Die Arbeit wurde zum Teil durch das National Institute of Health Center of Biological Research Exzellenz [Grant-Nummer 1P20GM109005], der Arkansas Raum Grants Consortium durch National Aeronautics and Space Administration [Gewährungsnummer NNX15AK32A] und das Nationale Institut für Arbeitsschutz und Health (NIOSH) [Gewährungsnummer 2T420H008436]. Die Autoren möchten sich Christopher Fettes für das Korrekturlesen und Bearbeitung des Manuskripts danken.

1. Partikelgewinnung und Vorbereitung <ol><li> Die Kalibrierung des hohen Volumens Schwebstoffe insgesamt Sampler <ol><li> Ziehen Sie den Sampler Motor von der Massendurchflussregler und der Motor zu einem stabilen Wechselstromquelle (Abbildung 1). HINWEIS: Ein Filter wird bei diesem Vorgang nicht verwendet. </li><li> Montieren Sie den Kalibrator Öffnung und Toplader-Adapterplatte an den Sampler. Ziehen Sie die Top-Loading-Adapter Niederhalte Muttern fest, um sicherzustellen, dass keine Luftlecks vorhanden sind. Lassen Sie den Sampler Motor seine normale Betriebstemperatur zu erwärmen (ca. 10-15 min). </li><li> Führen Sie eine Dichtigkeitsprüfung durch die Löcher abdecken oben auf der Öffnung und Druckhahn an der Öffnung mit den Händen. Hören Sie ein schrilles Quietschen Klang durch Luft entweicht. Wenn dieser Ton zu hören ist, nachziehen Toplader-Adapter Niederhaltemuttern als ein Leck vorhanden ist. Wenn der Ton niedriger ist, ist das Leck in der Nähe von einem der anderen Dichtungen in den system. </li><li> Schließen Sie eine Seite eines Wasser Manometer an den Druckanschluss auf der Seite der Öffnung mit einem Gummi-Vakuumröhre. Verlassen die gegenüberliegende Seite des Manometers zur Atmosphäre hin offen. Halten Sie ein Manometer vertikal, um genaue Messwerte zu gewährleisten. Durch Tippen auf die Rückseite des kontinuierlichen Fluss Recorder wird dazu beitragen, den Stift zu zentrieren und genaue Messwerte liefern. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 unter Verwendung von fünf Flussraten darstellen Betriebsflussraten von 30 bis 60 ft / min (etwa alle 5-6 ft 3 / min). Stellen Sie den Regler auf der variablen Öffnung an fünf verschiedenen Positionen und fünf verschiedene Messungen vornehmen. </li><li> Notieren Sie sich die Umgebungslufttemperatur, Umgebungsluftdruck, Sampler Seriennummer, Seriennummer Öffnung, Öffnung Steigung und mit Datum der letzten zertifiziert, das Datum, die Standortwahl und Betreiber Initialen auf dem Kalibrierungsblatt. </li></ol></li><li> Schwebstoffe insgesamt Probensammlung und gravimetrische Analyse <ol><li> Wickeln Sie ein8 &quot;x 10&quot; Quarzfaserfilter in zwei Schichten von Aluminiumfolie. Setzen Sie den Filter eingewickelt in den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 550 ° C. Backen Sie den Filter für mindestens 4 Stunden. Lassen Sie den Ofen abkühlen und rufen Sie den Filter. Setzen Sie den Filter im Exsikkator mit CaCO3. </li><li> Wiegen des Filters in einer Mikrowaage mit einer Genauigkeit von 10 &amp; mgr; g. Wiederholen Sie die Messung dreimal während eines Tages. Einzelne Messungen sollten innerhalb von 25 ug sein. Wird dies nicht erreicht wird, kehrt die verpackte Filter in den Exsikkator und wiederholen Sie den nächsten Tag den Prozess. </li><li> Öffnen Sie den Schutz Deckel (Abbildung 2). Filter entfernen Halterrahmen durch die vier Flügelmuttern lockern, so dass die Messingschrauben und Unterlegscheiben aus dem Weg zu schwingen hinunter. Klappen Sie den Filter aus der Aluminiumfolie und gereinigt Pinzette vorsichtig zu zentrieren, rauere Seite nach oben, auf dem Trag Bildschirm. richten Sie richtig den Filter auf dem Bildschirm. </li><li> Platzieren Sie den Rahmen auf dem Bildschirm, und befestigen Sie es mitDie Messingschrauben und Unterlegscheiben, während eine ausreichende Druckaufbringungsluftverlust an den Kanten zu vermeiden. Wischen Sie Staubansammlung aus der ganzen Filterhalter mit einem sauberen Tuch. Schließen Obdach Deckel vorsichtig und sichern. </li><li> Achten Sie darauf, alle Kabel sind in die entsprechenden Aufnahmebuchsen eingesteckt und der Schlauch zwischen dem Gebläsemotor Druckanschluss und den kontinuierlichen Fluss-Recorder angeschlossen ist. </li><li> Bereiten Sie den Fluss-Recorder. Drücken Sie Stift Arm Heber Stiftspitze zu heben, und legen Sie ein neues Diagramm. Richten Sie die Lasche des Diagramms auf der Antriebsnabe des Recorders und drücken Sie mit dem Daumen-Chart Zentrum auf die Nabe zu senken. Stellen Sie die Zeit von der Antriebsnabe Dreh im Uhrzeigersinn, bis die korrekte Zeit auf Diagramm mit Zeitindex Zeiger ausgerichtet ist. </li><li> Wechseln Sie manuell auf dem Sampler und die Sammlung beginnen. Überwachen Sie den Recorder sicher sein, es ist richtig Einfärben und die verstrichene Zeit Anzeige um sicherzustellen, dass es richtig funktioniert. </li><li> Am Ende der Abtastperiode, schalten Sie den Sampler, Rekord ausdie verstrichene Zeit und das Diagramm abgerufen werden. Entfernen Sie den Rahmen um den Filter zu belichten. Entfernen Sie den freigelegten Filter aus dem Stützsieb indem sie sie sanft an den Enden mit der Zange zu halten. Falten Sie den Filter der Länge nach, so dass Probe berührt Probe zweimal und wickeln Sie es in der ursprünglichen Aluminiumfolie. </li><li> Lagern Sie den Filter in einem Exsikkator mit CaCO3 für mindestens 24 Stunden vor dem Wiegen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 das Gewicht der Filter nach der Probenahme zu messen. Setzen Sie den Filter in einer Zip-Plastikbeutel und lagern Sie es in -80 ° C bis zur Analyse. </li></ol></li><li> Die Analyse der gesammelten Schwebstoffe insgesamt Probe <ol><li> Abrufen der gespeicherten Filter, entfalten die Aluminiumfolie und übertragen Sie den Filter auf eine saubere Teflonoberfläche. Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Außen (weiß) Teil des Filters und entsorgen. <ol><li> Als nächstes schneiden Sie den Filter in 0,5 &quot;x 0,5&quot; Stücke schneiden und Stücke in einem 100 ml Kolben. 50 ml Reinstwasser. Der Kolben wird in einem UltraschallBad und beschallen bei 33 ± 3 kHz für 60 min. </li></ol></li><li> Filter Extrakt durch ein 0,45 um Polypropylen-Spritzenfilter in einen 100 ml Rundkolben. das Wasser verdampfen, um einen Rotationsverdampfer Instrument unter Druck bei 50 ° C bis ca. 5 ml Extrakt unter Verwendung bleibt in der Flasche. <ol><li> Dampfe das restliche Wasser in einem 15 ml-Birnenkolben mit bekanntem Gewicht. Wiegen Sie die Flasche mit dem Trockenextrakt und die Masse des Trockenextrakt aufzuzeichnen. </li></ol></li><li> Man löst das trockene Probe mit 400 ul D 2 O durch Beschallen für 15 Minuten und Transfer in einem 5 - mm - Standard - NMR - Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 xg bei Raumtemperatur um irgendwelche ungelösten Stoffe zu entfernen. </li><li> Wiederholen mit 300 &amp; mgr; l D 2 O. Zugabe von 10 &amp; mgr; l NaN 3 1.4% (Endkonz .: 0,02% w / v) in dem NMR - Röhrchen. Werden 10 ul (32 ug) der Gesamtmenge an suspendierten Teilchen (TSP) -D4 (3,2 mg / ml) an D 2 O (Endkonzentration 0,258 mM) in dem NMR - Röhrchen. </li><li>Erwerben 1 H - NMR - Spektren eines NMR - Spektrometers bei 600,17 MHz betrieben wird . <ol><li> Legen NMR-Röhrchen in die Tripelresonanz Kryosonde. Kalibrieren Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge: lock, tune, Shim, 90 ° Pulslängenkalibrierung und Empfängerverstärkungseinstellung. </li><li> Messen Sie Spektren bei 25 ° C mit einem 1 D Anregung Sculpting-Sequenz mit 180 Wasser-selektive Pulse in Digital-Quad-Erfassungsmodus, 8.192 Scans, 4 Dummy-Scans, Wobbelbreite von 8012,57 Hz, die Frequenz für die Wassersignalunterdrückung bei 4,70 ppm, eingestellt Offset 1,70 sec Erfassungszeit, 32.768 Zeitbereich Datenpunkte (TD), 1 ms Dauer Gradienten (p16), 100 &amp; mgr; s Erholung Verzögerung nach dem Gradienten (d16). </li></ol></li><li> Verfahren 1 H - NMR - Spektren , die durch eine Linienverbreiterung von 1 Hz und Nullfüllung um einen Faktor von 2 (65.536 Datenpunkte) anwenden. Korrigieren Sie die Phase und Baseline manuell und zu integrieren. Set TSP-d4-Peak bei 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> 2. Partikelbelastung<ol><li> Kultur einrichten <ol><li> Warm vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin-Lösung (100 U / ml), 0,25% Trypsin-Lösung und Calcium-Magnesium-freien Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) in einem Wasserbad (bei 37 ° C) für mindestens 30 min vor Kulturbeginn. </li><li> Nehmen Sie einen T75 - Kolben von 5% CO 2 Inkubator kultiviert RAW264.7 Zellen und die Zellen werden mit 2 ml vorgewärmtes PBS zweimal. </li><li> Abzulösen anhaftenden RAW264.7-Zellen vom Boden der Gewebekulturgefäß unter Verwendung von 1 ml vorgewärmtes Trypsin-Lösung, gefolgt von Abkratzen. </li><li> Sammle die Zellen aus Gewebekulturgefäß und stellen durch wiederholtes Pipettieren eine Einzelzellsuspension. Zähle die Anzahl der Zellen mit Trypan - Blau und der Platte bei einer Dichte von 8000 / cm 2 (500.000 Zellen insgesamt) in einer 100 mm - Gewebekulturschale mit vorgewärmtem kompletten Medien. Einstellen Medienvolumen auf 10 ml für eine Endkonzentration von 50.000 Zellenpro ml. HINWEIS: Verdoppelung der Anzahl der Platten, wenn DNA-Methylierungsanalyse wird ebenfalls durchgeführt. </li><li> Platzieren Sie die neu ausplattiert RAW264.7 - Zellen zurück in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C und lassen für 24 h zu befestigen. </li><li> Auch in einem Biosicherheitsschrank resuspendieren gefilterten Partikel. Beispielsweise verdünnte Teilchen in einer Konzentration von 0,5 mg / ml in sterilem PBS für eine 5 &amp; mgr; g / ml Behandlung Dosis und bei 5 mg / ml für eine 50 &amp; mgr; g / ml Behandlungsdosis. Verdünnungen bis zu Monat im Voraus gespeichert und bei -80 ° C hergestellt werden. </li></ol></li><li> Die Behandlung mit Feinstaub <ol><li> Nehmen Sie die Zellen , die aus 5% CO 2 Inkubator und überprüfen unter 10 - facher Vergrößerung ein inverses Mikroskop für das Zellwachstum unter Verwendung der Zellmorphologie, Kulturbedingungen und Kontamination. Man sollte erwarten, dass mindestens 30% konfluenten Zellen in diesem Stadium zu haben. </li><li> Aseptisch absaugen Medien sterilisierten Pipette und waschen Sie das Kulturgefäß mit 2 ml 37 ° C PBSzwei Mal vollständig die Medien entfernen und schwebenden oder toten Zellen. </li><li> Hinzufügen vorbestimmte Dosis von Partikeln mit frischem Medium in den Kulturgefäßen und inkubieren gewünschte Zeit bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. In dieser Studie wurden 72 h RAW264.7-Zellen mit PM behandeln, um die Belichtung für gleichzeitige genotoxischen und epigenotoxic Analyse parallel. HINWEIS: Die Zytotoxizität negativ auf die Qualität der zytogenetische Analyse beeinflussen können. Daher zusätzliche Assays wie Cytotoxizität, DNA-Methylierung, Western-Blotting oder Genexpressionsanalyse werden typischerweise auf behandelten Zellen durchgeführt. Expose Zellen mit dem spezifischen Assay gewünscht beschrieben und gehen. Unerfahrene Anwender können auch eine positive Kontrolle, wie Methyl Methansulfonat einschließen möchten ihre Fähigkeit zu testen CAs zu erkennen. </li></ol></li></ol> 3. zytogenetischen Assay <ol><li> Die Behandlung Zellen in der Metaphase zu verhaften <ol><li> Wärmen Sie die Colcemid sosung (10 &amp; mgr; g / ml) in einem Wasserbad 37 ° C für 30 min. Wischen Sie den Deckel mit 70% Alkohol unter einem biologischen Sicherheit Kabinett das Risiko einer Kontamination zu minimieren </li><li> Entfernen Sie vollständig die Medien aseptisch und waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml vorgewärmt PBS zweimal. </li><li> Fügen vorgewärmtes frisches Medium (2 ml Medium / 10 6 Zellen) enthält , Colcemid - Lösung (5 ul / ml) in dem Kulturgefäß und Inkubieren für 2 Std. </li></ol></li><li> Zellernte <ol><li> Warm Trypsinlösung und PBS in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min gehalten. Von diesem Schritt an ist es nicht erforderlich, aseptischen Zustand zu halten. </li><li> Komplett-Medium zu entfernen, waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml 37 ° C PBS für zwei Mal, fügen Kolben erforderliche Volumen der vorgewärmten Trypsin-Lösung (in der Regel 2 ml für 60 mm Kulturschale oder T25-Flasche und 4 ml für 100-mm-Schale oder T75 ), und setzen CO &amp; sub2 ; -Inkubator das Kulturgefäß bei 37 ° C für 1 min in 5% zurück. </li><li> Take das Kulturgefäß aus, nehmen die Zellen mit einem Schaber, und 10 ml PBS hinzufügen Trypsin Aktion zu stoppen. </li><li> Pipette nach oben und unten mindestens zehnmal Einzelzellsuspension und Transfer-Zellen in einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen zu machen. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 400 xg für 5 min in einer Ausschwingzeit Zentrifuge bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet durch leichtes Klopfen, mit 10 ml PBS, und wieder für fünf Minuten zentrifugiert werden. </li></ol></li><li> Hypotone Behandlung und Fixierung <ol><li> Vorwärmen 0,075 M Kaliumchloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 30 min. </li><li> Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und etwa 0,5 ml PBS verlassen. </li><li> brechen Sie vorsichtig das Zellpellet und Einzelzellsuspension machen eine P200 Pipette. </li><li> 4 ml vorgewärmten Kaliumchloridlösung tropfen unter leichtem Schütteln. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in hypotonischen potassium Chloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für 20 min. </li><li> Machen Sie frische acetomethanol Lösung durch Zugabe von 3-Teile Methanol mit 1-K-Eisessig. Halten Sie diese frisch zubereitet Fixiermittel bei Raumtemperatur. </li><li> Nach hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) von Fixiermittel in dem Rohr hinzuzufügen und die Lösung vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens gemischt. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. In diesem Stadium Zellpelletgröße zunimmt, werden weißlich und mehr sichtbar. </li><li> Überstand entfernen, 4 ml frisches Fixiermittel und halten bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min, entfernen Überstand und geben zwei weitere Waschungen mit 4 ml Fixiermittel. </li></ol></li><li> Slide Reinigung und Metaphasespreitung Vorbereitung <ol><li> Tauchen Glasplättchen vollständig in 10% flüssiges Detergens für 30 min. </li><li> Spülen Sie die Folien gründlich in kaltem Leitungswasser für 30 min. </li><li> Rinse gleitet dreimal mit destilliertem Wasser vollständig Reinigungsmittel zu entfernen, in destilliertem Wasser tauchen, und für eine spätere Verwendung im Kühlschrank lagern. HINWEIS: Reinigungs Dias vor dem Gebrauch Gleichmäßigkeit des Ausbringens erleichtert und Metaphase Qualität erhöht. </li><li> Drop-10 &amp; mgr; l Zellsuspension auf gekühlten nassen Rutsche und lassen Sie es über Nacht trocknen bei Raumtemperatur an der Luft. </li></ol></li><li> Die Färbung und Montage <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Giemsa-Lösung durch einen Teil der Giemsa-Lösung mit einem Teil PBS mischen und gießen Sie eine Glasküvette in. </li><li> Tauchen Sie die Folien in Färbelösung für 20 min. </li><li> Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser, um überschüssige Fleck entfernen und sofort trocknen die Folien einen Fön verwenden. </li><li> Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf der Folie, legen Sie vorsichtig mit einem Deckglas auf dem Montagemedium, lassen Sie das Medium über den Objektträger zu verbreiten langsam und entfernendas überschüssige Medium mit einem Papiertuch. Erlauben die montierte Rutsche für mindestens 1 Stunde vor dem Bewegen oder Betrachten unter einem Mikroskop zu trocknen Bewegung des Deckglases zu vermeiden. Achtung: Es ist wichtig, das Deckglas sorgfältig zu platzieren, ohne dass Blasen in diesem Schritt zu bilden. Die Verwendung von übermäßiger Hitze Blasen zu entfernen, ist nicht zu empfehlen. </li></ol></li><li> Die mikroskopische Beobachtung und Aberrationstypen <ol><li> Untersuchen Sie die Struktur CAs in Metaphase bei 100-facher Vergrößerung verbreitet eine gute Qualität Hellfeld-Mikroskop. </li><li> Ergebnis mindestens 50 bis 100 Metaphase-Spreads für jede Behandlungsgruppe für Behandlungen, die eine große Anzahl von CAs induzieren. Für kleinere Effektgrößen wird die Analyse von bis zu 300 Metaphasespreitungen beraten. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die zytogenetische Untersuchung oder mikroskopische Analyse der Zahlen oder Strukturen der Chromosomen, in erster Linie in der Metaphase-Spreads, liefert Informationen von entscheidender Bedeutung für die Prognose, die Risikobewertung und die Behandlung für verschiedene Krankheiten. Es ist nun gut etabliert, dass zytogenetische Anomalien, die mit dem Fortschreiten und die Entwicklung von verschiedenen Krankheiten verbunden sind, einschließlich Krebs. Bisher CAs wurden in allen wichtigen Tumorarten gefunden. CAs könn...

Es wurde geschätzt , dass die Exposition gegenüber Partikeln (PM) verursacht mehr als 3 Millionen zusätzliche Todesfälle jährlich, in erster Linie von Herz - Lungen - Erkrankungen und Lungenkrebs 1. Tatsächlich PM wurde als krebserzeugend für den Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (Gruppe 1), ein erhöhtes Risiko für Lungenkrebs erkannt mit Exposition gegenüber PM zugenommen hat 2 gezeigt. Interessanterweise fast alle Krebszellen beherbergen numerische und / oder strukturelle Chromosomenanomalien. Partikulärer organischer Kohlenstoff ist eine Variante, komplexe und heterogene Mischung, deren Zusammensetzung und Größenverteilung auf die Emissionen abhängig sowie physikalischen und chemischen Umwandlungen. Auf sie entfallen 35 bis 55% der städtischen PM 2.5 Masse (PM 2,5 um Größe und kleiner) und mehr als 60% der ländlichen und kontinentalen Hintergrund PM 2.5 Masse 3, 4. Die wasserlösliche Fraktion einen Anteil von 30-90% der organischen Aerosol. Eine große Anzahl von organischen Verbindungen,identifiziert wurden, einschließlich aliphatischer Kohlenwasserstoffe, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und deren oxygenierte und nitrierte Derivate, aliphatische Aldehyde und Alkohole, freie Fettsäuren und deren Salze, Di-Carbonsäuren, multifunktionelle Verbindungen, Proteine ​​und Huminsäure artigen Makromoleküle (HULIS) unter Verwendung von chromatographische Methoden gekoppelt mit massenspektrometrischen Techniken 5-8. Diese Verbindungen weisen weniger als 10-20% der partikulären organischen Kohlenstoff, wodurch die meisten organischen Kohlenstoff ist unbekannt 9. Experimentelle Beweise legen nahe, dass die Zytotoxizität, oxidativer Stress, Entzündung und bei der Entwicklung von PM-assoziierten Krankheitszuständen beteiligt sind. Es wurde kürzlich gezeigt, jedoch, dass Exposition gegenüber PM resultiert auch in einer Reihe von epigenetischen Veränderungen, einschließlich Änderungen in der DNA - Methylierung von repetitiven Elementen in beiden experimentellen in vitro - Systemen und in menschlichen Subjekten 10-12. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen derPM auf Satelliten-DNA - größere und kleinere Satelliten -, die in der heterochromatischen Region um die Zentromer der Chromosomen zu finden sind. Es wurde gezeigt , daß diese Wirkungen von der Natur persistent sein kann, wie sie für mindestens 72 Stunden nach der Exposition 12 detektiert werden. Veränderungen in der DNA - Methylierung, besonders um Zentromeren kann zur Ansammlung von Satelliten - DNA - mRNA - Transkripte, Kompromisses chromosomale Integrität während der Zellteilung führen und in der Folge in der Entwicklung einer Vielzahl von pathologischen Zuständen 13 führen. Die Anpassung der zytogenetischen Ansatz für die Analyse von CAs als Endpunkt epigenetischen Veränderungen von PM verursacht, so ist von großer Bedeutung. Hier berichten wir den Ansatz für die Umgebungs PM Sammlung und Vorbereitung, in vitro - Exposition und Analyse von CAs die murine Makrophagen RAW264.7 Modellsystem. Makrophagen umfassen die erste Verteidigungslinie gegen die inhalierte Fremdkörper und damit tseine Zelllinie dient als etablierter und der am häufigsten verwendete Modell in der Partikel Toxikologie 11, 12, 14, 15.

<table><tbody><tr><td>Total suspended particulate sampler</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murine macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM) ist eine der weltweit wichtigsten gesundheitlichen Bedenken, die verschiedene zelluläre Komponenten beschädigen können, einschließlich der nuklearen genetischen Materials. Um die Auswirkungen der PM auf nukleare genetische Integrität, strukturelle Chromosomenaberrationen erzielte in den Metaphasespreitungen der Maus RAW264.7-Makrophagenzellen zu bewerten. PM wird aus der Umgebungsluft mit einem hohen Volumen Schwebstoffe insgesamt Sampler gesammelt. Das gesammelte Material wird solubilisiert und filtriert, um das wasserlösliche, Feinanteil beibehalten. Die Teilchen werden für die chemische Zusammensetzung, die durch Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie charakterisiert. Verschiedene Konzentrationen von Partikelsuspension werden auf eine in - vitro - Kultur von RAW264.7 Makrophagen der Maus für eine Gesamtbelichtungszeit von 72 Stunden zugegeben, zusammen mit unbehandelten Kontrollzellen. Am Ende der Belichtung wird die Kultur mit Colcemid behandelten Zellen in der Metaphase zu verhaften. Die Zellen werden dann geerntet, mit hypotonischer Lösung behandelt, in acetomethanol fixiert, dropped auf Glasobjektträger und schließlich mit Giemsa-Lösung gefärbt. Die Objektträger werden untersucht die strukturellen Chromosomenaberrationen zu bewerten (CAs) in Metaphase bei 1,000x Vergrößerung breitet sich ein Hellfeld-Mikroskop. 50 bis 100 Metaphasespreitung sind für jede Behandlungsgruppe erzielt. Diese Technik ist für den Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen (CAs) wie Chromatidentyp Art bricht, Chromatidentyp Art Austausch, acentric Fragmente angepasst, dizentrischen und Ringchromosomen, Doppel Minuten, Endoreduplikation und Robertson&#39;sche Translokation in vitro nach der Exposition gegen Uhr. Es ist eine leistungsfähige Methode, um eine gut etablierte zytogenetische Endpunkt zu epigenetischen Veränderungen zu verknüpfen.

Große Sorgfalt sollte, sowie die Zeit des Jahres, in der Wahl der Position des TSP-Sampler genommen werden, wenn Sammlung durchgeführt wird. Die chemische Zusammensetzung sowie die Größe der Teilchen im wesentlichen die Ergebnisse beeinflussen können. Das Material gesammelt haben, sollten vor dem weißen Filter sichtbar sein. Eine normale Maus Metaphasespreitung wird 40 acentric Chromosomen haben. Das Ziel dieser Technik ist es, eine Änderung (oder das Fehlen davon) in dem Anteil d...

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K Aufrufe.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub. 

Serie: Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Genetik

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Immunologie und Infektion

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Biotechnik

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biologie

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines

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Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz