Name: application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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Wir danken Dr. Giulio Di Minin für die Ableitung von phaESC-Linien und Dr. Remo Freimann für den Durchflusszytometriebetrieb. Wir würdigen auch Frau Michéle Schaffner und Herrn Thomas M. Hennek für die technische Unterstützung bei der Embryoübertragung. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Stipendium 31003A_152814/1).

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Klonen von Säugetieren durch somatische Zellkernübertragung (SCNT) wurde in den 1990er Jahren19,20,21entwickelt. Diese Entwicklungen folgten Klonstudien, die 30 Jahre zuvor bei Amphibien durchgeführt wurden22. Die erhebliche Verzögerung spiegelt die Schwierigkeit der Embryologie und der genomischen Prägung bei Säugetieren wider. Die Entwicklung von Säugetier SCNT ist die Grundlage für die Anwendung von haESC für die Substitution von Spermien, die in diesem Protokoll detailliert ist.
Die Zellzyklussynchronisierung ist ein wichtiger Erfolgsfaktor von SCNT23. Dies gilt auch für die Injektion von haESC in diesem Protokoll. Die Einführung eines Spendergenoms in einen Empfänger erfordert, dass die Zellzyklusphasen angepasst werden, um Chromosomenbrüche oder Aneuploidien zu vermeiden, die die Embryoentwicklung abbrechen würden. Semi-Klonen hat die zusätzliche Komplexität, dass zwei Genome und ein Zytoplast kompatibel sein müssen. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass die Injektion von M-Phasen-verhafteten androgenetischen HaESCs bessere Entwicklungsraten von halbgeklonten Embryonen ergab als die Injektion von G1-Phasen-HaESCs in Eizellen7. Dieser Bericht schlägt M-Phase als geeigneten Synchronisationspunkt für das Halbklonen vor. Dementsprechend wurden PhaESCs in Metaphase mit Demekolumcin mit zitotisch verhaftet und in das Ooplasma von MII-Oozyten injiziert, die natürlicherweise in Metaphase II der Meiose verhaftet wurden. Wichtig ist, dass die M-Phasen-Absicherung in Maus-ESCs mit hoher Effizienz erreicht werden kann, was eine hervorragende Synchronisation zwischen Spender- und Empfängerzellzyklen ermöglicht.
Während der Mitose bricht die Kernmembran zusammen und eine Spindel bildet sich, an der sich die replizierten Chromosomen anheften. Nach Der Injektion von M-Phase DKO-phaESCs werden Schwesterchromatide in einen pseudopolaren Körper und die Zygote7 (Abbildung 3E) getrennt. Folglich trägt ein einziger Chromosomensatz aus einem DKO-phaESC zum halbgeklonten Embryo bei. Es ist wichtig, dass die Schwesterchromatiden der DKO-phaESC-Chromosomen nach der Injektion korrekt segregiert werden können. Die Plasmamembran eines intakten DKO-phaESC verhindert die Segregation in einen pseudopolaren Körper. Wir beobachteten in der Tat seltene Fälle, in denen die Plasmamembran von DKO-PhaESCs nicht gebrochen wurde und Embryonen intakte DKO-PhaESCs im Ooplasma nach der Injektion zeigten (Abbildung 3D). Daher ist darauf zu achten, dass die Plasmamembran von DKO-phaESCs durch Pipettieren entfernt wird. Während der Injektion ist es ebenso wichtig, die Störung der meiotischen Spindel der Oozyte zu vermeiden, die zu Chromosomensegregationsdefekten führen und auch Aneuploidie auslösen könnte.
Bei Säugetieren schränkt die genomische Prägung die Anwendung von PhaESCs als Spermienersatz ein. Parthenogenetische HaESCs besitzen eine mütterliche Konfiguration genomischer Abdrücke, während Spermien eine väterliche Konfiguration besitzen. Daher ist die Erzeugung von Vollzeitwelpen nach der Injektion von Wildtyp-PhaESCs als Spermienersatz nicht aufgetreten. Um diese Einschränkung zu überwinden, werden Löschungen der IG-und H19-DMRsin phaESCs entwickelt. Die Modifikation der eingeprägten Expression an den mütterlichen LocI Igf2-H19 und Gtl2-Dlk1 ist ausreichend, um die Konfiguration genomischer Abdrücke zu ändern, um die Erzeugung von halbgeklonten Mäusen mit einer Häufigkeit von über 5,1% auf der Grundlage übertragener 2-Zellen-Embryonen zu ermöglichen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Ausrichtung auf zwei aufgedruckte Gene das Genom von PhaESCs in eine funktionelle väterliche Konfiguration verwandelt, die Spermien in Mäusen ersetzen kann. Dennoch ist für diese Strategie eine permanente genetische Veränderung der PhaESCs erforderlich. Als alternative Strategie kann androgenetischehaESC in Betracht gezogen werden. Androgenetische HaESCs stammen aus dem Spermagenom und besitzen väterliche Abdrücke. Es gab Berichte, dass Wildtyp androgenetische HaESCs als Spermienersatz dazu beitrugen, Vollzeitwelpen in einer Häufigkeit zwischen 1,3% und 1,9% der übertragenen Embryonen4,7,24zu erzeugen. Vollzeit-Welpen wurden auch durch Injektion androgenetische haESCs mit Deletionen der IG- und H19-DMRs in einer Häufigkeit von 20,2% der übertragenen 2-Zell-Embryonen24erhalten. Die erhöhte Effizienz des Semiklonens mit modifizierten androgenetischen HaESCs ist wahrscheinlich, weil Abdrücke in der Kultur instabil werden können. Aufdruckfehler werden durch die genetischen Löschungen kritischer DMRs korrigiert.
Angesichts der Schwierigkeit, genetische Veränderungen direkt in die Eizellen- oder Spermiengenome einzuführen, sind haESCs ein wertvolles Werkzeug, um die elterlichen Genome getrennt zu manipulieren. Die Verwendung von haESCs als Spermaersatz bietet einen bemerkenswerten Vorteil für die Genombearbeitung in der Mauskeimbahn. Eine aktuelle Studie hat CRISPR/Cas9-basierte Genombearbeitung mit der Anwendung von haESCs zur Charakterisierung von Prägungsregionen kombiniert, die für die embryonale Entwicklung entscheidend sind12. Diese Studie analysierte die Rolle der Rasgrf1-DMR in Kombination mit den H19-und IG-DMRsbei der Entwicklung von bimaternalen Mäusen und die Funktion von 7 verschiedenen DMRs bei der Entwicklung von bipaternalen Mäusen. Die Methode zur Substitution von HaESCs für Spermien bildete die Grundlage für genetische Screening-Ansätze zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren innerhalb des DND1-Proteins in der Entwicklung von Urkeimzellen und zur Identifizierung von Genen in der Knochenentwicklung24,25,26. Studien über genomische Prägungen und genetisches Screening zur Identifizierung von Schlüsselfaktoren in der embryonalen Entwicklung sind beträchtliche Ansätze für die Anwendung von haESCs als gametische Genome.

Bei Säugetieren sind Gameten die einzigen Zellen, die genetische Informationen an die nächste Generation übertragen. Die Fusion einer Eizelle und eines Spermatozoons bildet eine diploide Zygote, die sich zu einem erwachsenen Tier entwickelt. Mutationen in gametischen Genomen werden dabei von den Nachkommen vererbt und treiben die genetische Variation in Art1voran. Die Einführung von Mutationen in der Keimbahn wurde angewendet, um genetisch veränderte Tiere für verschiedene biologische Studien zu produzieren, einschließlich der Charakterisierung der Genfunktion und der Krankheitsmodellierung. Sowohl Eizellen als auch Spermatozoen sind endlos differenzierte und hochspezialisierte Zellen, die ihre Proliferation eingestellt haben. Daher ist die direkte Modifikation von Gameten technisch schwierig, und es wurden spezielle Ansätze entwickelt. Genetische Veränderungen können durch Injektion genetisch veränderter ESCs in Blastozysten in die Mauskeimbahn eingeführt werden, wo sie sich in den sich entwickelnden Embryo integrieren und die Keimbahn besiedeln. Darüber hinaus hat sich die genetische Veränderung von Zygoten mit Genom-Editing-Ansätzen, einschließlich des CRISPR/Cas9-Systems, weit verbreitet2.
Kürzlich wurde ein hervorragender Ansatz berichtet, der haESCs als Ersatz für ein gametisches Genom3,4,5,6,7,8anwendet. HaESCs sind Stammzelllinien, die aus der inneren Zellmasse parthenogenetischer oder androgenetischer haploider Blastozysten abgeleitet sind und einen einzigen Satz chromosomen4,7,9,10besitzen. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl parthenogenetische als auch androgenetische HäSchen zum Genom von halbgeklonten Mäusen nach intrazytoplasmatischer Injektion in Eizellen beitragen können. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen können die Genome von haESCs aufgrund ihrer Selbsterneuerungskapazität direkt in der Kultur verändert werden. Die Einführung genetischer Veränderungen in die Keimbahn durch den Ersatz von Spermien durch haESCs ist eine wichtige Methode für biologische Studien. Es sieht die Möglichkeit vor, das mütterliche oder väterliche Genom, das aus parthenogenetischen bzw. androgenetischen HaESCs abgeleitet ist, getrennt zu kulturieren und zu manipulieren. HaESCs können dann als gametischer Genomersatz verwendet werden, was besonders für Studien zu genomischen Prägungen, allelespezifischer Expression und elterlichen spezifischen Prozessen von Vorteil ist.
Bei Mäusen sind sowohl mütterliche als auch väterliche genomische Informationen für die normale Embryoentwicklung erforderlich11. Daher konnten keine Vollzeitwelpen gewonnen werden, wenn wildtypparthenogenetische HaESCs (PhaESCs) injiziert wurden, um das Spermagenom5,8zu ersetzen. Um den Entwicklungsblock zu überwinden, muss die genomische Prägung des mütterlichen Genoms von parthenogenetischen HaESCs zu einer väterlichen Konfiguration korrigiert werden. Dies kann durch Manipulation der differenziell methylierten Regionen (DR) erreicht werden. Bis heute wurden gezielte Löschungen der H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR und Rasgrf1-DMR untersucht, um mütterlich exprimierte Gene in phaESCs3,5,8,12zu unterdrücken. Diese Studien zeigten, dass Deletionen sowohl der H19-DMR als auch der IG-DMRausreichen, um eine mütterliche in eine väterliche Abdruckkonfiguration umzuwandeln, die Spermienchromosomen ersetzen kann. Die intrazytoplasmatische Injektion von PhaESCs, die die beiden DMR-Deletionen in Eizellen tragen, ergab halbklonierte Welpen mit einer Häufigkeit zwischen 5,1% und 15,5% der übertragenen 2-Zellen-Embryonen.
Dieses Protokoll basiert auf der Anwendung von phaESCs mit Löschungen von H19-DMR und IG-DMR, die wir Double-Knockout-PhaESCs (DKO-phaESCs) bezeichnen. Wir geben detaillierte Anweisungen für die Modifikation der genomischen Prägung in phaESCs zur Etablierung von DKO-phaESC-Linien, zur Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen als Ersatz für ein Spermagenom, für die Kultur von halbgeklonten Embryonen in Blastozysten und für die Gewinnung von halbgeklonten Mäusen. Dieses Protokoll ist eine Referenz für Forscher, die eine präzise und direkte Manipulation des väterlichen Genoms und die Erzeugung von halbgeklonten Embryonen und Mäusen erfordern.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

In Organismen mit sexueller Fortpflanzung sind Keimzellen die Quelle totipotenter Zellen, die sich zu neuen Individuen entwickeln. Bei Mäusen erzeugt die Befruchtung einer Eizelle durch ein Spermatozoon eine totipotente Zygote. Kürzlich haben mehrere Veröffentlichungen berichtet, dass haploide embryonale Stammzellen (haESCs) ein Ersatz für gametische Genome sein und zu Embryonen beitragen können, die sich zu Mäusen entwickeln. Hier stellen wir ein Protokoll zur Anwendung parthenogenetischer HaESCs als Ersatz für Spermien vor, um Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion in Eizellen zu konstruieren. Dieses Protokoll besteht aus Schritten zur Vorbereitung von haESCs als Spermienersatz, zur Injektion von haESC-Chromosomen in Eizellen und zur Kultur halbgeklonter Embryonen. Die Embryonen können nach dem Embryotransfer fruchtbare halbgeklonte Mäuse hervorbringen. Die Verwendung von haESCs als Spermienersatz erleichtert die Genombearbeitung in der Keimbahn, Studien zur embryonalen Entwicklung und die Untersuchung genomischer Prägung.

Ziel dieses Protokolls ist es, haESCs als Ersatz für Spermien anzuwenden, um halbgeklonte Embryonen und Mäuse zu erhalten. Zu diesem Zweck wurde eine DKO-phaESC-Leitung mit dem CAG-EGFP-Transgen erzeugt und zur intrazytoplasmatischen Injektion in MII-Oozyten verwendet. Um eine geeignete phaESC-Linie mit einer väterlichen Abdruckkonfiguration zu erhalten, haben wir Gentechnik mit Cas9-Nukleasen durchgeführt. Eine haploide ESC-Linie enthält haploide und diploide Zellen, die aufgrund einer inhärenten Tendenz von haploiden ESCs zur Diploidisierung10entstehen. Ein haploides Chromosom-Set ist eine Voraussetzung für einen erfolgreichen Ersatz des Spermagenoms. Die DNA-Gehaltsanalyse mittels Durchflusszytometrie zeigt die Verteilung von haploiden und diploiden Zellen in G0/G1-, S- und G2/M-Phasen (Abbildung 2A).
Zur Festlegung der DKO-phaESC-Linien wurden Wildtyp-PhaESC-Linien mit piggyBac-Transposonkonstrukten für stabile transgene EGFP-Expression und mit CRISPR/Cas9-Plasmiden zur Erlangung von Deletionen der H19-und IG-DMRs transfiziert. Um diploide ESCs auszuschließen und nur haploide ESCs zu isolieren, die EGFP exdrücken, wurde ein spezifisches Sortiergate definiert (Abbildung 2A). Einzelne haploide EGFP-positive Zellen wurden dann in einzelne Brunnen von 96-Well-Platten einbeschichtet, um Subklone zu erhalten. MEF-Feeder wurden verwendet, um die Beschichtungseffizienz und das Überleben der transfäften PhaESCs zu erhöhen. Nach der Erweiterung der Kulturen wurde eine erste Runde der Genotypisierung von PCR durchgeführt, um Unterklone zu identifizieren, die Löschungen beider DMRs tragen. Nachdem MEF-Feeder aus den Kulturen entfernt worden waren, wurde eine zweite Genotypisierung durchgeführt, um das Fehlen von Wildtyp-Allelen an den H19-und IG-DMRs zu bestätigen (Abbildung 2B). Von insgesamt 135 Subklonen erhielten wir 5 haploide DKO-phESC-Linien, die die gelöschten Allele trugen und frei von Wildtyp-Allelen sowohl der H19-DMRals auch der IG-DMR waren.
Ein CAG-EGFP-Transgen wurde in DKO-phaESCs eingeführt, um ihren Beitrag zu halbgeklonten Embryonen durch Visualisierung grüner Fluoreszenz unter dem Mikroskop zu untersuchen (Abbildung 3A). Für die intrazytoplasmatische Injektion wurden DKO-PhaESCs mit Demekolumcin behandelt, um sie in der M-Phase zu verhaften. So wurde der Zellzyklus von DKO-phaESCs mit dem von MII-Oozyten synchronisiert. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte 2 Populationen, die g2/M-Phase entsprechen, haploid (2n) und diploide Zellen (4n) nach der Behandlung mit Demekolumin (Abbildung 3B). Das Fehlen des 1n haploiden Peaks deutete darauf hin, dass der Zellzyklusstillstand weitgehend abgeschlossen war. M-Phase haploid ESCs wurden dann sortiert und in Eizellen injiziert. Dazu wurde ein einziger DKO-PhaESC in die Mikroinjektionspipette geladen und in das Zytoplasma einer MII-Oozyte injiziert (Abbildung 3C). Die Plasmamembran des DKO-phaESC wurde durch Pipettieren in die Spitze der Mikroinjektionspipette gebrochen.
Nach der Injektion wurde die EGFP-Expression selten in den konstruierten halbgeklonten Embryonen nachgewiesen, da sich das Zytoplasma von DKO-PhaESCs im großen Zytoplasma der Oozyte dispergiert hatte (Abbildung 3D). In seltenen Fällen konnte ein runder Punkt intensiver EGFP-Expression innerhalb des Ooplasmas beobachtet werden. Diese Beobachtung wurde wahrscheinlich durch die unbeabsichtigte Injektion intakter DKO-PhaESCs verursacht. Ein Versagen, die DKO-phaESC-Zellmembran zu brechen, ist wahrscheinlich nicht mit der weiteren Embryoentwicklung vereinbar und sollte vermieden werden. Eine Stunde nach der Injektion wurden Embryonen durch Behandlung mit Strontiumchlorid18aktiviert. Sechs Stunden nach Beginn der Aktivierung wurden bis zu 3 Polarkörper unter dem Mikroskop beobachtet (Abbildung 3E). Diese Polarkörper entsprechen dem ersten und zweiten Polarkörper der Oozyte und einem pseudopolaren Körper aus dem DKO-phaESC7. Darüber hinaus wurden zwei Vorkerne unter einem Differentialinterferenzkontrastmikroskop beobachtet, das dem pronuklearen Stadium von Zygoten nach normaler Befruchtung mit Spermien ähnelte.
Um entwicklungsfähig zu demonstrieren, wurden halbgeklonte Embryonen in das Blastozystenstadium kultiviert (Abbildung 5A). Darüber hinaus wurde eine Vollzeitmaus erhalten, nachdem halbklonierte 2-Zell-Stadium-Embryonen in die Eileiter eines Empfängerweibchens übertragen wurden (Abbildung 5B). Wie erwartet, war die Maus, die von einem halbgeklonten Embryo abgeleitet wurde, ein Weibchen, da weder Eizellen noch eizellenabgeleitete PhaESCs ein Y-Chromosom tragen. Die halb geklonte Maus war völlig normal und produzierte gesunde Nachkommen, wenn sie mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen gepaart wurde. Bislang ist die halbgeklonte Maus seit über 600 Tagen ohne erkennbare gesundheitliche Probleme am Leben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die Anwendung von DKO-phaESCs als Spermienersatz. (A) Ein Zeitrahmen für die Verfahren des Protokolls. (B) Das Schema zeigt die Schritte zum Einrichten von DKO-phaESC-Linien (Schritte 1–6). (C) Das Schema zeigt die Schritte zum Konstruieren halbklonierter Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion eines DKO-PhaESC in eine MII-Oozyte (Schritte 7–14). Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; MEF = Maus embryonaler Fibroblast. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Einrichtung von DKO-phaESC-Zeilen durch CRISPR/Cas9-vermittelte Löschungen von H19- und IG-DMRs. (A) Flow-Zytometrie-Analyse von PhaESCs nach Transfektion mit PiggyBac-Plasmiden für stabile EGFP-Expression und mit 4 CRISPR/Cas9-Plasmiden. Nicht transfizierte PhaESCs werden als Kontrolle angezeigt. Das DNA-Profil (oben) zeigt die Zellzyklusverteilung von haploiden und diploiden Zellen. G1/S-Phase haploide Zellen, die EGFP exdrücken, werden durch das grüne Tor (unten, rechts) angezeigt. (B) Genotypisierung von PhaESC-Unterklonen, die auf MEFs (erste Genotypisierung) und nach Entfernung von MEFs (zweite Genotypisierung) angebaut wurden. Unterklonierte PhaESC-Zeilen 1, 2, 3 und 4 stellen Wildtypzellen dar, Zellen mit h19-DMR-Deletion, mit einer IG-DMR-Löschungund mit kombinierten H19-bzw. IG-DMR-Deletionen. Die DKO-phaESC-Zeilen 5–8 besitzen sowohl H19-DMR-als auch IG-DMR-Deletionen und sind frei von Wildtyp-Allelen. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; DMR = differenziell methylierter Bereich; MEF = Maus embryonaler Fibroblast; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; WT = Wildtyp. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Abbildung 3: Injektion von mitotisch verhafteten DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. (A) Morphologie einer DKO-phaESC-Kultur, die ein CAG-EGFP-Transgen und Streichungen der H19- und IG-DMRträgt; Skala bar = 50 m . (B) Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse von DKO-phaESCs nach Festnahme mit Demecolin für 8 h. DKO-phaESCs ohne Demekoluminbehandlung werden als Kontrolle dargestellt. (C) Morphologie von DKO-phaESCs in der Mikroinjektionspipette. Es wird ein einziges intaktes DKO-phaESC vor (links) und nach (rechts) Das Brechen der Plasmamembran durch Pipettieren gezeigt; Skala bar = 20 m . (D) Konstruierte Embryonen bei 1 h nach Injektion von DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. Ein zusammengeführtes Bild von EGFP-Fluoreszenz und hellem Feld wird gezeigt. Schwarze Pfeilspitzen zeigen runde Flecken intensiver EGFP-Expression nach Injektion intakter DKO-PhaESCs an, die vermieden werden sollten; Skala bar = 50 m. (E) Ein Differentialinterferenzkontrastbild von halbgeklonten Embryonen 6 h nach Beginn der Aktivierung mit Strontiumchlorid wird gezeigt. Weiße Pfeilspitzen zeigen Embryonen mit 3 polaren Körpern an, darunter einen pseudopolaren Körper aus dem injizierten DKO-phaESC; Skalenbalken = 50 m. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Abbildung 4: Schema des Aufbaus für die intrazytoplasmatische Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen. (A) Die Anordnung einer Injektionspipette, einer Haltepipette und einer Oozyte in der Injektionskammer wird angezeigt. α, Biegewinkel der Mikroinjektionspipette. (B) Layout der Tropfen in der Mikromanipulationsschale für intrazytoplasmatische Injektion. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Abbildung 5: Entwicklung von halbgeklonten Embryonen. (A) Präimplantationsentwicklung von halbgeklonten Embryonen in vitro. Die EGFP-Expression wird zunächst an Tag 2 nach intrazytoplasmatischer Injektion bei vierzelligen Embryonen beobachtet. An Tag 4 kann eine intensive EGFP-Expression in Blastozysten beobachtet werden; Skala bar = 100 m . (B) Eine halbgeklonte Maus, die nach dem 2-Zell-Embryotransfer zu einem Empfängerweibchen erhalten wurde. Mit 74 dpp lieferte die halbgeklonte Maus (Pfeilspitze) ihre ersten Welpen (Sternchen) durch natürliche Geburt nach der Paarung mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen. Halbgeklonte Embryonen und die in dieser Abbildung gezeigte halbgeklonte Maus sind identisch mit denen, die in Aizawa et al.3berichtet werden. Abkürzungen: EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; .dpp, Tage nach der Partum. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Gelatinelösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Gelatine</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embryonale Stammzelle (HaESC) medium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 l</td>
			<td>18.00 UHR</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 L</td>
			<td>1 M</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 I.E./ml</td>
			<td>10 l</td>
			<td>1.000 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 l</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC-Wartungspuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>HaESC Mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Lösung</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 l</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Waschpuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA-Fraktion</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 ml</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF mittel</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 ml</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 l</td>
			<td>100 m</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lysis-Puffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 l</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS-Lösung</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 l</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 l</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinase K</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>100 g/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Aktivierungsmedium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Strontiumchlorid</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 l</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 l</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>M2 mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 I.E./ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>50 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 I.E./ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>50 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidase medium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>M2 mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>380 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidase</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>20 l</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abkürzungen: LIF = Leukämie-Hemmfaktor; MEF = Maus embryonaler Fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetales Rinderserum; DMEM = Dulbeccos modifizierter Adler Medium; BSA = Rinderserumalbumin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; SDS = Natriumdodecylsulfat; EGTA = Ethylen-Bis(Oxyethylenenitrilo)Tetraessigsäure;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = phosphatgepufferte Saline; PVP = Polyvinylpyrrolidon; hCG = humanes Choriongonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = schwangere Stute Serum Gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Rezept von Medium, Puffer und Lösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namen</td>
			<td colspan="2">Sequenz (5' bis 3')</td>
			<td>Anwendung</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Liste der Oligonukleotide.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Aufrufe.  ETH Zurich. Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Serie: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Forschung

Genetik

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

Entwicklungsbiologie

<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>ICSI-ET-Mausmodell zur Untersuchung langfristiger Auswirkungen auf den Glukosestoffwechsel

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung der langfristigen gesundheitlichen Auswirkungen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion auf Nachkommen

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

Isolierung und Genotypisierung von gastrulierenden Mausembryonen für die Einzelzellsequenzierung

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor im Rampenlicht: Eine Pipeline zur Analyse linienspezifischer mutierter Embryonen mit Einzelzellauflösung

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

Zusammenfassung

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Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Überwachung des Blutzuckers bei Mäusenachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation