrorenen Abschnitten wurden die meisten Haarfollikel, die mit Itga6 visualisiert wurden, nicht über die gesamte Länge geschnitten und erzeugten überwiegend unvollständige Haarfollikel pro Sektion, verglichen mit horizontalen ganzen Montierungen ( Abbildung 4a -4d </strong&gt;). Durch dicke Gewebequerschnitte können im Vergleich zu herkömmlichen 10-μm-Abschnitten mehr Z-Stack-Schichten gewonnen werden, was ein vollständigeres 3D-Bild ermöglicht. Dies wird noch deutlicher, wenn man die Integrität von APMs studiert, die mit den Haarfollikeln und der darüber liegenden Basalmembran assoziiert sind. In klassischen Kryosierungen wurde der große Teil der APMs fraktioniert ( Abbildung 4a -4d ). Zusätzlich wird die Gewebeintegrität des hypodermalen Kompartiments in horizontalen Gesamtbehältern bewahrt, verglichen mit der Zerstörung von Adipozyten, wenn Kryoschen an warme Glasscheiben angebracht sind, was ein wohlbekanntes Gefrier-Auftauen-Artefakt ist ( Abbildung 4a -b , vergleiche hypodermale Regionen) 8 . <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Abbildung 4. Horizontale ganze mouIm Vergleich zu einer klassischen Kryosektion. ( A ) Klassisch erhaltene Hautkryosäuren 10 μm dick und ( b ) 100 μm dicke 3D-Gewebequerschnitte wurden mit Integrin alpha-6 (Itga6) und Integrin alpha-8 (Itga8) markiert, um die epidermalen Kompartiment- und Arrektor-Pili-Muskeln zu visualisieren , beziehungsweise. Die Bilder der dicken Gewebequerschnitte sind als maximale Projektionen eines großen Z-Stapels dargestellt. Die weißen Rahmen zeigen die vergrößerten Bereiche an, die in ( c ) den klassischen und ( d ) horizontalen Vollmontageabschnitten angezeigt werden. ( E ) Intakte Haarfollikel und ( f ) intakte Arrektor-Pili-Muskeln wurden sowohl im klassischen als auch im horizontalen Ganzteil-Abschnitt quantifiziert. Maßstäbe zeigen 100 μm an. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt. Ein Abschnitt pro biologischer Replikat ( n = 3) wurde quantifiziert. Ungepaartes t-Test * P &lt;0,05, P &amp; lt; 0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar.

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

horizontal-whole-mount-novel-processing-imaging-protocol-for-thick

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.0K Aufrufe.  King's College London.  Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar. 

Serie: Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging organic materials with volumes up to 5 x 5 x 7 mm3 in typical numeric resolutions between 1 x 1 x 1 and 5 x 5 x 5 &#181;m3. Specimens are embedded in methacrylate resin and sectioned on a microtome. After each section an image of the block surface is captured with a digital video camera that sits on the phototube connected to the compound microscope head. The optical axis passes through a green fluorescent protein (GFP) filter cube and is aligned with a position, at which the bock holder arm comes to rest after each section. In this way, a series of inherently aligned digital images, displaying subsequent block surfaces are produced. Loading such an image series in three-dimensional (3D) visualization software facilitates the immediate conversion to digital volume data, which permit virtual sectioning in various orthogonal and oblique planes and the creation of volume and surface rendered computer models. We present three simple, tissue specific protocols for processing various groups of organic specimens, including mouse, chick, quail, frog and zebra fish embryos, human biopsy material, uncoated paper and skin replacement material.

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

We provide simple and robust protocols for processing biopsy material of various species, embryos of biomedical model organisms and samples of other organic tissues in order to permit digital volume data generation with the high-resolution episcopic microscopy method.

Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Medizin

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Neurowissenschaften

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Biotechnik

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Biologie

Verfolgung von Krankheitserregern im ganzen Organ durch Quantifizierung von fluoreszierenden Reportern

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der bakteriellen Reaktionen auf Antibiotika und Immunsystem in Geweben

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Zusammenfassung

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Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen