Ich danke Alex L. Kolodkin, als ich dieses gefilmte Vorbereitungsprotokoll in seinem Labor gelernt habe. Ich danke auch Young Gi Hong für technische Unterstützung. Diese Studie wurde von NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung von 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) -Lösung durch Zugabe von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Tabelle der Materialien) auf 500 ml 1X PBS Und Rühren für mindestens 30 min. Bei 4 ° C aufbewahren. Verwenden Sie, wenn relativ frisch und speichern Sie die Lösung in einer sauberen Flasche. </li><li> Mischen Sie 10 ml 4% Paraformaldehyd durch Zugabe von 2,5 ml einer 16% igen Stamm-Paraformaldehydlösung und 1 ml 10x PBS zu 6,5 ml entionisiertem Wasser. Bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb einer Woche verwenden. ACHTUNG: Hautkontakt mit Paraformaldehyd-Lösung vermeiden, da es sehr giftig ist. </li><li> Mischen Sie X-Gal-Substrat (10% w / v X-Gal in Dimethylsulfoxid (DMSO)) durch Lösen von 0,1 g X-Gal-Substrat pro 1 ml DMSO. Bei -20 ° C in 100 μl Aliquoten lagern. </li><li> Mischen Sie X-Gal-Färbe-Lösung unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 3 mMK 4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K 3 [FeIII (CN) 6 ] und 0,3% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol. Bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahren. </li><li> Mischen Sie 3% Wasserstoffperoxidlösung durch Verdünnen von 30% Stamm Wasserstoffperoxid 1:10 mit deionisiertem Wasser. </li><li> Mischen Sie 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) -Lösung durch vollständiges Auflösen von 1 Tablette (10 mg) DAB in 35 ml frischer PBT-Lösung. Durch einen 0,2 μm-Spritzenfilter filtrieren und bei -20 ° C in 910 μl Aliquots lagern. ACHTUNG: Alle DAB-Abfälle in Bleichmittel entsorgen, um den DAB zu zerstören. </li><li> Eierteller mit Apfelsaft herstellen. Füge 35 g Agar und 1 l entionisiertes Wasser in einen 2 l-Kolben ein. Füge 33 g Saccharose, 2 g Tegosept und 375 ml Apfelsaft in einen 1- l-Kolben ein. Schmelzen Sie sie durch Autoklavieren für 30 min. Lassen Sie beide Lösungen auf ca. 60 ° C abkühlen. Kombinieren und mischen diese Lösungen gut durch Rühren. Gießen Sie 11 ml kombinierte Lösung pro 60 mm Kulturschale. </li><li> Machen Sie Hefepaste, indem Sie Bäcker schlagenSt in deionisiertes Wasser (Verhältnis 1: 0,8) und bei 4 ° C aufbewahren. </li></ol> 2. Embryo-Sammlung (Tag 1) <ol><li> Sammeln Sie junge weibliche und männliche Fliegen (jünger als 5 Tage) und halten Sie sie für 1-2 Tage in einem Plastikbecherkäfig mit einer Eiplatte (60 mm x 15 mm), die eine kleine Menge Hefepaste in der Mitte enthält. </li><li> Für die optimale Sammlung von Spätstadium-16 Embryonen, richten Sie einen Flaschenkäfig mit Fliegen (&gt; 50) gegen 17 Uhr auf und lassen Sie sie Eier bei 25 ° C für 3 h legen. </li><li> Übertragen Sie die Fliegen auf eine frische Flasche. </li><li> Schließen Sie die Eiplatte mit dem Deckel und inkubieren Sie sie bei 25 ° C in einem befeuchteten Inkubator (~ 70% Luftfeuchtigkeit) über Nacht. </li></ol> 3. Vorbereitung von Embryonen zur Immunfärbung (Tag 2) <ol><li> Füge 1,8 ml PBT-Lösung zur Eiplatte um 10:20 Uhr hinzu und verwende einen Wattestäbchen, um die Embryonen von der Platte zu lösen, während du sie kippst. Hinweis: Durch sanftes Maischen der Hefepaste mit einem CottAuf Tupfer, löst es auf, falls eine große Anzahl von Embryonen darauf gefunden wird. Beginne das Sammeln der Embryos ~ 40 Minuten vor der Fixierung (gegen 11:00 Uhr). </li><li> Übertragen Sie die Embryos aus der Eiplatte auf ein 1,5-ml-Mikroröhrchen mit einer 1-ml-Pipettenspitze. </li><li> Lassen Sie sich die Embryos so weit wie möglich absetzen und die PBT-Lösung aspirieren. Spülen Sie die Embryos zweimal mit 1 ml PBT-Lösung. Setzen Sie die PBT-Lösung so weit wie möglich ein. </li><li> Füllen Sie das Röhrchen mit 1 ml 50% igem Bleichmittel ( dh verdünnt in entionisiertem Wasser) und dechorionieren Sie die Embryos, indem Sie sie 3 min bei Raumtemperatur (RT) auf einen Nusskern inkubieren. Anmerkung: Dieser Schritt tötet nicht die dechorionierten Embryonen. </li><li> Lassen Sie die dechorionierten Embryos sich absetzen, aspirieren Sie die 50% ige Bleiche so weit wie möglich und spülen Sie die Embryos 3 mal mit 1 ml PBT-Lösung. </li><li> Fügen Sie 0,5 ml Heptan hinzu und fügen Sie anschließend ca. 11 ms 0,5 ml einer 4% igen Paraformaldehydlösung zu dem Röhrchen bei RT hinzu. </li><li> Inkubieren derEmbryos auf einem Nutator für 15 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung (die untere Schicht). </li><li> Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und entzünden Sie die Embryos, indem Sie das Röhrchen 30 Minuten lang kräftig schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Heptane ( dh die obere Schicht). </li><li> Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und schütteln Sie das Röhrchen für 10 s kräftig. </li><li> Lassen Sie die Embryos sich niederlassen, indem Sie das Röhrchen klopfen und das Methanol so weit wie möglich absaugen. Spülen Sie die Embryonen mit 1 ml 100% Methanol, Schütteln für weniger als 10 s. Anmerkung: Ausgedehnte Exposition gegenüber Methanol zerstört die β-Gal-Aktivität. </li><li> Das Methanol entfernen und die devitellinisierten Embryos 3 mal mit 1 ml PBT-Lösung abspülen. </li></ol> 4. Genotypisierung der Embryonen mit LacZ-Färbung (Tag 2) <ol><li> Füge 1 ml PBT-Lösung dem Röhrchen zu und inkubiere das Röhrchen in einem 37 ° C Hitzestrom oder Wasserbad für 15 min. </li><li> Während der Inkubation wird die X-Gal-Färbelösung (1 ml pro TuWerden bei 65 ° C in einem Wasserbad, bis es bewölkt wird. Inkubieren Sie es in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Die PBT-Lösung einatmen und 1 ml X-Gal-Färbelösung und 20 &amp; mgr; l X-Gal-Substrat zu dem Röhrchen geben. </li><li> Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 ° C mit Nutation, bis ein blauer Niederschlag offensichtlich ist. Hinweis: Die Inkubationszeit für die 2. und 3. Blue Balancer im Allgemeinen reicht von 2-4 h. </li><li> Die X-Gal-Färbe-Lösung entfernen und die Embryos dreimal mit 1 ml RT-PBT-Lösung spülen. </li><li> Mit einer Nadelsonde oder Pinzette, sortieren Sie die Embryonen des gewünschten Genotyps ( dh nicht gebeizte weiße Embryos) mit einem leichten Seziermikroskop (1.6X-2.5X-Ziele). Anmerkung: Da einige blaue Balancer wie CyO, Actin-LacZ und TM3, Actin-LacZ , ein transgenes Konstrukt tragen, das unter der Kontrolle des Aktin-Promotors bakterielles β-Gal (LacZ) exprimiert, enthalten Embryos, die in einer ubiquitären Weise blau gefärbt sindEin oder zwei Kopien von Blue Balancer Chromosomen. Daher sind nicht gefärbte weiße Embryos für das gewünschte tödliche Allel homozygot. </li></ol> 5. Immunfärbung von Embryonen mit Anti-Fasciclin II-Antikörpern (Tag 2-3) <ol><li> Sammeln und übertragen die Embryos des gewünschten Genotyps ( dh nicht gefärbten weißen Embryos) zu einem 0,5 ml-Mikroröhrchen unter Verwendung einer 1 ml-Pipettenspitze. Anmerkung: In diesem Schritt können die Embryos nach morphologischen Kriterien grob inszeniert werden, einschließlich der Segmentierungsmuster der Nagelhaut und der Strukturen von Kopf und Schwanz 9 . Während der Kopfinvasion, zwischen 10 und 16 h nach dem Verlegen der Eier, erfährt der Embryo eine ausgeprägte Reduktion des vordersten Segments 9 . </li><li> Die Embryos einmal mit 0,4 ml PBT-Lösung waschen und 0,3 ml Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum und 5% DMSO in PBT-Lösung) zugeben. </li><li> Blockiere die Embryos mit Nutation bei RT für 15 min. </li><li&gt; 75 μl Anti-Fasciclin II-Antikörper zugeben und das Röhrchen bei RT über Nacht mit Nussation inkubieren. </li><li> Die Embryonen 4 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung für mindestens 20 min pro Waschung waschen. </li><li> Füge 0,3 mL Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum in PBT-Lösung) mit Ziegen-anti-Maus-HRP-Antikörper (2 μg / ml) hinzu und inkubiere das Röhrchen mit Nussation bei RT über Nacht. </li><li> Die Embryos 6 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung für mindestens 20 min pro Waschung waschen. </li><li> Füge 0,3 ml DAB-Lösung dem Röhrchen hinzu. ACHTUNG: Handschuhe tragen und alle DAB-Abfälle / Röhrchen / Spitzen in Bleichmittel stellen. </li><li> Man gibt 2 μl 3% iges Wasserstoffperoxid zu und inkubiert das Röhrchen im Dunkeln mit Nutation bei RT, bis die gewünschte Menge an Niederschlag entsteht. Anmerkung: Die Inkubationszeit für 1D4 Immunhistochemie im Allgemeinen reicht von 0,5-1 h. </li><li> Die Embryos 4 mal mit 0,4 ml PBT-Lösung waschen. ACHTUNG: Entfernen Sie die DAB-Lösung und die ersten beiden Wäschen mit einer Pipette und diSchmeißt sie in Bleiche. </li><li> Füge 0,2 ml der 70% igen Glycerin / PBS-Lösung in das Röhrchen ein und lag bei RT oder 4 ° C auf. Hinweis: Halten Sie den Schlauch von Licht fern. Klarere Präparate können erhalten werden, indem die Embryonen in eine 90% ige Glycerin / PBS-Lösung 10 gegeben werden . Jedoch ist es schwieriger, Embryonen, die in 90% Glycerin / PBS-Lösung freigesetzt wurden, zu sezieren, als die, die in 70% Glycerin / PBS-Lösung 10 freigesetzt wurden. </li></ol> 6. Inszenierung, Dissektion, Montage und Bildgebung der Embryonen (Tag 4) <ol><li> Zur Inszenierung die mit 70% Glycerin / PBS äquilibrierten Embryonen auf einen Glasrutsche übertragen. </li><li> Sammeln Sie späte Stadium-16 Embryonen, die Bauchsegment 7 (A7), A8 und A9 ISN Nerven konvergieren, um einander zu berühren oder / und haben midgut, die in drei Banden unterteilt ist. Hinweis: Embryos, die mit 1D4-Antikörper gefärbt sind, können auf der Grundlage der Projektionsmuster von ISN- und ISNb-Motoraxonen inszeniert werden. Nach dem Verlassen des ZNS, A7, A8 und A9 ISN neRs der späten Stadium-16 Embryonen konvergieren, um einander zu berühren und anschließend divergieren, um weit hinaus zu den dorsalen Muskeln (Pfeilspitze in Abbildung 1A ) zu verlängern. In der Mitte der Stufe-16 Embryonen, aber A7 ISN Nerven erstrecken sich parallel zu A8 / A9 Nerven (eckige Klammer in Abbildung 1B ). Darüber hinaus sind die Projektionsachsen der A6 ISNb-Nerven (senkrecht zu den ventrolateralen Muskeln) in beiden Hämisenteilen grob mit dem hinteren Ende der ZNS-Längsaxon-Faszikel (Pfeile und einer Linie in Abbildung 1C ) ausgerichtet. Diese morphologischen Kriterien variieren etwas zwischen verschiedenen Genotypen. Alternativ können Embryonen auf der Grundlage der Darmmorphologie 9 , 11 inszeniert werden . Vor der Stufe 17 hat der Midgut eine herzförmige Form, während der Midgut nach Stufe 17 12 in drei Banden unterteilt ist. </li><li> Zerschneiden die Embryonen. <ol><li> Mit einer 1 mL-Spritze, bewegen Sie jeden Embryo aus dem Glycerin-Tropfen und legen Sie den Embryo ventral-Gesicht nach oben. Schneide den vorderen Teil bei 1/4 der Körperlänge und dem hintersten Bereich ab, der frei von Motoraxonen ist. </li><li> Mit einem Nadel-Sonde, verschieben Sie den End-Cut-Embryo aus dem Glycerin-Drop, rollen, um es dorsal-side nach oben zu orientieren, und legen Sie es horizontal auf dem Feld. Anmerkung: Wenn der Embryo aus dem Glycerintropfen herausgezogen wird, macht ein bisschen Glycerin, das mit dem Embryo assoziiert ist, es klebrig. </li><li> Schneiden Sie den Embryo entlang der dorsalen Mittellinie mit einer einzigen sehr feinen Wolframnadel 13 . Machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos und dann weiter, um die dorsale Mittellinie in Richtung der vorderen zu reduzieren; Schneiden in die entgegengesetzte richtung ist auch gut </li><li> Mit einem Nadelsonden den Mittellinie-Embryo in den Glycerin-Tropfen verwandeln, ihn dorsal nach oben stellen und den Darm von der Körperwand lösen, indem er jede Körperwand in einer ventrolateralen (diagonalen) Richtung entfaltet (2.5X Ziel). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die dorsale Mittellinie vollständig geschnitten ist, was zu einer vollständigen Trennung zwischen den linken und rechten Körperwänden führt. </li><li> Ziehen Sie den Mittellinien-Embryo vorsichtig aus dem Glycerin-Tropfen und legen Sie dann mit einer feinen Nadelsonde (2.5X-Objektiv) zwei Klappen der Körperwand auf den Glasschieber. </li><li> Mit einer sehr feinen Wolframnadel, entfernen Sie die inneren Organe aus dem sezierten Embryo, indem Sie sie seitlich (5X Objektiv) drücken. Anmerkung: Eine ausführlichere Beschreibung eines anderen ähnlichen Dissektionsprozesses finden Sie auf der Website 5 . </li></ol></li><li> Zur Montage fügen Sie 2-3 μl 70% ige Glycerin / PBS-Lösung zum Reinigen, Sezieren von Embryonen und überführen sie mit einer feinen Nadelsonde auf einen neuen Glasschieber, auf den 8 μl 70% Glycerin / PBS-Lösung verteilt wurden Das Zentrum (2.5X Ziel). </li><li> Setzen Sie auf ein Deckglas (18 mm x 18 mm). Die Kanten des Deckglases mit regelmässigem Nagellack abdichten (entwederKlar oder farbig ist gut). </li><li> Erfassen Sie Bilder mit hoher Auflösung (20X, 40X und 63X Öl-Immersions-Objektiven) unter einem DIC-Lichtmikroskop (Differential Interference contrast) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Eine bessere Visualisierung und phänotypische Charakterisierung, insbesondere für ISNb-Motoraxone, können mit einem 63X-Öl-Immersions-Objektiv hergestellt werden. </li></ol>

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Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Die Details der Motor-Axon-Führungsdefekte werden durch die gefilterte Vorbereitung von DAB-gefärbten Embryonen schneller und mit besserer Genauigkeit erzielt als durch eine konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Laserscanning. Daher eignet sich die filtrierte Präparation von fixierten und 1D4-gefärbten Embryonen am besten für die funktionelle Charakterisierung von Guidance Cue Molekülen. Vier Hauptklassen von Leitlinien, darunter Netrine, Schlitze, Semaphorine (Semas) und Ephrine, und ihre verwandten Rez...

Präzise und selektive Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der embryonalen Entwicklung sind für die normale Fortbewegung in Drosophila- Larven essentiell . Die embryonale Strukturierung von 30 Muskelfasern in jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 wird nach Stufe 16 1 hergestellt. Die 36 motorischen Neuronen, die im ventralen Nervenkabel erzeugt werden, verlängern ihre Axone in die Peripherie, um spezifische Zielmuskeln zu innervieren 2 . Die motorische Axonpfadfindung und die Zielerkennung können durch Immunhistochemie mit einem Antikörper (Mausmonoklonaler Antikörper 1D4) 3 , 4 sichtbar gemacht werden. Mehrere Bilder der motorischen Axonprojektionsmuster in Wildtyp Embryonen sind auf der Bahn 5 verfügbar. Der 1D4-Antikörper markiert alle motorischen Axone und drei Längsaxon-Faszikel auf jeder Seite der Mittellinie des embryonalen Zentralnervensystems (ZNS) 4 </sUp&gt; , 6 ( Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Daher bietet die Immunhistochemie mit FasII-Antikörper ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Genen, die für die neuromuskuläre Konnektivität erforderlich sind, um die molekularen Mechanismen zu demonstrieren, die der motorischen Axon-Anleitung und der Zielerkennung zugrunde liegen. In jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 projizieren motorische Axone und selektiv in zwei Hauptnervenzweige, den Segmentnerv (SN) und den intersegmentalen Nerv (ISN) 2 , 4 und einen kleinen Nervenzweig, den Quernerv (TN ) 7 . Die SN selektiv defasciculiert, um zwei Nervenzweige zu nennen, die SNa und SNc genannt werden, während die ISN in drei Nervenzweige, die so genannten ISN, ISNb und ISNd 2 , 4 , aufgeteilt werden. Unter ihnen, ISN, ISNb und SNa MotoraxonDie Projektionsmuster werden am genauesten sichtbar gemacht, wenn Spitzstadium-16-Embryos mit FasII-Antikörper gefärbt werden und filtriert werden (Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Die ISN-Motorneuronen verlängern ihre Axone, um die Dorsalmuskeln 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 und 20 2 , 4 zu innervieren ( Fig. 2A ). Die ISNb-Motorneuronen innervieren die ventrolateralen Muskeln 6, 7, 12, 13, 14, 28 und 30 2 , 4 ( 2A und 2B). Der SNa-Nerven-Zweig projiziert, um die Seitenmuskeln 5, 8, 21, 22, 23 und 24 2 , 4 zu innervieren ( Fig. 2A ). Die TN, die aus zwei motorischen Axonen besteht, projiziert ipsilateral entlang der segmentalen Grenze, um den Muskel 25 zu innervieren und macht Synapsen mit dem lateralen bipolaren dendritischen Neuron (LBD) in derPeripherie 7 (Abbildung 2A ). Diese Zielmuskelinnervationen erfordern nicht nur die selektive Defaskik von motorischen Axonen an bestimmten Wahlpunkten, sondern auch die Zielmuskelerkennung. Darüber hinaus wurden einige mutmaßliche mesodermale Guidepost-Zellen, die als Zwischenziele fungieren, sowohl in den ISN- als auch in den SNa-Wegen gefunden, aber nicht entlang des ISNb-Weges 4 . Dies könnte darauf hindeuten, dass die ISNb-Motor-Axon-Pfadfindung im Vergleich zu der ISN- und SNa-Motor-Axon-Führung in einer bestimmten Weise reguliert werden kann, und es zeigt auch an, dass die periphere Motor-Axon-Führung ein attraktives experimentelles Modell bietet, um die Differential- oder konservierten Rollen eines einzelnen Leitfadens zu untersuchen Molekül 8 Diese Arbeit stellt eine Standardmethode dar, um die axonalen Projektionsmuster der embryonalen motorischen Neuronen in Drosophila zu visualisieren . Die beschriebenen Protokolle beinhalten, wie man feste Embryonen, die mit 1D4 a gefärbt sind, seziertNtibody und verarbeitet in 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) für filtrierte Zubereitungen. Ein kritischer Vorteil der flachen Präparate von festen Embryonen ist die bessere Visualisierung der axonalen Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit auch, wie man feste Embryonen genotypisiert, um die gewünschten mutanten Embryos nach der LacZ-Färbemethode zu sortieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7906</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">X100</td>
			<td style="width:228px;">t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">18505</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S5886</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P5405</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">30435</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71500</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">X-Gal Substrate</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">X1000</td>
			<td style="width:228px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Dimethyl Sulfxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D4540</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M8266</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P9387</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">244023</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">216763</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">3,3&#39;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5905</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Agar</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">A0930</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sucrose</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">S5-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">H5501</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Culture Dish (60 mm)</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430166</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Tricon Beaker</td>
			<td style="width:144px;">Simport</td>
			<td style="width:131px;">B700-100</td>
			<td style="width:228px;">This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Yeast</td>
			<td style="width:144px;">Societe Industrielle Lesaffre</td>
			<td style="width:131px;">Saf Instant Yeast Red</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">14220-263</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Eppendorf Tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:144px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:131px;">#72.690</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bleach</td>
			<td style="width:144px;">The Clorox Company</td>
			<td style="width:131px;">Clorox</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Heptane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">246654</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Methanol</td>
			<td style="width:144px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:131px;">UN1230</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">16210-064</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Anti-FasciculinII Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">1D4 anti-Fasciclin II</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;">115-006-068</td>
			<td style="width:228px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) 
			(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Glycerol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9012</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Slide Glass</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235501403</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Coverslip</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235503104</td>
			<td style="width:228px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:144px;">Becton Dickinson Medical(s)</td>
			<td style="width:131px;">301321</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Tungsten Needle</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">#27-11</td>
			<td style="width:228px;">Tungsten Wire, &#248;0.13mm/6.1m (&#248;.005&#34;/20 ft.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Nutator (Mini twister)</td>
			<td style="width:144px;">Korean Science</td>
			<td style="width:131px;">KO.VS-96TWS</td>
			<td style="width:228px;">Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

Die Etablierung funktioneller neuromuskulärer Schaltkreise beruht auf präzisen Verbindungen zwischen der Entwicklung von Motoraxonen und Zielmuskeln. Motorneuronen erweitern die Wachstumskegel, um auf bestimmten Wegen zu navigieren, indem sie auf eine große Anzahl von Axon-Guidance-Cues reagieren, die von der umgebenden extrazellulären Umgebung ausgehen. Die Wachstumskegel-Ziel-Erkennung spielt auch eine entscheidende Rolle bei der neuromuskulären Spezifität. Diese Arbeit stellt ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll dar, um motorische Neuronprojektionen von späten Stadium-16 Drosophila melanogaster Embryonen zu visualisieren . Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, einschließlich eines Genotypisierungsverfahrens, um die gewünschten mutanten Embryonen zu sortieren; Ein Immunfärbeverfahren, um Embryonen mit Fasciclin II (FasII) Antikörper zu markieren; Und ein Dissektionsverfahren, um gefilterte Präparate aus festen Embryonen zu erzeugen. Motor-Axon-Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie sind viel besser in flachen Präparationen von filtrierten Embryonen sichtbar als in whOle-Mount Embryonen Daher bietet die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt sind, ein mächtiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pfadfindung und die Zielerkennung erforderlich sind, und sie können auch sowohl auf die Funktionsstörungen als auch auf die Funktionsgenauigkeits-Gattungsbildschirme angewendet werden .

Präzise Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der neuronalen Entwicklung hängen von der selektiven Axonaxonabstoßung und der Zielerkennung an bestimmten Wahlpunkten ab 4 . In Drosophila wird die selektive Abstoßung zwischen motorischen Axonen teilweise durch die kombinierte Wirkung von Klasse 1 und 2 Semaphorinen (Semas), einschließlich Sema-1a, Sema-2a und Sema-2b 8 , 1...

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Aufrufe.  Chonbuk National University.  Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind. 

Serie: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Visualisierung von Propriozeptoren in

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen