Diese Arbeit wurde mit der Unterstützung eines Zuschusses durchgeführt 5R21HD080684-02, aus dem National Institute of Child Health and Human Development. Der Autor bedankt sich bei Ken Cho für seine anhaltende Begeisterung und Unterstützung. Der Autor möchte auch Bruce Blumberg für die Verwendung seiner Kamera, Rebekka Charney, für die kritische Lesung der Handschrift, und Sean McNamara und Marcin Wlizla an der nationalen Xenopus -Ressource (RRID:SCR_013731), bestätigen für die wertvollen Gespräche über X. tropicalis Fütterung und Pflege der Tiere-Regimen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Verwendung von der University of California, Irvine genehmigt.
1. Vorbereitungen für PGC-Transplantation
<ol><li>Dissektion Werkzeuge als zuvor beschriebenen23im Voraus vorbereiten. Hinweis: Augenbrauen Haare Messer dienen dazu, Einschnitte mit Hilfe einer Haar Schleife um den Embryo zu stabilisieren, während der Durchführung der Operationen zu machen. Augenbrauehaare Haare Schleifen in Borosilikatglas Pasteur Pipetten, die zuerst in eine Flamme gezogen wurden eingeklebt und sind auf den ausgedünnten Teil gebrochen (siehe Abbildung 1A, Pfeilspitze) erstelle ich eine kürzere, schmalere Spitze (Abbildung 1 b) für größere Geschicklichkeit Wenn Operationen durchführen.</li>
	<li>SgRNAs mit Verfahren beschriebenen24 zu generieren. Hinweis: Kurz, kurze DNA-Templates, die Codierung für SgRNAs entstehen mit überlappenden Deoxyoligonucleotides mit 5' Bakteriophagen T7 Promotoren, die getempert werden und "ausgefüllt" durch eine fehlerfreie, thermostabile DNA-Polymerase. In-vitro- SgRNA Synthesereaktionen sind für mehrere Stunden (je nach dem Kit verwendet) über Nacht inkubiert. Reaktionen sind DNAse behandelt, um die Vorlage zu entfernen. Die SgRNAs sind durch Standardmethoden Phenol/Chloroform Extraktion und Ammonium Acetat/Isopropanol Niederschlag, nach der Kit-Hersteller Anweisungen24gereinigt.</li>
	<li>Kurz vor der Durchführung Mikroinjektionen, bereiten Cas9-SgRNA-komplexe durch erste denaturierenden ~ 250 ng der SgRNA in einem Gesamtvolumen von 3 µL RNAse-freie (Diethylpyrocarbonate-behandelt) H2O bei 60-65 ° C für 5 min, gefolgt von schnellen Kühlung für 5 min auf Eis. Zentrifugieren Sie die SgRNA für ein paar Sekunden, fügen Sie 1 µL 1 µg/µL Cas9 Eiweiß hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei 37 ° C, Komplexbildung zu fördern. Hinweis: Im Anschluss an diese Inkubation kann das Rohr auf Eis gehalten werden, während der Vorbereitung der Embryonen für die Mikroinjektion.</li>
	<li>X. tropicalis Embryonen durch in-vitro- Befruchtung mit Standardmethoden, wie zuvor beschrieben25zu erhalten. De-Gelee25,26 die Embryonen im 10 min nach Befruchtung. Hinweis: Befruchtung Zeit gilt die Zeit nach die Sperma-Suspension mit den Eiern hinzugefügt wird und die Schüssel überschwemmt mit 1/9thX ist Marcs geändert Klingeltöne (MMR)26. Für X. tropicalis25, im Gegensatz zu laevis, führen Sie die de-Gelier-in 1/9 X MMR mit 3 % Cystein freie Base (nicht das HCl-Salz), pH 7,8-8,0 angepasst folgten mehrere Wäschen in 1/9 X MMR. Transfer der Embryonen nach einer Agarose (1 %)-beschichtete Schale mit 1/9 X MMR bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sofortüberweisung die Embryonen injiziert werden, um eine 1 % Agarose-beschichtete Schale mit 1 X MMR mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>
Spritzen Sie im 1-Zell-Stadium. Siehe Referenzen26,27 für detaillierte Beschreibungen der Xenopus Mikroinjektion Methoden.
	<ol>
<li>Jeder Embryo an einem einzigen Standort in der Tier-Pole, mit 4 Spritzen nL Cas9-SgRNA-Komplex (Endbetrag = 1 ng von Cas9 und ~ 250 Pg SgRNA; siehe die Diskussion)24. Nach 10-20 min der Injektion Website Heilung, transfer der Embryonen zu einer Agarose-beschichtete Schale mit 1/9 X MMR und inkubieren Sie bei 25 ° C. Auch erstellen Sie eine Schüssel mit uninjected Geschwister Embryonen, die als Transplantat-Empfänger dienen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie Petri Platten (60 mm), die enthalten eine ~ 5 mm-dicke Schicht von 1 % Agarose in 0,3 gemacht X MMR, wenn Transplantationen in X. tropicalisoder 1 X MMR für laevis.
	<ol>
<li>Erstellen Sie Depressionen ~ 3-4 mm tief durch das Einfügen eines 3-x 4-Well Schimmel (erstellt durch das Schneiden einer 96-Well-PCR-Platte) in der geschmolzenen Agarose, wenn die Platten Gießen (siehe Abbildung 1 und D). Halten Sie die Form einige Millimeter über dem Boden der Petrischale mit einer Schelle befestigt an einem Ring-Ständer, bis die Agarose verhärtet hat.</li>
		<li>Stellen Sie außerdem eine 24-Well-Platte zu Haus einzelnen Embryonen durch die Beschichtung der Brunnen mit einer dünnen Schicht von 1 % Agarose Baujahr 1/9 X MMR. Hinweis: Das Kulturmedium hinzugefügt, um diese Brunnen ist 1/9 X MMR mit 50 µg von Gentamycin Sulfat/mL ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transplantation von PGCs
<ol><li>Wenn die Embryonen erreichen nur Nieuwkoop und Faber28 Blastozystenstadium 9 (Abb. 2A), ~4.5-h nach Befruchtung (hpf) für X. tropicalis, entfernen Sie sie aus dem Inkubator 25 ° C und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur für eine zusätzliche equilibrate 0,5 h.</li>
	<li>Die Transplantation bei 5 beginnen hpf (Abb. 2 b), mithilfe einer Pasteurpipette eine PGC-Spender-Embryo (injiziert mit Cas9-SgRNA) übertragen, die 60 mm-Agarose-Schale mit Depressionen (erstellt in Schritt 1,7) in 0,3 X MMR (oder 1 X MMR wenn laevisverwenden). Auch ein uninjected Geschwister Embryo, der Transplantat-Empfänger, um dieses Gericht zu übertragen. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Identität eines jeden dieser Embryonen nicht verwechselt werden.</li>
	<li>Manuell entfernen Sie die Dotterhäutchen Umschläge von jedem Embryo mit Pinzette und drehen Sie beide Embryonen zu, so dass ihre Vegetal Pfosten in Ansicht und für Chirurgie zugänglich sind. Hinweis: Eine Beschreibung der manuellen de-Vitellination von Embryonen wurde zuvor beschriebenen26.</li>
	<li>Mit der scharfen Spitze eine Augenbraue Haare Messer, stellen Sie vier flache Einschnitte in der Form eines Quadrats auf den Vegetal Pfosten des Empfängers Embryos innerhalb der Zone, wo zukünftige Flasche Zellen, die die Blastopore markieren bilden werden. Stellen Sie die Einschnitte durch die Spitze des Messers Augenbrauen Haare in den Embryo, knapp unterhalb der Oberfläche, und stellen nach oben schneiden Bewegungen während der Stabilisierung des Embryos mit der Haar-Schleife einfügen. Hinweis: Abbildung 2 zeigt pflanzliche Ansichten eines Embryos im Halbstunden-Takt von 4,5-7,0 hpf, die Zellengröße zu zeigen und bieten eine Anleitung für die Schätzung, wo die Flaschen-Zellen (gestrichelte weiße Kreis) bilden werden. Das Ziel ist es, Einschnitte zu machen, wo die gestrichelte Black-Box angezeigt.</li>
	<li>Sobald die vier Seiten des Platzes durch Ritzlinien abgegrenzt sind, vertiefen Sie jeder Schnitt mit dem Augenbrauen Haare Messer mit ähnlichen schneiden Bewegungen um zu eine Tiefe von ca. 1/3 bis 1/2 der Abstand zum Blastocöl Boden zu erreichen.</li>
	<li>Frei von pflanzlichen Gewebe Explant vom Empfänger Embryo (Abbildung 3A und B) indem man eine horizontale (parallel zur pflanzlichen Oberfläche) Cut(s) in der Tiefe pflanzlichen Region. Hinweis: Die Größe der PGC-haltigen pflanzlichen Explant ist ca. 0,4-0,45 mm pro Seite und 0,25-0,3 mm in die Tiefe. Diese pflanzlichen Explant vom Empfänger Embryo wird nicht mehr benötigt und daher aufzuheben verworfen werden.</li>
	<li>Arbeiten schnell, wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 2.4-2.6) auf der PGC Spender Embryo um ein Fragment der ähnlich großen pflanzlichen Gewebe für Transplantationen zu erstellen. Hinweis: Es ist wichtig für die Durchführung dieser zweiten Dissektion mit etwas Verspätung zur Minimierung der Zeit für den Empfänger Embryo um seine Wunde zu heilen.</li>
	<li>Sobald das Gewebe mit PGCs vom Spender Embryo entfernt wird, verwenden Sie die Augenbrauen Haare Messer und Haar Schleife dieser modellabhängigen in Position in die im Empfänger Embryo entstandene Öffnung bewegen. Hinweis: Die innere Oberfläche des Transplantats Spender muss das Innere des Empfängers Embryos zeigen. Es ist nicht notwendig, entsprechend die Leitlinien der dorsal-Ventral und rechts-links-Achse des Transplantats mit dem Empfänger Embryo.</li>
	<li>Das Transplantat in die Öffnung in der pflanzlichen Oberfläche des Empfängers Embryos sanft drücken Sie mit der langen Kante des Schachtes der Augenbraue Haare Messer, statt parallel zur Oberfläche des Transplantats.</li>
	<li>Sobald das Transplantat gelegt wurde, verwenden Sie eine Hairloop oder die Welle eine Augenbraue Haare Messer um zu schieben "Rohbau" des Embryos Spender über die Agarose-Oberfläche und in einer Agarose-Depression. Stellen Sie sicher, dass die offene Wunde der Karkasse die Masse Flüssigkeit gegenübersteht. Wenn dies nicht der Fall ist, verwenden Sie die Augenbrauen Haare Messer um zu drehen, den Embryo um diese Ausrichtung zu erreichen.</li>
	<li>Schieben Sie den Empfänger Embryo mit der Transplantation Heilung im Ort, in einem angrenzenden Depression und ebenso darauf achten Sie, dass das veredelte Vegetal Pole Gewebe die Masse Flüssigkeit gegenübersteht.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 2.1-2.11) über ein weiteres paar von Spender und Empfänger Embryonen erstelle ich eine weitere Transplantation/Karkasse paar; übertragen Sie diese zu leeren Depressionen. Hinweis: Es ist wichtig, dass man Notationen zu behalten paarweise von Schlachtkörpern und Transplantation tragenden Embryonen macht. Die Spender-Kadaver werden als Proxy verwendet werden, für die Effizienz der Cas9-SgRNA-induzierte Mutagenese in den transplantierten PGCs, die leicht untersucht werden kann nicht, bis die Transplantation tragenden Tiere die Geschlechtsreife erreichen (s.u. Schritt 3.3, und die Diskussion ).</li>
	<li>Weiter Transplantationen zu machen, bis die Embryonen etwa frühen Gastrula-Stadium 10, erreichen die etwa 6,5 hpf in X. tropicalis (siehe Abbildung 2E).</li>
</ol>3. Post-Heilung Pflege von Embryonen
Hinweis: Transplantationen heilen innerhalb von ~ 30 min einrastet, und es ist normal, dass einige yolky Trümmer aus Zelle Lysis strahlt aus dem Embryo (Abbildung 3) zu beobachten.
<ol><li>
Sobald geheilt, verwenden einer Pasteurpipette sehr sanft Transfer Embryonen aus den Vertiefungen zu einzelnen Wells eine Agarose-beschichteten 24-Well-Platte. Das Exsudat werden (Abbildung 3D) durch Flüssigkeit mischen während der Übertragung entfernt.
	<ol>
<li>Drehen Sie die Embryonen, so dass sie pflanzliche-polig, mit Blick auf die Bulk-Lösung gelegt werden. Wieder, legen Sie die Spender-Kadaver und Transplantat-Empfänger im benachbarten Brunnen, bei der Verfolgung der Embryo Paare; Zeichnen Sie diese Informationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die 24-Well-Platte mit Embryonen bis 25 ° C-Inkubator für Übernachtung Kultur. Hinweis: Am nächsten Tag die Embryonen werden Tailbud Stufen erreicht haben.</li>
	<li>Verschieben Sie die Transplantat-Empfänger zu reinigen Agarose-beschichteten 6-Well-Platten mit 1/9 X MMR mit 50 µg von Gentamycin Sulfat/mL, mit 1 Embryo pro Bohrloch ergänzt. Pflegen Sie einen klaren Datensatz der Spender Schlachtkörper, die diese entsprechen Transplantat-Empfänger.</li>
	<li>Bewerten Sie Mutagenese Effizienz durch Sequenzierung PCR Amplifikate5,17,24 oder mit anderen Methoden, die auf PCR Amplifikate verlassen (siehe Diskussion), bewegen Sie einzelne Schlachtkörper nach 0,2 mL PCR-Streifen Röhren Entfernen Sie die meisten des Mediums und homogenisieren in 100 µL Lyse Puffer24 mit Proteinase K (PK) durch wiederholte wechselvollen Pipettieren mit einer Pipette P200.</li>
	<li>Führen Sie Embryo Lyse24 bei 56 ° C für 6 h über Nacht um PK Verdauung zu ermöglichen. PK zu inaktivieren, durch Erhitzen auf 90-95 ° C für 10 min, gefolgt von schnellen Abkühlung auf 4 ° C. Verwenden Sie Lysates ohne weitere Bereinigung Schritte der PCR-Reaktionen zu kurzen Amplifikate für direkte DNA Sanger-Sequenzierung24säen. Speichern der Lysates bei-20 ° C. Hinweis: Innerhalb von einigen Tagen die Kaulquappen erreichen Fütterung Stadien (etwa Stufe 45-46) und eine Aussetzung der planktonischen Pulver (Sera Micron) eingespeist werden können.</li>
	<li>Bewegen Sie nach ~ 1 Woche mit täglichen Änderungen Kulturmedium Sauberkeit und mikrobielle Überwucherung zu minimieren Kaulquappen zu kleinen Tanks in einer zirkulierenden aquatischen System mit Tropf-Fluss. Verwenden Sie die Sequenzierungsdaten Kaulquappen mit hocheffizient mutagenisierter PGCs von Kaulquappen mit geringerer Mutagenese Effizienz zu trennen. Sobald die Metamorphose abgeschlossen ist, die Froglets zum Bewegen der Erwachsenen aquatischen Systems im Labor Hinweis: Therapien entwickelt, von der nationalen Xenopus -Ressource (Marine Biology Laboratory Woods Hole, MA) bieten einen Leitfaden für Kaulquappe Fütterung29 und Erwachsenen Frosch Wartung30.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

Der Autor hat nichts preisgeben.

Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von pflanzlichen Gewebe mit PGCs. Transplantation PGCs in Verbindung mit Genom-Bearbeitung Technologien (z. B. CRISPR/Cas9) verwendet, um die Keimbahn ändern eines Tieres während fast alle seiner somatischen Gewebe aufrechtzuerhalten als genetisch Wildtyp. Für Leap Frogging um erfolgreich zu sein, gibt es eine Reihe von kritischen Faktoren, die vor der Durchführung darstellender Transplantationen.
Um den ...

Wie Genotyp Phänotyp kodiert wurde eine wichtige Frage in der Biologie seit der Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln. Ein Verständnis für die Rolle der Gene, deren Regulation und Interaktionen innerhalb von Gen-Netzwerken und die Funktionen der codierte Produkte versprechen die Werkzeuge für Aufdeckung neue Biologie und bessernde Krankheitszustände. Mehr als die Hälfte ein Jahrhundert1seit der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, eine führende Modell für Studien zu den unterschiedlichsten Themen in grundlegende Biologie und Biomedizin, einschließlich die genetische Kontrolle der Entwicklung. Historisch hat die meiste Forschung auf Xenopus Allotetraploid Frosch, laevis, verwendet aber in jüngerer Zeit, aufgrund seiner Diploidie X. tropicalis wurde entwickelt als Amphibien genetisches Modell. Vollständige Genomsequenzen sind von beiden Xenopus Arten2,3zusammengestellt. Die "Frog-Community" ist jetzt an einem Wendepunkt angelangt wo ermöglicht grundlegende Genom Änderung Technologie das Studium der Genfunktion, praktisch nach Belieben. Programmierbare CRISPR/Cas9 jedoch haben die Mutagenese von Genen hocheffizient mit biallelische Mutationen möglich in den meisten Zellen der Tier4,5,6,7gemacht, 8,9,10,11. Diese Studien, untermalt von Bhattacharya Et al. 12 und Shigeta Et al. 13, haben gezeigt, dass die Funktion vieler Gene durch Mutagenese in F0 Mosaik Tiere untersucht werden kann. Dieser Ansatz hat viele Vorteile; Cas9-SgRNA-mikroinjiziert Embryonen werden jedoch oft Variable Phänotypen aufgrund unvollständiger Funktionsverlust (LOF) angezeigt. Noch bedeutsamer ist, die Generation der mutierten Linien ist ein großer Vorteil für einige Anwendungen – insbesondere bei der Gene, die einen mütterliche mRNA-Beitrag zu studieren. Mütterliche mRNAs und Proteine und ihre Einflüsse auf die Epigenetik, bleiben über einen längeren Zeitraum in Embryogenese14,15,16, Darstellung der frühen Entwicklungsstörungen Beiträge vieler Gene feuerfeste F0 Analysen. Daher sind andere LOF Ansätze erforderlich.
Bei der Suche nach mutierten Linien zu erstellen, muss der Pfad auf die Erlangung von homozygot LOF Embryonen mehrere Hindernisse. Erste, effiziente Mutagenese biallelische Mutationen produzieren kann nachteilig sein, weil Verlust von wesentlichen Genfunktionen scheitern, Geschlechtsreife, stören die Herstellung einer tragfähigen Linie überleben führt. Eine gemeinsame Lösung ist die sorgfältige Titration der Höhe der Cas9-SgRNA geliefert. Hier ist das Ziel, ein Gleichgewicht zwischen reduziert Letalität bei gleichzeitiger Maximierung der Keimbahn Mutagenese Effizienz auch. Ein zweites Problem ergibt sich aus der standard Zucht-Schema, wo phänotypische Analysen bis F-2 -Generation aufgeschoben. Mit dem standard-Ansatz, sexuell Reifen Sie F0 Tiere, die Mutante zu übertragen, die Allele durch die Keimbahn outcrossed sind zur Herstellung F1 heterozygote "Träger", die dann zur Geschlechtsreife angebaut werden. Zwei F-1 -heterozygot sind dann intercrossed, um F2 mutierten Embryonen mit einer erwarteten Mendelian Frequenz von 25 % zu produzieren. So sind zwei Generationen der Zucht notwendig für die Analyse der Mutanten Phänotypen. Mutierte Tiere könnte entweder homozygoten oder compound-heterozygot (d. h. nachkommen, enthält zwei verschiedene mutierten Allele, die abhängig von der Genotypen der Elterntiere in der F1 Intercross verwendet).
Diese Hindernisse können überwunden werden, durch die Beschränkung programmierbare Nuklease-vermittelten Mutagenese, Keimzellen, die eine neue Methode namens sprunghaften17zugrunde liegt. Leap Frogging besteht aus zwei Hauptkomponenten: (1) die Mikroinjektion von Cas-mRNA zusammen mit SgRNA oder Nuklease-SgRNA-komplexe (oder, im Prinzip, TALENs oder Zink-Finger-Nukleasen) Zeitpunkt der einzelligen effizient embryonale Genom mutagenize, gefolgt von (2) die Transplantation von PGCs auf Wildtyp Geschwister Embryonen, wo die endogenen PGCs entfernt wurden. Wenn beide Schritte sind effiziente und vollständige Keimbahn-Ersatz mit mutierten Keimzellen erhalten. Blackler bewiesen in den frühen 1960er Jahren, dass Xenopus PGCs zwischen den Embryonen im späten Neurula und frühen Tailbud Stufen18,19transplantiert werden konnte. Für Leap Frogging, wurde Blacklers Ansatz modifiziert durch Ausführen der Transplantationen im Blastozystenstadium Stufe17, wenn PGCs im Vegetal Pol der Embryo20,21lokalisiert sind. Transplantation vor Gastrulation hat zwei wesentliche Vorteile. Zunächst fand das Engraftment Transplantationen und die anschließende normale Entwicklung effizienter sein, wenn die Transplantation im Blastozystenstadium (unveröffentlichte Beobachtungen) durchgeführt wird. Zweitens durch Blastozystenstadium Transplantationen durchführen, kurz nachdem zygotic Transkription begonnen hat, vermeiden man die Letalität aus Entwicklungsstörungen Gen-Mutationen, die Gastrulation oder das stören sonst zu fehlerhaften späten Neurulae führen. PGC Transplantation-Lager ("leapfrogged") Embryonen sind gewachsen, Geschlechtsreife und Intercrosses zwischen diesen F0 Tieren haben gezeigt, dass in vielen Fällen 100 % der F-1 -Nachkommen den LOF-Phänotyp (die meisten werden zusammengesetzte anzeigen Heterozygoten), komplette Keimbahn Ersetzung durch gezielte Mutationen angibt.
Es wird erwartet, dass Leap Frogging gentechnische Ansätze im Xenopusbeschleunigen wird. Leap Frogging bietet auch eine Alternative zu den "host-Transfer" Methode22 für die LOF-Analyse von Genen mütterlicherseits-Effekt (unveröffentlichte Beobachtungen). In der aktuellen Publikation präsentiert eine detaillierte Beschreibung der Methode, vor allem mit Schwerpunkt auf PGC Transplantation, in X. tropicalis (mit geringfügigen Änderungen für laevis). Die Transplantation von PGCs beweist hier um einen schnelleren Transfer dieser Technologie an andere Laboratorien arbeiten mit Xenopuszu erleichtern. Die Prinzipien dieser Methode sollte erfolgreich in anderen Amphibien (z.B. Urodeles) und Organismus-spezifische Änderungen in der Methodik dürfen für die Anwendung auf vielen anderen Tieren, die in der effizienten Mutagenese erreicht werden kann und PGCs sind leicht transplantierbaren.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

Die Schaffung von mutierten Linien von Genom-Bearbeitung beschleunigt genetische Analyse in vielen Organismen. CRISPR/Cas9 Methoden wurden für den Einsatz in der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, langjährige Modellorganismus für die biomedizinische Forschung angepasst. Klassische Züchtung Regelungen für die Erstellung von homozygoter Mutante Linien mit CRISPR/Cas9-gezielte Mutagenese haben mehrere zeitaufwändige und mühsame Schritte. Zur Erleichterung der Schaffung von mutierten Embryonen, besonders um die Hindernisse, die Gene, die für die Embryogenese, ausschlagen zugeordnet wurde eine neue Methode namens Leap Frogging entwickelt. Diese Technik nutzt die Robustheit des Xenopus Embryonen "Ausschneiden und einfügen" embryologischen Methoden. Leap Frogging nutzt die Übertragung der primordialen Keimzellen (PGCs) aus effizient mutagenisierter Spender Embryonen in PGC abgetragen Wildtyp Geschwister. Diese Methode ermöglicht die effiziente Mutation des wesentlichen Gene durch die Schaffung von Chimären Tiere mit Wildtyp-Körperzellen, die ein mutiertes Keimbahn tragen. Wenn zwei F0 Tiere tragen "leapfrog Transplantationen" (d. h. mutierten Keimzellen) sind intercrossed, sie produzieren homozygote oder compound heterozygote, null F1 Embryonen, spart eine ganze Generationszeit, phänotypische Daten zu erhalten. Leap Frogging bietet auch einen neuen Ansatz für die Analyse von mütterlicher Effekt Gene, die refraktär gegenüber F0 phänotypische Analyse nach CRISPR/Cas9 Mutagenese sind. Dieses Manuskript beschreibt die Methode der Leap Frogging, mit besonderem Schwerpunkt auf PGC Transplantation erfolgreich durchführen.

Nach Transplantation sollte die qualitative Bestimmung der Wirksamkeit von CRISPR/Cas9 Mutagenese vor Aufwendung den Aufwand bei der Tierhaltung zu wachsen und pflegen die Tiere zur Geschlechtsreife durchgeführt werden. Weil Tiere tragen Leapfrog Transplantationen somatisch Wildtyp sind und Keimbahn für direkte Messungen schwer zugänglich ist, wird das speichern die Kadaver von Spender-Embryonen wichtig. DNA-Analyse aus Kadavern dient als Proxy für den Umfang der Mutagenese, die in de...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Aufrufe.  University of California, Irvine. Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Serie: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genetik

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologie

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Zusammenfassung

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Manipulation und

Stammzell-ähnlichen

Functional Cloning Mit ein