Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
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PAnap war ein freundliches Geschenk von Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschungsstipendien MOP-102689 und MOP-136894 (an RB) und der kanadischen Stiftung für Innovation Grant 950-225005 finanziert.

Froschmanipulationen wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Richtlinien durchgeführt und wurden vom Ethikkomitee (CDEA, Protokoll Nr. 15-042) der Universität von Montréal genehmigt. 1. mRNA Vorbereitung für fUAA Incorporation <ol><li> Wählen Sie eine interessante Stelle im Protein, bei der Konformationsänderungen auftreten werden. Wählen Sie eine Aminosäure in dieser Region, um die fUAA zu substituieren. HINWEIS: Die Wahl der Position basiert auf den strukturellen Umbuchungen, die erwartet werden. Wenn eine hochauflösende Struktur existiert und eine Hypothese der erwarteten Bewegungen, sollte die Anap so platziert werden, dass sich die chemische Umgebung ändern wird; Dies könnte entweder eine Änderung der Dielektrizitätskonstante (hydrophobe versus hydrophile Umgebung) oder eher eine Abschreckung durch eine andere Aminosäure sein. Die besten Quencher sind Tryptophane. Anap sollte in Kontakt mit dem Quencher in einem Zustand (Überlappung der van-der-Waals Radien) und frei davon indas andere. Wenn keine hochauflösenden Strukturen oder Modelle existieren, müsste man die interessierende Region scannen. In jedem Fall ist es ratsam, mehrere nahe gelegene Orte auszuwählen, um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens von Expressions- und Fluoreszenzsignal zu erhöhen. Um sterische Effekte während der Proteinreifung und / oder -funktion zu minimieren, kann man große und aromatische Aminosäuren (Phe, Trp, Tyr) ersetzen. Die Autoren haben jedoch erfahren, dass das Scannen eines interessierenden Bereichs für die fUAA-Insertion unabhängig von der substituierten Aminosäure produktiver ist. </li><li> Legen Sie ein Amber Stop Codon (TAG) an der ausgewählten Stelle mit site-directed Mutagenese 15 . Stellen Sie sicher, dass das Protein von Interesse nicht auf einem Bernstein-Stop-Codon (TAG) endet. Wenn ja, mutieren Sie zu einem anderen (Ocker oder Opal Stop Codon). Amplifizieren, isolieren und sequenzieren die DNA. Erhalten Sie Protein-mRNA mit in vitro Transkription 16 und speichern Sie die mRNA bei 20 ° C oder 80 ° C. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Oozytenvorbereitung und Injektion <ol><li> Chirurgisch erhalten Stage V oder VI Oozyten aus Xenopus laevis Frösche und defolliculieren mit Kollagenase wie zuvor beschrieben 17 . <ol><li> Anästhesieren von Fröschen mit einem geeigneten Anästhetikum nach dem zugelassenen Tierprotokoll (hier: 3-Aminobenzoesäureethylester). Wenn sie nicht auf eine sanfte Prise auf eine Zehenspitze reagieren (Verlust des Rückzugsreflexes), dann werden sie für eine Operation in geeigneter Weise betäubt. </li><li> Sofort die Frösche aus der Narkosemittel entfernen und die Haut mit frischem Wasser gründlich ausspülen. Diese Spülung wird verhindern, dass das Tier in tieferen Niveaus der Anästhesie fällt, indem es unabsorbierte Chemikalien von der Hautoberfläche entfernt. </li><li> Eierstockknoten von einer Seite chirurgisch entfernen und die Knoten sorgfältig mit zwei Zangen öffnen. Inkubieren und rühren die Oozyten in &quot;Standard-Oozyten-Lösung&quot; (SOS), die 1% (w / v) Collagenase für 20-30 min enthältZu defollulieren Waschen Sie dreimal mit SOS-Lösung. </li><li> Wählen Sie große und gesunde Oozyten einzeln und inkubieren sie in Barths Lösung, ergänzt mit Antibiotika (100 U / ml Penicilin, 100 μg / ml Streptomycin, 10 mg / 100 ml Kanamycin) und 5% Pferdeserum bei 18 ° C für mindestens 4 h vor der Injektion . ANMERKUNG: Nach 2 - 4 Operationen mit einer Verzögerung von 4 Monaten dazwischen wird Xenopus laevis durch verlängerte (&gt; 1 h) Inkubation mit 3-Aminobenzoesäureethylester euthanasiert. </li></ol></li><li> Für die nukleare Injektion von DNA, bereiten Sie eine lange und dünne Injektion Spitze, um in der Lage, den Kern zu erreichen und um eine Beschädigung der Oozyte zu vermeiden. Füllen Sie die Injektionsspitze mit Öl und montieren Sie sie auf dem Nanoinjektor Gerät. <ol><li> Installieren Sie den Nano-Injektor unter einem Stereomikroskop und verwenden Sie Pinzette, um das Ende der Spitze zu brechen. Öl auswerfen, bis keine Luftblasen im Ende der Spitze eingefangen sind. </li></ol></li><li> 1 μl 0,1 μg /# 181; L pAnap in nukleasefreiem Wasser, enthaltend NaOH (1% 1 N NaOH) auf einem Stück Parafilm unter einem Stereoskop und füllen die Injektionsspitze mit der DNA. </li><li> Übertragen Sie 40 Oozyten auf eine mesh-beschichtete Injektionsschale mit Barth-Lösung, ergänzt mit Antibiotika. HINWEIS: Um die mesh-beschichtete Injektionsschale herzustellen, schneiden Sie ein entsprechendes Stück von 800 μm Nylon-Mesh aus, um eine Polystyrol-Petrischale zu füllen. Fügen Sie Chloroform in die Mitte und legen Sie dann das Netz auf die Oberseite. Halten Sie das Netz flach, bis der Plastik sitzt. </li><li> Wenn sich der Oozytenkern im tierischen (dunklen) Pol befindet, zielen Sie die Injektionsspitze in die Mitte des Tierpols und schlagen so, dass die Spitze in der Nähe des Zentrums der Tierhalbkugel (oder 2-3x der Tiefe im Vergleich zur RNA-Injektion) liegt ). Spritzen Sie 9,2 nL pAnap in den Kern jeder Oozyte ein. Die dünne Spitze und das kleine Einspritzvolumen können zu einer unregelmäßigen Injektion oder einer blockierten Spitze führen. Gelegentlich prüfen, ob die Injektion durch Einspritzen in die Luft arbeitet. HINWEIS: Ob die DNA richtig in den Kern injiziert wird, ist unsicher. Erwarten Sie daher 10 - 40% der Oozyten, um das tRNA / Synthetase-Paar nicht zu exprimieren. Siehe Diskussion zur weiteren Ausarbeitung. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Darstellung der DNA- und RNA-Injektion in Xenopus -Oozyten zur Anap-Inkorporation. Zuerst wird pAnap in den Kern der Xenopus- Oozyte injiziert ( 1 ). Nach 6-24 h werden Anap und Kanal-RNA in den Pflanzenpol ( 2 ) coinjiziert. Anap wird mit der tRNA, die ein Amber-Stop-Anti-Codon trägt, orthogonal aminoacyliert, durch die Aminosäure-tRNA-Synthetase, die durch pAnap codiert wird. Auf diese Weise werden die aminoacylierten Anap-tRNAs vom Ribosom am eingesetzten Bernstein-Stop-Codon in der Channe erkanntL RNA, was zur Unterdrückung des Stopcodons und der Insertion von Anap führt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="6"><li> Inkubieren Sie die Oozyten in 2 ml Barth-Lösung, ergänzt mit Antibiotika und 5% Pferdeserum (HS) bei 18 ° C für 6-24 h, um eine robuste Expression von anap-spezifischen tRNAs und tRNA-Synthetasen zu ermöglichen. HINWEIS: Die DNA-Inkubationszeit kann einige Tage vor der RNA-Injektion dauern, aber sie erhöht die Expression nicht. </li><li> Bereiten Sie den Nano-Injektor für die RNA-Injektion vor (wie in Schritt 2.2, aber die Injektionsspitze muss nicht so dünn sein wie bei der DNA-Injektion). Arbeit nur unter rotem Licht von diesem Punkt zu verhindern, dass Photobleaching der Anap. </li><li> Mischen Sie 1 μl 1 mM Anap mit 1 μl 1-2 μg / μL mRNA direkt auf ein Stück Parafilm und füllen Sie die Injektionsspitze mit der gemischten Lösung. Unkraut knapp unterhalb der Membran im pflanzlichen(Hellen) Pol und injizieren 46 nL in jeder pAnap-injizierten Oozyte. HINWEIS: Die erforderliche mRNA-Konzentration hängt von dem Protein von Interesse ab. </li><li> Inkubieren Sie die Oozyten, die vor Licht geschützt sind, in einer Schachtel oder in Aluminiumfolie gewickelt, in Barths Lösung ergänzte Antibiotika und 5% Pferdeserum bei 18 ° C für 2-3 Tage. Tauschen Sie täglich mit frischer Barth-Lösung aus und entfernen Sie tote Oozyten, um eine Kontamination zu vermeiden. </li></ol> 3. VCF-Setup <ol><li> Installieren Sie die aufgeschnittene Oozytenspannungsklemme wie oben beschrieben 18 . </li><li> Montieren Sie das elektrophysiologische Aufnahmesystem auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop, indem Sie die Aufzeichnungskammer auf einen Schieber einbauen, der es ermöglicht, es zwischen dem Standard-Stereoskop zu bewegen, um die Oozyte und das Mikroskop zu platzieren, um die Fluoreszenzmessungen durchzuführen (Abbildung 2c ). HINWEIS: Die Geometrie der Kammer für aufgeschnittene Oozyten ist nicht geeignet, den normalen Tra zu verwendenLicht für die Beleuchtung während der Manipulation. Daher wird eine &quot;Schwanenhals&quot; Halogenlampe mit rotem Filter verwendet, um seitlich von oben zu beleuchten. Der Kondensator des Mikroskops kann entfernt werden, um Platz für die Elektrophysiologiekammer zu senken. </li><li> Verbinden Sie ein Photodioden-Erkennungssystem mit dem C-Mount-Ausgang des Fluoreszenzmikroskops (Abbildung 2a ). Verbinden Sie die Photostromauslesung mit einem zweiten Eingangskanal im digitalen Signalprozessor (DSP, Analog / Digital - Digital / Analog - Wandler). </li><li> Verwenden Sie eine 100 W, 12 V Halogenlampe als Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung. HINWEIS: Alternativ können Hg-Brenner verwendet werden, müssen aber in der Intensität reduziert werden, um ein zu schnelles Photobleichen während der Aufnahmen zu verhindern. LED-Beleuchtung wird nur empfohlen, wenn die jeweiligen LEDs im Erregungsbereich ( zB ~ 350 nm für Anap) eine signifikante Intensität aufweisen. Die meisten weißen LEDs erreichen nicht weit in das UV-Spektrum. </li><li> InsErt einen elektrisch gesteuerten Verschluss zwischen Anregungslichtquelle und Mikroskop und verbinden seine Steuerung (typischerweise TTL-Puls) mit einem digitalen Ausgang des DSP. Zeit der TTL-Puls in der Aufnahmesoftware (siehe Herstellerdokumentation), so dass der Verschluss vor Beginn der Aufnahme ~ 100 ms öffnet. Auf diese Weise stört jede Vibration während des Öffnungsvorgangs die Aufnahme nicht. Die Zeit hängt von der Geschwindigkeit und der Vibration des Verschlusses ab. Beenden Sie den Puls 5ms vor dem Ende der Aufnahme, wie in Abbildung 4 gezeigt . Auf diese Weise wird auch der Wert für die Gesamtfluoreszenz aufgezeichnet. </li><li> Setzen Sie einen geeigneten Filterwürfel (Erregungsfilter, dichroitischer Spiegel und Emissionsfilter) in den Filterwürfelrevolver ein. Für Anap verwenden Sie Ex: 377/50 nm Bandpass, dichroitische 409 nm Langpass und Em: 470/40 nm Bandpass. </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Abbildung 3 &lt;<html> / Strong&gt; : VCF-Setup. ( A ) Seitenansicht des VCF-Setups zeigt den Lichtweg im Mikroskop. Der Filterwürfel enthält einen Erregungsfilter, einen dichroitischen Spiegel und einen Emissionsfilter. ( B ) Ausgewählte Oozytenkammerabmessungen sind 3,4 cm für den oberen Kammerradius (1), 5,5 cm für die untere Kammerlänge (2), 1,4 cm für die untere Kammerbreite (3) und 1,7 cm für die mittlere Kammerbreite (4). ( C ) Vorderansicht des VCF-Setups. Das erste Okular auf der linken Seite ist für die Montage der Oozyte in der abgeschnittenen Spannungskammer und für die Permeabilisierung. Dann wird die Kammer unter dem Mikroskop im zweiten Okular nach rechts geschoben. Hier wird die V1-Elektrode unter Verwendung des 4X-Objektivs in die Oozyte eingeführt und die Fluoreszenz wird mit dem Wasser-Immersions-40X-Objektiv aufgezeichnet. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Itle &quot;&gt; 4. VCF Aufnahme <ol><li> Befolgen Sie die Vorbereitungsschritte für die aufgeschnittene Oozytenspannungsklemme, wie zuvor beschrieben und visualisiert 18 (Agarbrückenpräparation, Montage der Oozyte, Saponinpermeabilisierung). Allerdings arbeiten unter rotem Licht zu jeder Zeit zu vermeiden, Bleichen der Fluorophor vor Aufnahmen. Beim Aufstellen der Oozyte ist darauf zu achten, dass der Tierpol nach oben zeigt. Die Pigmentierung unter der Tierpolmembran schützt vor der aus dem Cytosol stammenden Selbstfluoreszenz und reduziert daher die Hintergrundfluoreszenz. </li><li> Schieben Sie die Kammer auf das Mikroskop und fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv. </li><li> Die Oozyte mit der spannungsempfindlichen V1-Elektrode (3 M KCl) auflösen, auf das 40X-Wasser-Immersion (NA 0.8 - 0.9) -Objekt umschalten. Konzentriere dich auf den nach oben weisenden Tierpfosten. </li><li> Schalte das rote Licht aus. Wählen Sie den richtigen Filterwürfel aus, indem Sie den Filterwürfelrevolver drehen und der optische Ausgangsport mit der Photodiode verbunden ist. Schalte den Heiligenschein einEn-Lampe mit höchster Intensität und schalten Sie kurz den Auslöser für 2-5 s offen, um die Hintergrund-Fluoreszenzintensität zu lesen, die von der Eizelle stammt. Bei der beschriebenen Einstellung sollte der Wert etwa 50-200 pA für Anap sein. </li><li> Schalten Sie die Klemme ein, drehen Sie den Bad- / Schutzschalter auf aktiv und stellen Sie das Membranpotential (V1 - V2) auf das Befehlspotential ein, indem Sie den Drehknopf auf der Kopfstufe drehen. </li><li> Wählen Sie Haltepotential, Schrittprotokoll, Anzahl und Länge der Impulse etc. in der Aufnahmesoftware. Aufzeichnung von spannungsabhängigen Strömen und Anap-Fluoreszenz-Intensitäten. </li></ol> 5. Zweifarbige VCF <ol><li> Um zwei Standorte im selben Protein gleichzeitig zu überwachen, mutieren Sie eine extrazelluläre und zugängliche Aminosäure in Cystein und entfernen Sie andere Cysteine, um eine spezifische Markierung mit Thiol-Chemie zu gewährleisten. </li><li> Führen Sie Schritt 2.1-2.5 aus. </li><li> Vor VCF-Aufnahmen inkubieren Oozyten in 5 μM TMR-Maleimid in Markierungslösung für 15 min (oder andere Farbstoffe)Mit nicht überlappenden Spektren im Vergleich zu Anap). </li><li> Die Oozyten mit Etikettierlösung dreimal waschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. </li><li> Führen Sie Schritt 4.1-4.6 aus. </li><li> Setzen Sie einen geeigneten Filterwürfel für TMR (Erregungsfilter, dichroitischer Spiegel und Emissionsfilter) in den Filterwürfelrevolver ein. Wechseln Sie in den TMR-Filterwürfel, indem Sie den Filterrevolver drehen. </li><li> Lesen Sie die Hintergrundfluoreszenz für TMR wie für Anap in Schritt 4.4 beschrieben. HINWEIS: Die Etikettierung mit Thiol-Chemie führt zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz durch unspezifische Markierung in der Membran. Daher kann die TMR-Hintergrundfluoreszenz den Verstärker (&gt; 2.000 pA) sättigen. In diesem Fall nicht die Lichtintensität verringern, sondern einfach die Hintergrundfluoreszenz subtrahieren, indem der Photodiode ein Offsetstrom hinzugefügt wird. In handelsüblichen Systemen wird das &quot;Sample-and-Hold&quot; -Funktion auf dem Detektorsystem verwendet. Beachten Sie den Hintergrund-Fluoreszenzwert (mit einem 10X Neutral-Dichte-Filter) in einem Labor jAllnal, da dieser Wert nicht aufgezeichnet wird (Sättigung). </li><li> Aufzeichnung von spannungsabhängigen Strömen und TMR-Fluoreszenzintensitäten gleichzeitig wie in Schritt 4.6. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die in vivo- Aminoacylierung von tRNAs, die kontinuierlich zusammen mit der tRNA-Synthetase transkribiert werden, ermöglicht es, hohe Expressionsniveaus für Fluoreszenzmessungen zu erhalten. Für eine effiziente fUAA-Inkorporation ist es entscheidend, dass pAnap korrekt in den Zellkern injiziert wird. Aufgrund der Ungewissheit der genauen Lage des Kerns wird erwartet, dass 10-40% der DNA-Injektionen versagen, was zu nicht-exprimierenden (oder leckexprimierenden) Oozyten führt. Daher ist es wichtig, den Ausdr...

Über 200 unnatürliche Aminosäuren verschiedener chemischer und physikalischer Eigenschaften wurden in Proteine ​​in E. coli , Hefe und Säugetierzellen genetisch eingearbeitet 3 . Die unnatürliche Aminosäure wird als Reaktion auf ein spezifisches Stopcodon über ein orthogonal konstruiertes tRNA / Synthetasepaar eingebaut. Der genetische Ansatz zur Veränderung von Proteinen hat wertvolle Einblicke in die Proteinstruktur und -funktion gegeben. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Spannungs-Klammer-Fluorometrie (VCF) in Kombination mit einer fluoreszierenden UAA vor. In VCF ermöglicht die gleichzeitige Beobachtung von Funktionsdaten und strukturellen Umordnungen, die um die Fluoreszenzsonde (~ 5 Å) lokalisiert sind, eine dynamische Information mit Millisekundenauflösung 1 zu erhalten. Die fluoreszierenden Sonden verändern ihren Abschreckzustand bei lokalisierter Bewegung des Proteins. Eine Bewegung von nur 1-2 Å reicht aus, um zu signifikanten Veränderungen in der Fluoreszenz zu führenIntensität 4 Nach der Identifizierung der interessanten Stelle im Zielprotein wird die Stelle durch Punktmutation mutiert. Klassisch war der Rest zu einem Cystein mutiert worden, während jetzt ein Bernstein-Stop-Codon (TAG) für den genetischen fUAA-Einbau eingeführt wird. Das Protein wird dann in vitro transkribiert. Während andere Expressionssysteme ( z. B. Säugetierzellen) 5 , 6 , 7 verwendet werden können, sind Xenopus- Oozyten aufgrund ihrer größeren Größe für Strukturfunktionsstudien vorzuziehen, was zu einer leichteren Manipulation und einer höheren Fluoreszenzintensität (mehr Fluorophoren) führt, Zu-Rausch-Verhältnis Darüber hinaus haben Xenopus- Oozyten einen geringen Hintergrund aus endogenen Proteinen 2 , 8 , und die dunkle Pigmentierung auf dem Tierpol schützt vor der Hintergrundfluoreszenz von tEr zytosol Die Xenopus- Oozyten werden chirurgisch entfernt und DNA, die für das für die fUAA spezifische orthogonale tRNA / tRNA-Synthetase-Paar kodiert, wird in den Kern der Oozyten injiziert. Nach einer 6-24 h Inkubationszeit wird die Protein-RNA mit dem fUAA in das Cytosol der Oozyten co-injiziert, gefolgt von einer 2-3-tägigen Inkubationszeit. Um eine Beschädigung der fUAA (Photobleichung) zu verhindern, müssen die Verfahren einschließlich Anap unter rotem Licht durchgeführt werden, um eine Fluorophor-Erregung zu vermeiden. Oozyten werden auf einem aufgeschnittenen Oozytenspannungsklemmenaufbau untersucht, der auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop montiert ist und elektrische Strom- und Fluoreszenzänderungen gleichzeitig aufgezeichnet werden 9 , 10 . Alternativ können zwei Elektrodenspannungsklemmen 1 oder Patch-Clamp-Konfigurationen 11 verwendet werden. Die Fluoreszenz wird durch entsprechende Wellenlängen mit niedrigem RMS-Rauschen angeregt<html> Emission, die unter Verwendung einer Photodiode aufgezeichnet wurde, die mit einem Verstärker mit hoher Verstärkung verbunden ist. Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren (fUAAs) in der Spannungskammer-Fluorometrie. Einer ist Zugang zur cytosolischen Seite der Membranproteine; Hier befinden sich viele regulatorische Prozesse ( zB Ca 2+ - oder Nukleotidbindungsstellen, schnelle und geschlossene Inaktivierung von spannungsgesteuerten Ionenkanälen, Porenöffnung, Modulkopplung). Alle diese Prozesse sind nun für die fluoreszierende Markierung zugänglich. Ein weiterer Vorteil ist die geringe Größe der Sonde, die zu einer geringeren Störung des Proteins führt. Bisher wurden zwei orthogonale tRNA / tRNA-Synthetasepaare für fUAAs 12 , 13 entwickelt, wobei 3- (6-Acetylnaphthalin-2-ylamino) -2-aminopropansäure (Anap) die einzige FUAA ist, die in Xenopus- Oozyten verwendet wurde 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8 Anap ist ein umweltfreundlicher Fluorophor mit einem Molekulargewicht von 272,3 g / mol und ist nur etwas größer als Tryptophan 12 ( Fig. 1A, 1B ). Aufgrund ihrer geringen Größe werden wahrscheinlich weniger sterische Effekte durch das Fluorophor eingeführt, verglichen mit herkömmlichen Fluorophoren, die über einen Linker (typischerweise mehr als 500 g / mol) befestigt sind. Darüber hinaus befindet sich im Falle von Anap das Fluorophor näher an dem Proteinrückgrat als die an Cysteine ​​gebundenen, und folglich untersucht Anap mehr lokalisierte Umlagerungen. Schließlich ist die Entfernung von endogenen Cysteinen in konventionellem VCF, um eine ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, in UAA-VCF nicht mehr erforderlich und verlässt daher (i) die Proteine ​​in (fast) ihrem nativen Zustand und (ii) erlaubt es, VCF anzuwenden Um eine breitere Palette von Proteinen zu untersuchen, in denen die Funktion durch Cysteinsubstitution verändert werden kann. <img alt="Abbildung 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1 : Anap- und Fluoreszenz-Spektren. ( A ) Chemische Struktur von Anap. ( B ) Normalisiertes Absorptionsspektrum und Emissionsspektren für 1 nM Anap, was die Empfindlichkeit der Anap-Fluoreszenz gegenüber der Lösungsmittel-Hydrophobie zeigt. Emissionsspektren wurden durch Anregung bei 350 nm erhalten. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ein Nachteil bei der Verwendung von fluoreszierenden UAAs besteht darin, dass eine heterogene Population von Proteinen aus der Stop-Codon-Durchlesung, der Translationsneubinierung, den C-terminalen trunkierten Proteinen oder dem Übersprechen mit endogener Aminoacylierung resultieren kann, wenn die Menge an aminoacylierten tRNAs knapp ist. Solche Leck-Expression sollte immer in Abwesenheit von fUAA und dem tRNA / tRNA-Synthetase-Paar überprüft werden. Wir haben uns mit der Frage befasstLationaler Reinitiation und deren Umgehung für N-terminale Einführungsstellen zuvor 14 . Wenn jedoch die fUAA-, tRNA- und tRNA-Synthetase in gesättigten Mengen vorliegen, bleibt nur eine geringe Wahrscheinlichkeit der Leck-Expression bestehen. Der wesentliche prozedurale Unterschied zwischen fUAA-VCF und konventionellem VCF ist die Injektion und Handhabung der Oozyten; Die Injektion von DNA, die für die tRNA und die tRNA-Synthetase (pAnap) kodiert, folgt der Einführung von Anap, die entweder mit der Protein-mRNA co-injiziert wird oder alternativ der Inkubationslösung als Acetoxymethyl (AM) -ester zugesetzt wird.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barth&#039;s solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hydrate</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Horse Serum (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SOS Standard Oocyte Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;External recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Internal recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Labeling solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TMR stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td><td>Molcular Probes by Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM in DMSO</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anap stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Custom synthesis TCRS-170</td><td>1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Acquisition software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Custom machined</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo diode detection system</td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shutter driver</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) war die Technik der Wahl, um die Struktur und die Funktion von elektrogenen Membranproteinen zu untersuchen, bei denen Echtzeitmessungen von Fluoreszenz und Strömen gleichzeitig über lokale Umlagerungen und globale Funktion berichten. Während hochauflösende Strukturtechniken wie Kryo-Elektronenmikroskopie oder Röntgenkristallographie statische Bilder der interessierenden Proteine ​​liefern, liefert VCF dynamische Strukturdaten, die es uns ermöglichen, die strukturellen Umlagerungen (Fluoreszenz) mit dynamischen Funktionsdaten (Elektrophysiologie) zu verknüpfen. Bis vor kurzem beschränkte die Thiol-reaktive Chemie, die für die ortsgerichtete fluoreszierende Markierung der Proteine ​​verwendet wurde, den Anwendungsbereich des Ansatzes, da alle zugänglichen Cysteine, einschließlich endogener, markiert werden. Es war also erforderlich, Proteine ​​aus endogenen Cysteinen zu konstruieren. Die Etikettierung war auch auf Websites beschränkt, die von der extrazellulären zugänglich warenSeite. Dies änderte sich mit der Verwendung von fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren (fUAA), um spezifisch eine kleine fluoreszierende Sonde als Reaktion auf die Stop-Codon-Suppression unter Verwendung eines orthogonalen tRNA- und tRNA-Synthetasepaar 2 zu integrieren. Die VCF-Verbesserung erfordert nur ein zweistufiges Injektionsverfahren der DNA-Injektion (tRNA / Synthetase-Paar), gefolgt von einer RNA / fUAA-Co-Injektion. Nun ist die Etikettierung sowohl intrazellulärer als auch begrabener Standorte möglich, und die Verwendung von VCF hat sich erheblich erweitert. Die VCF-Technik wird dadurch attraktiv für das Studium einer breiten Palette von Proteinen und - noch wichtiger - ermöglicht die Untersuchung zahlreicher zytosolischer Regulationsmechanismen.

Fig. 4 zeigt ein Beispiel von VCF-Aufzeichnungen, die aus einer Oozyten-Expression von Shaker-Kanälen mit schneller Inaktivierung entfernt wurden (IR), L382stop-W434F in Gegenwart von pAnap und Anap. Die W434F-Mutation blockiert die ionischen Kaliumströme, was es ermöglicht, die transienten Gatterladungsverschiebungen (Torströme) zu messen. Die gleichzeitige Aufzeichnung von Torströmungen (obere Spur) und Anap-Fluoreszenzintensitätsänderungen (untere Spur) bei Dep...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K Aufrufe.  University of Montréal.  Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen. 

Serie: Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Forschung

Biologie

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Neurowissenschaften

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Entwicklungsbiologie

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Biotechnik

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

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