Name: neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und anderen Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (Unterstützung SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-15-1-0472 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS), die Nancy Sayles Day Foundation (KMS) und das Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Wir danken Jessica E. Sagers, BA für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.

Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Massachusetts Eye und Ear genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt. 1. Vorbereitung der Dissektion <ol><li> Vorbereitung der chirurgischen Tabelle <ol><li> Verwenden Sie 70% Ethanol, um den chirurgischen Tisch zu desinfizieren. </li><li> Lege zwei unversöhnliche Vorbereitungspads neben dem Mikroskop auf. </li><li> Bereiten Sie das Instrumentenfach vor, einschließlich der hitze-sterilisierten Bedienschere, eines Skalpellgriffes, eines Mikromessers und einer Pinzette (jeweils zwei # 4 &amp; # 55). Legen Sie die Instrumententafel und eine 50 mm breitblättrige Petrischale auf eine nicht sterile Unterlage. </li><li> Erhalten Sie eine sterile # 15 Skalpell Klinge; Ein abdichtbarer Plastikbeutel oder -behälter (zur Entsorgung der Schlachtkörper im Einklang mit den institutionellen Richtlinien); Eis in einem Eimer; Und kalte, sterile Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Lege diese Gegenstände auf dieAndere nonsterile Pad </li><li> Übertragen Sie die HBSS in ein 50 ml Plastiklaborrohr und legen Sie es auf Eis. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Kultur <ol><li> Bereiten Sie alle Materialien in einer laminaren Strömungshaube vor. Für jede vier Exemplare, setzen vier autoklavierte 10 mm runde Glasabdeckungen in die vier Einlagen der 35 mm 4-well Petrischale. </li><li> Für jede 4 Exemplare wird ein Gesamtvolumen von 300 μl, bestehend aus folgendem in einem Mikrozentrifugenröhrchen, vermischt: 10 μl Gewebeklebstoff, 285 μl NaHCO 3 und 5 μl NaOH. </li><li> 40 μl der resultierenden Lösung auf jeden Deckzettel geben und dort mindestens 20 min bei RT ablassen; Diese Lösung kann für mehrere Stunden auf dem Deckglas belassen werden, kann aber nicht O / N bleiben. </li><li> Legen Sie eine oder zwei 35 mm 4-well Petrischale in einer 10 cm Petrischale, um zwei Barrieren gegen Verschmutzung zu schaffen. </li><li> Bereiten Sie Kulturmedium mit 98% Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem (Mikro-) Zentrifugenröhrchen). Die Lösung vor 25 ° C auf 25 ° C erwärmen. </li></ol></li></ol> 2. Murine Cochlear Explant Dissection <ol><li> Enthauptung der neonatalen Maus <ol><li> Erhalten Sie eine 60-mm-Plastik-Petrischale und sprühen Sie 70% Ethanol in den Deckel, so dass die Oberfläche nass ist. </li><li> Gießen Sie kaltes HBSS aus dem Kunststoff-Laborrohr in den unteren Teil des 60-mm-Plastiks und die 50 mm klare Wand aus Glas-Petrischale. Lagern Sie das Plastiklaborrohr und beide Petrischalen auf Eis, um das Gewebe kalt zu halten, wann immer es nicht zerlegt wird. </li><li> Lege eine P3 - P5 - gealterte neonatale Maus auf Eis in einen Cutoff - Finger eines Latexhandschuhs und warte, bis die Hypothermie den Verlust des Bewusstseins (ca. 1-3 min) induziert. </li><li> Entkuppeln Sie die Maus schnell mit einer Arbeitsschere und entsorgen Sie den Körper in der versiegelbaren Plastiktüte. Setzen Sie den abgetrennten Neugeborenenkopf in die70% Ethanol im Deckel der 60 mm Plastik-Petrischale. </li></ol></li><li> Makroskopische Dissektion des Schläfenbeins <ol><li> Entfernen Sie die Haut des Schädels, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen bis zum hinteren Ende (direkt über die Sagittalnaht) mit dem Skalpellblatt machen. </li><li> Schneiden Sie beide äußeren Gehörgänge mit dem Skalpellblatt und falten Sie die Haut nach vorne, um den ganzen Schädel auszusetzen. HINWEIS: Obwohl für dieses Schritt kein Dissektionsmikroskop benötigt wird, kann es für eine verbesserte Visualisierung verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie den Schädel entlang der Sagittal Naht mit dem # 15 Skalpell Klinge. Achten Sie darauf, den Schädel zu schneiden, indem Sie die Klinge vorsichtig von vorne nach hinten nach oben bewegen und die Kompression der Cochleae vermeiden. HINWEIS: Der Schädel sollte in diesem Alter nicht verknöchert werden und sollte leicht schneiden. </li><li> Entfernen und verwerfen Sie die Schnauze, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Umlaufbahnen mit dem # 15 Skalpell machenKlinge. HINWEIS: Der hintere Teil des Schädels sollte noch das Gehirn und die Cochleae enthalten. </li><li> Entsorgen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm durch stumpfe Dissektion mit # 4 Pinzette. </li></ol></li><li> Mikroskopische Extraktion der Cochleae <ol><li> Stellen Sie das Mikroskop (6,5fache Vergrößerung) und die Lichtquelle ein, indem Sie die Pinzette unter den Geltungsbereich stellen und die Beleuchtung und den Fokus optimieren. </li><li> Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in die 60 mm Plastik-Petrischale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist. </li><li> Vollständig die Cochlea / e ausstellen, die als angrenzend an die umgebende Stapedialarterie (eine gewundene Arterie innerhalb des Schläfenbeins) identifizierbar ist, und das Orgel aus dem Schläfenbein mit Hilfe der # 4 Pinzette unverblümt trennen. </li><li> Übertragen Sie die Cochlea in die 50 mm, klarwandige, Petrischale mit Glasboden und legen Sie die Schale unter das Mikroskop. </li><li> Legen Sie die 60 mm Plastik Petrischale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis. </Li&gt; <li> Entfernen Sie die Cochlea aus dem Vestibularsystem und zerlegen Sie sorgfältig die Cochlear-Otic-Kapsel (typisch knorpelig in diesem Alter) mit # 4 Pinzette. Verwenden Sie # 55 Pinzette für alle weiteren Schritte. </li></ol></li><li> Endschritte der Gewebeverarbeitung <ol><li> Weiter mit der Verarbeitung des Innenohrgewebes durch sorgfältiges Trennen des Spiralbandes an das Orgel von Corti aus dem Rest der Cochlea und dem Modiolus mit dem Mikromesser oder zwei Pinzetten. <ol><li> In den dunkleren, lichtdurchlässigen Bereich an der Felsspalte zwischen dem Spiralband und dem Haarzellenbereich schneiden und mit dem darauffolgenden Entfernen des Spiralbandes fortfahren, indem man ihn am grundsätzlichsten anfängt und ihn bei gleichzeitiger Verschiebung sanft abwickelt. </li></ol></li><li> Positionieren Sie die Probe, um eine längliche, sagittale Ansicht der Cochlea zu erhalten und die Cochlea in zwei bis drei Abschnitte unter Verwendung des Mikromessers zu schneiden, wobei diese Abschnitte als die apikale (mittlere) und b klassifiziert werdenAsal dreht sich Entfernen Sie das Gewebe überlegen und unterhalb der tatsächlichen Schicht von Haarzellen und Neuriten, um ein Cochlea-Explantatstück zu erreichen, das horizontal auf der Petrischale liegen kann. HINWEIS: Eine angemessene Größe für eine stabile Haftung an der Kulturschale ist etwa die Hälfte einer Cochlear-Umdrehung. </li><li> Entfernen Sie die Tectorialmembran, eine sehr dünne lichtdurchlässige Schicht, die dem Organ des Corti unmittelbar überlegen ist, indem Sie sie sanft mit einer Pinzette abschälen. </li><li> Entfernen Sie die Membran von Reissner, die den SGNs überlegen ist, indem Sie sie mit einer Pinzette auf beiden Seiten berühren und sie abschälen. HINWEIS: Entfernen Sie alle seitlich angeordneten beschädigten Haarzellen, indem Sie sie mit dem Mikromesser abschneiden. </li></ol></li></ol> 3. Übertragen von Exemplaren auf die Kulturplatten <ol><li> Entfernen Sie die 45 μl Gewebeklebstofflösung aus den vier Deckgläschen. Waschen Sie jeden Deckel mit 50 μl sterilem H 2 O. Aspirieren Sie das Wasser. </li><li> Hebe die 1-ml-Pipette auf. Die Pipettenspitze mit ca. 120 μl DMEM benetzen, um zu verhindern, dass die Probe an der Innenseite der Spitze anhaftet. </li><li> Übertragen Sie die Proben einzeln mit der 1-ml-Pipette. Pipettieren Sie maximal 70 μl aus der HBSS-gefüllten, kleinen, klarwandigen, mit Petritornen versehenen Petrischale und legen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eine der 4 Inlays (vorbereitet mit Deckgläschen) in die 4-Well-Petrischale . </li><li> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (50fache Vergrößerung), dass sich die Probe in der richtigen Ausrichtung befindet. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Tectorialmembran entfernt wurde, nach oben zeigt. Sicherstellen, dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen, basalen Teil des Modiolus nach unten weist und an dem Deckglas haftet. <ol><li> Wenn die Probe bei der Inspektion umgedreht wird, legen Sie die HBSS ab, die in der Pipettenspitze in die Einlage verbleibt, und positionieren Sie das Stück, bis es richtig ausgerichtet ist. NEINTE: Dies verhindert, dass Haarzellen in Kulturmedium ohne strukturelle Unterstützung aus dem Deckglas schweben, was zu Degeneration führen könnte. </li></ol></li><li> Setzen Sie überschüssiges HBSS mit der 1-ml-Pipette ein. Warten auf 15 s. </li><li> 25 μl des vorbereiteten warmen Kulturmediums (98% DMEM, 1% N-2 und 1% Ampicillin) direkt auf die Probe pipettieren. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht mit der Pipette zu berühren. Ersetzen Sie die inneren und äußeren Petrischalenabdeckungen und inkubieren Sie O / N bei 37 ° C. </li><li> Setzen Sie alle Lagerlösungen an ihre richtigen Stellen zurück, entsorgen Sie Schlachtkörper und Restmüll, dekontaminieren Sie den chirurgischen Tisch nach institutionellen Richtlinien ( z. B. mit Ethanol oder Hypochlorit), reinigen und autoklavieren Sie die Instrumente und entsorgen Sie die Scharfe im entsprechenden Behälter . </li></ol> 4. Hinzufügen von endgültigen Kulturmedien und Substanzen von Interesse ANMERKUNG: Cochlea-Explantate sind für 10-16 Stunden später bereit. <ol><li> Vorbereitung einer MischungVon 97% DMEM, 1% fötalem Rinderserum (FBS), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Erwärmen der Lösung auf 25 ° C vor Gebrauch). </li><li> Fügen Sie andere Substanzen für die Lösungen für die jeweiligen Behandlungsgruppen hinzu. Wenn fluoreszierende Substanzen zugegeben werden ( zB grün fluoreszierende Proteine ​​(GFP) -exprimierende Viren, wurde in einer neueren Publikation eine Konzentration von 10 10 GC Adeno-assoziierten Viren (AAVs) für 48 h in 50 μl) verwendet Licht. </li><li> Übertragen Sie die Cochlea-Explantat-haltigen Petrischalen aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die laminare Strömungshaube. </li><li> Aspirieren Sie das alte Kulturmedium (ohne FBS) mit der Pipette aus den Inlays. </li><li> Fügen Sie 60 μl pro Vertiefung des vorbereiteten Warmkultur- (Behandlungs-) Mediums (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% Ampicillin und die interessierenden Stoffe) hinzu. </li><li> Legen Sie die Petrischale wieder in den Inkubator (37 ° C). </li><li> Ansicht rEgal unter dem Mikroskop, um Anzeichen einer Kontamination, zelluläre Migration oder Ablösung des Cochlea-Explantats zu identifizieren und Färbung nach maximal 7 Tagen durchzuführen. </li></ol> 5. Immunfluoreszenz - Tag 1 <ol><li> Vorbereitung der Blockierungslösung (94% Phosphat-gepufferte Saline (PBS), 5% normales Ziegen- oder Pferdeserum (NGS / NHS, abhängig von den sekundären Antikörpern) und 1% nichtionisches Tensid (siehe Tabelle der Materialien )) und Bestand Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid mit den jeweiligen Antikörpern). ANMERKUNG: Antikörper umfassen Kaninchen anti-Myo7A bei einer Konzentration von 1: 400+ (Myosin 7A, für innere und äußere Haarzellen) und Maus anti-TuJ1 1: 200+ (β-Tubulin, für SGNs) ODER Maus (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (C-terminales Bindungsprotein, für Presynapse), Maus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptische Dichte, für postsynapse) und Hühner anti-NF-H 1: 1000+ (Neurofilament, Für SGNs und Nervenfasern). &quot;+&quot; MeaNs &quot;oder höher&quot;. </li><li> Das Kulturmedium mit einer Pipette ausspülen. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht zu berühren. </li><li> Unter der Laminar-Flow-Kapuze spülen Sie die Cochlea-Explantate zweimal mit sterilem PBS aus und legen die Exemplare für 5 min nach jeder Wäsche auf einen Shaker. </li><li> Fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA - VORSICHT) für 20 min auf dem Shaker (unter der Kapuze). Aspirieren Sie die PFA. </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine präparierte Sperrlösung (94% PBS, 5% NHS und 1% nichtionisches Tensid) für 30 min auf Shaker. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit den jeweiligen primären Antikörpern (Vortex vor Gebrauch) O / N auf einem Zähler bei RT. HINWEIS: Wickeln Sie die Petrischalen mit feuchten Papiertüchern ein, die in Plastikfolie eingeschlossen sind (oder Aluminiumfolie, wenn das hinzugefügte SolutIon enthält fluoreszierende Materialien wie GFP-exprimierende Viren), um das Geschirr feucht zu halten und die Verdampfung der Antikörperlösung O / N zu verhindern. </li></ol> 6. Immunfluoreszenz - Tag 2 <ol><li> Bereiten Sie den 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Färbung (300 nM) vor und verwenden Sie die Stamm-Antikörper-Lösung, um die richtigen sekundären Antikörper-Mischungen zu erhalten, die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 5.1 sind. (IgG1) 488 1: 200+ und Ziegen-Anti-Maus 568 1: 200+ ODER Ziegen-Anti-Maus (IgG1) 568 1: 1000+, Ziegen-Anti-Maus (IgG2a) 488 1: Und Ziegen-Anti-Huhn 647 1: 200+ ODER Phalloidin 568 1: 200+ (für innere und äußere Haarzellen)). </li><li> Ansaugen der primären Antikörperlösung. </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in die vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit der ResPektive sekundäre Antikörper (Vortex vor Gebrauch) für 1,5 h auf einem Theke und vor Licht schützen. </li><li> Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und spülen Sie die Cochlea-Explantate mit einem DAPI-Fleck aus (Platzieren auf einem Shaker für 1 Minute und dann aspirieren). </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Verwenden Sie Pinzetten, um Deckgläser mit Proben aus der 4-Well-Platte zu entfernen, tauchen Sie sie in einen mit destilliertem H 2 O gefüllten Empfänger und trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie vertikal mit Papiertüchern in Berührung bringen. </li><li> Legen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium auf den Objektträger und umdrehen Sie die Deckgläser, um das nach unten gerichtete Gewebe in das Medium einzutauchen. </li><li> Dichtung des Deckglases mit klarem Nagellack, der den Rand umgibt (ohne die Probe unter dem Glas zu zerkleinern). Lassen Sie die Rutschen flach in einem überdachten Bereich weg von Licht für 15 - 20 min bis trocken und thSie in eine Schachtel legen oder unter dem konfokalen Mikroskop untersuchen. HINWEIS: Die Fluoreszenzfärbung wird am besten durch die Aufbewahrung der Objektträger bei 4 oder -20 ° C erhalten. </li></ol> 7. Konfokale Bildgebung <ol><li> Erhalten Sie einen Überblick und gezoomte Bilder für die Orgel der Region Corti, einschließlich Neuriten und SGNs. HINWEIS: Standardeinstellungen für den Imaging-Prozess: Format von 1.024 x 1.024 Pixeln, Geschwindigkeit von 400 Hz, Frame-Durchschnitt von 3, 20% Gesamt-Laserintensität und meist 20X und 63X Objektiv mit Öleintritt (potentiell kombiniert mit 2fachem Digitalzoom). Die Kanaleinstellungen für das DAPI-, Myo7A- und TuJ1-Färbeprotokoll sind oben skizziert: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766.8V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 488 15% Fluoresceinisothiocyanat (FITC), &quot;Smart Gain&quot; 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% Tetramethylrhomadinisothiocyanat (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562.4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Fügen Sie die Bilder in einem Z-Stack mit demSoftware, um eine z-Achsenprojektion zu erhalten. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+&amp;#34;recovered&amp;#34;+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &amp;#34;recovered&amp;#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea.">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li><li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector.">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes.">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li><li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear.">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Forscher müssen die Dissektionstechnik perfektionieren, bevor sie Experimente mit Cochlea-Explantaten durchführen. Haarzellen werden häufig während der Sezierungen, die früh in der Lernkurve durchgeführt wurden, beschädigt, und ein besonders problematisches Moment für ihre Integrität ist die Entfernung der tectorialen Membran, die ständige Hände, richtige Werkzeuge und Erfahrung erfordert. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollte eine visuelle Kontrolle unter dem Sektionsmikroskop durchgeführt werden und...

Sensorineural Hörverlust (SNHL) spiegelt Schäden am Innenohr oder aufsteigender Gehörgang. Während Hörverlust das häufigste sensorische Defizit bei Menschen 1 ist , existieren heilende Therapien noch nicht 2 . Obgleich Cochlear- oder auditorische Hirnstammimplantate ein gewisses Maß an Hörvermögen für Patienten mit schwerer bis tiefgehender SNHL wiederherstellen können, ist das Hören, das von diesen Geräten zur Verfügung gestellt wird, immer noch sehr verschieden von dem &quot;natürlichen&quot; Gehör, vor allem bei Versuchen, die Sprache im Lärm zu verstehen oder Musik zu hören. Während die Haarzelldegeneration seit langem als die primäre Konsequenz traumatischer auditorischer Ereignisse ( z. B. Exposition gegenüber lautem Rauschen) angesehen wird, gibt es wachsende Hinweise darauf, dass die Synapsen, die Informationen von Haarzellen zum Hörnerv übermitteln, mindestens ebenso anfällig für akustisches Trauma 3 sind , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 Da menschliche audiometrische Schwellenwerte, der aktuelle Goldstandard für die Auswertung der Hörfunktion, keine spezifische Zellschädigung im Innenohr vorhersagen, sind so bald wie möglich raffinierte Werkzeuge erforderlich, um die zelluläre Degeneration so schnell wie möglich zu erkennen und eine adäquate Behandlung einzuleiten 7 . Vielversprechende pharmazeutische Behandlungen für Hörverlust werden oft in homogenen Zellkulturen in vitro getestet, aber solche Systeme präzisieren die Cochlea-Mikroumgebung nicht genau. Cochlear-Zellen sind bekannt, um trophische Faktoren zu sezern, die andere Zelltypen innerhalb der Cochlea 8 , 9 beeinflussen, ein entscheidendes in vivo- Verfahren, das verloren geht, wenn das Organ von Corti 10 , 11 oder Spiral-Ganglion-Neuronen (SGNs) 12 isoliert oder kultiviert wird Molekulare Marker werden analysiertEf &quot;&gt; 13. In vivo- Studien, die für die Validierung von In-vitro- Daten notwendig sind, um neue, personalisierte Behandlungen für Hörverlust bei der Verfolgung von&quot; Präzisionsmedizin &quot;zu schaffen, erfordern erhebliche Ressourcen und Zeit. Dies ist besonders wichtig bei der Betrachtung Wie viel Aufwand für die Vervollkommnung und Durchführung von Mittelohr- oder Rundfenster-Membran-Injektionen mit Hörtests und die anschließende Zerlegung von Cochlear-Vollmontagen erforderlich ist. Das effiziente Screening von vielversprechenden Verbindungen in organotypischen Ex-vivo- Kulturen, die als Cochlea-Explantate bekannt sind, bietet eine wirtschaftliche und zuverlässige Alternative 14 , 15 , 16 , 17 . Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem bearbeitete Cochlea-Explantate erzeugt, gepflegt und ausgewertet werden können. Spezielle Anwendungen für dieses Modell werden unterstrichen, einschließlich seiner Verwendung in der ScreeningVon potentiell therapeutischen Verbindungen und der vergleichenden Bewertung von Virusvektoren für die Gentherapie. Ein Ex-vivo- Explantat-Ansatz ermöglicht es Forschern, die Effekte einer gegebenen Behandlung auf verschiedene Zellpopulationen in situ zu visualisieren, die Identifizierung von zelltypspezifischen Mechanismen und die anschließende Verfeinerung von zielgerichteten Therapeutika zu erleichtern. Insgesamt bietet diese Technik ein Modell, um die Cochlea ex vivo zu studieren, während sie ein vitales Übersprechen zwischen den sehr unterschiedlichen Zelltypen, die in der Cochlea koexistieren, bewahrt werden.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H antibody, chicken</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td><td>Antibodies Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&amp;reg;, Sleeve/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260368</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&amp;nbsp;</td><td>Aliquot in 50 mL tubes and store in -20&amp;deg;C freezer</td></tr><tr><td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro (dissecting) knife &amp;ndash; angled 30&amp;deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1&quot;), 1 mm thick, white, pack of 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&amp;nbsp;</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Prep Pad, Non Sterile&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6&#039;&#039; - 2 mm thick</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research

Während es in den vergangenen Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte in der Hörforschung gegeben hat, gibt es noch keine Heilung für den sensorineuralen Hörverlust (SNHL), eine Bedingung, die typischerweise eine Beschädigung oder einen Verlust der empfindlichen mechanosensorischen Strukturen des Innenohrs beinhaltet. Ausgefeilte In-vitro- und Ex-vivo- Assays haben sich in den letzten Jahren entwickelt, was es ermöglicht, eine zunehmende Anzahl von potentiell therapeutischen Verbindungen zu screenen und gleichzeitig die Ressourcen zu minimieren und die Bemühungen um die Entwicklung von Kuren für SNHL zu beschleunigen. Obwohl homogene Kulturen bestimmter Zelltypen weiterhin eine wichtige Rolle in der aktuellen Forschung spielen, verlassen sich viele Wissenschaftler nun auf komplexere organotypische Kulturen von murinen inneren Ohren, die auch als Cochlea-Explantate bekannt sind. Die Erhaltung organisierter Zellstrukturen im Innenohr erleichtert die in situ- Bewertung verschiedener Komponenten der Cochlea-Infrastruktur, einschließlich innerer und äußerer Haarzellen, Spiralganglion-Neuronen, NeurItes und unterstützende Zellen. Hier präsentieren wir die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten. Die sorgfältige Vorbereitung dieser Explantate erleichtert die Identifizierung von Mechanismen, die zu SNHL beitragen und ein wertvolles Instrument für die Hörforschungsgemeinschaft darstellen.

Während viele Protokolle auf Orgel von Corti explants konzentrieren, versucht diese Technik, die Anatomie der gesamten Cochlear-Umdrehung zu bewahren, einschließlich der SGNs. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, die Auswirkungen einer gegebenen Behandlung auf Neuriten und Somata von SGNs zusätzlich zu dem Organ von Corti zu analysieren. Die Durchführung einer Sektion, die einen Teil des Modiolus bewahrt, wie hier beschrieben, ist technisch anspruchsvoller, als das Organ von Cor...

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Technik der Cochlea-Explantation von Mäusen bei Neugeborenen als In-vitro-Screening-Instrument in der Hörforschung | Medizin | Video

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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Serie: Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

Making Sense of Listening: Der IMAP-Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

Medizin

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biologie

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neurowissenschaften

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Effiziente In-vitro-Kultivierung von Cochlea-Haarzellen der Maus

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Kultivierung von Haarzellen von Mäusen für die auditive Forschung 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als

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