Name: hybrid-cut: an improved sectioning method for recalcitrant plant tissue samples
Uploaded: 2016-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.

1. Fixation and Embedding <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) <ol><li> Hinzufügen , 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 und 2,4 g KH 2 PO 4 in 800 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) und Einstellen des pH auf 7,4 mit HCl. In ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 1 l, fügen Sie dann 1000 ul Diethylpyrocarbonat (DEPC) und kräftig schütteln. Store PBS über Nacht bei Raumtemperatur und Autoklaven bei 121 ° C für 20 min am folgenden Tag. </li></ol></li><li> 1x PBS <ol><li> Verdünne das Lager 10x PBS bei Verhältnis 1:10 in ddH 2 O zu einer Endkonzentration von 0,01 M Na 2 HPO 4, 0,002 M KH 2 PO 4, 0,003 M KCl und 0,13 M NaCl zu erhalten. </li></ol></li><li> Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Bereiten Sie es unter einer Abzugshaube. Trag Handschuhe. <ol><li> Zur Herstellung von 250 ml PFA Fixativ, Wärme 100ml 1x PBS auf 70 bis 80 ° C und 1.750 &amp; mgr; l NaOH hinzu. Dann wurden 10 g Paraformaldehyd hinzufügen und gründlich mischen, bis es gelöst. Legen Sie die Lösung auf Eis und dann der pH - Wert auf 7,2 mit H 2 SO 4 (260-270 &amp; mgr; l für 100 ml) nach dem Abkühlen. </li><li> Stellen Sie das Volumen auf 250 ml mit 1 x PBS, fügen 625 ul Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,25%. Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l Triton X-100 und 250 &amp; mgr; l Tween 20 die Infiltration der Fixierungsmittel zu erleichtern. HINWEIS: Die PFA Fixativ kann, ohne seine Fixierung Fähigkeit für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol></li><li> Bereiten verschiedene Konzentrationen von Ethanol (30%, 50%, 70%, 85% und 95%) mit DEPC-behandeltem Wasser. </li></ol></li><li> Pflanzenprobensammlung <ol><li> Achselknospen <ol><li> Verwenden Sie reifen Phalaenopsis - Orchideen Pflanzen im Vier-Blatt - Stadium. Entfernen Sie vorsichtig Blätter durch die Blatt reißen nach dem midrib mit den Händen. </li><li> Mit einem scharfen Skalpell Töully Achselknospen aus der Basis des dritten und vierten Blattes auf der monopodial Schaft entfernen. </li></ol></li><li> Seed Probe <ol><li> Ernte reifen Orchidee Samenkapseln nach 4 Monaten nach der Bestäubung. Schneiden Sie Samenhülsen in Längsrichtung mit einem Skalpell. Schütteln Sie die Öffnung Samenschote vorsichtig und lassen Sie die trockenen Samen auf Filterpapier. </li></ol></li><li> Protocorm <ol><li> in einem Gewebekulturraum in einem 12 Stunden Lichtperiode und konstante Temperatur von 25 ° C Sow reifen Orchidee Samen auf einem 1 / 2x Murashige und Skoog-Agar-Platte, und zu wachsen. Beispiel grün Protocorm bei 7 Wochen nach der Aussaat. </li></ol></li><li> Protocorm artigen Körpern (PLB) <ol><li> Wachsen Orchidee PLBs auf T2 Regenerieren Agarplatten wie zuvor 10 und unter den gleichen Wachstumsbedingungen wie bei dem Schritt 1.2.3.1 beschrieben. Sammelt 10 PLBs in einer Höhe von 5 bis 8 mm. </li></ol></li><li> Blattprobe <ol><li> Sammeln Blattgewebe von einer reifen Orchidee Pflanze Phalaenopsis wie in Schritt1.2.1.1. </li><li> Mit einem scharfen Skalpell ein kleines Stück Blattgewebe zu schneiden (7 mm Länge x 5 mm Breite) von der zweiten neu entwickelten Blatt. </li></ol></li><li> Root-Probe <ol><li> Unter Verwendung der gleichen Anlage in der 1.2.1.1 Schritt beschrieben, sezieren 1 cm Länge von Gewebewurzelspitze ein scharfes Skalpell. </li></ol></li><li> Junge Spike <ol><li> Mit einem scharfen Skalpell junge Spike Gewebe aus dem Spitzenteil der Blütenstiel 10 cm in der Länge zu schneiden. </li></ol></li><li> Blütenknospe <ol><li> Excise eine kleine Blütenknospe von 5 mm im Durchmesser von Orchideenblütenstiel. Schneiden Sie ein Teil der Blütenknospe Gewebe in Längsrichtung (3 mm Dicke). </li></ol></li><li> Blattgewebe und Ährchen Gewebe von Getreide <ol><li> Cut 1 cm Länge Blattspreite Gewebe aus den ersten neu entwickelten Blätter von Reis, Weizen und Maispflanzen. </li><li> Sammle 10 Ährchen aus Pflanzen (Reis, Weizen und Mais) einen Tag vor der Blüte. </li></ol></li></ol></li><li> Fixierung<ol><li> Fix Pflanzenproben sofort, indem sie in einem Glasszintillationsröhrchen mit 15 ml eiskaltem PFA Fixativ zu übertragen. </li><li> Wenden Sie ein Vakuum (~ 720 mm Hg), um Pflanzenproben in einem 4 ° C kühlen Raum. Halten Sie das Vakuum für 15 bis 20 min (kleine Bläschen sollten aus den Proben freigesetzt werden). Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die meisten der Gewebe nach der Freigabe des Vakuums zu versenken. Halten Sie das Vakuum über Nacht und lassen Sie die Vakuum langsam am nächsten Tag. </li></ol></li><li> Entwässerung HINWEIS: Verwenden Sie die gleiche Fläschchen aus der Fixierung durch die Infiltration Schritte. Gießen oder eine Pipette, um die Lösung in dem vorherigen Schritt abfließen und mit 15 ml neue Lösung in die Phiole zu ersetzen. Je nach Beschaffenheit des Gewebes, zu behandeln härtere Gewebe wie Orchidee Achselknospe, Samen, Protocorm und PLB und die Ährchen von Reis, Weizen und Mais für eine längere Zeit; Behandlung weicher Gewebe wie Orchideenblütenknospe, jung Spitze, Blatt und Wurzel, und das Blatt von Reis, Weizen und Mais für eine kürzere Zeit. <ol&gt; <li> Nach der Fixierung tauchen für 10 Minuten auf Eis, um die Probe in 15 ml 1x PBS. <ol><li> Dehydratisieren Proben in 15 ml Ethanolreihe bei Raumtemperatur wie folgt: 30% Ethanol für 30 min, 50% Ethanol für 30 min, 70% Ethanol für 1 h, 85% Ethanol für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, 95% Ethanol für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, und 100% Ethanol zweimal für 54 min für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe. HINWEIS: Pflanzenproben in 70% Ethanol bei 4 ° C mehrere Monate gelagert werden. </li></ol></li></ol></li><li> Paraffin Infiltration <ol><li> Infiltrieren Proben mit 15 ml Ethanol und Xylolersatz Gemisch 54 min jeweils für härtere Gewebe und 30 min für weichere Gewebe, bei Raumtemperatur wie folgt: Ethanol / Xylolersatz (2: 1, v / v), Ethanol / Xylolersatz (1 : 1, v / v), Ethanol / Xylol-Ersatz (1: 2, v / v) und reines zweimal Xylolersatz. Achtung: Xylol ist giftig. Führen Sie diesen Schritt in Abzug durchführen. </li&gt; <li> Infiltrieren Probe in dem Fläschchen mit 15 ml Xylolersatz und Paraffingemisch in einem Ofen bei 60 ° C, über Nacht für härtere Gewebe und für 60 min für weichere Gewebe, wie folgt: Xylolersatz / Paraffin (2: 1, v / v), Xylolersatz / Paraffin (1: 1, v / v), und Xylolersatz / Paraffin (1: 2, v / v). </li><li> Infiltrieren Probe mit 15 ml reinem Paraffin zweimal täglich und Inkubation in einem Ofen bei 60 ° C. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.5.3 am nächsten Tag. </li></ol></li><li> Gewebeeinbettung <ol><li> Schalten Sie die Kraft des Gewebeeinzentrum 1 Stunde im Voraus das Wachs in dem Paraffinbehälter zu schmelzen, bevor Gewebe in einem Paraffinblock eingebettet ist. </li><li> Warm up der Metallformen (Größe der Basis 3,3 cm Länge x 2 cm Breite) auf der Warmhalteplatte bei 62 ° C, und gießen Sie ca. 13 ml geschmolzenem Wachs in die Form Basis. </li><li> Übertragen einer Gewebeprobe aus dem Abschnitt 1.5.4 in die Form mit erwärmter Zange und richten Sie sie in die gewünschte Position. </li><li> Bewegen Sie die Formvorsichtig auf die Kühlplatte und lassen, bis das Wachs verfestigt wird. </li></ol></li></ol> 2. Die Gewebe Sectioning <ol><li> Paraffinschnittverfahren <ol><li> Machen Sie eine Wachsbasis durch eine Einbettungskassette auf der Oberseite einer Form (gleiche Größe im Abschnitt 1.6.2) das Aussetzen, füllen mit geschmolzenem Wachs und entfernen Sie die Form, nachdem das Wachs verfestigt wird. HINWEIS: Die Einbettungskassette wird eine Wachsbasis bilden die Probe Paraffinblock zu verankern. </li><li> Schneiden Sie den Paraffinblock in eine geeignete Form und Größe, und legen einige Wachsstücke auf einem flachen Spatel. Erhitzen Sie das Wachs Stücke einen Spiritusbrenner, bis das Wachs schmilzt und setzen es dann um das geschmolzene Wachs auf dem Wachsbasis in Abschnitt 2.1.1 um den Block zu halten. Klemmen Sie es in dem Mikrotom. </li><li> Legen Sie eine neue Klinge auf das Mikrotom, und stellen Sie den Winkel bis 5 Grad, um die Schnitte in das Mikrotom zu erleichtern. </li><li> Schneiden Sie die Probe Paraffinblock in dünne Scheiben (10 &amp; mgr; m), wie zuvor 11 beschrieben. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Hybrid-Cut-Methode sectioning <ol><li> Schneiden Sie die Probe Paraffinblock von Schritt 1.6.4 auf eine Säule mit einer Trapezfläche an der Spitze auf eine geeignete Größe mit einer Rasierklinge. </li><li> Fügen Sie etwas optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) zur Mitte des Kryostaten Bühne. Bringen Sie den Paraffinblock zu dem Kryostaten Bühne und dann orientieren schnell den Gewebeblock in die gewünschte Position. </li><li> Übertragen Sie die Paraffinblock / Stufe zu einer Kryostatkammer. Lassen Oktober für 10 min auf Schnellgefrier bar bei -42 ° C zu verfestigen. Sie nicht den Block während der Erstarrung von OCT (2C) zu bewegen. </li><li> Lassen Sie den Kryostaten Adapter und Kammertemperatur abkühlen bis zu -20 ° C und -16 ° C jeweils vor dem Paraffinblock / Stufe mit dem Kryostaten Adapter befestigen. Abschnitt Geweben bis 10 um in der Dicke. </li><li> Pick-Gewebeschnitte mit einer Pinzette. Schwimmer in den Abschnitten über 800 &amp; mgr; l DEPC-behandeltem Wasser in einem Poly - L - Lysin coated Rutsche und bei 42 ° C, um die Dias auf einer heißen Platte übertragen. </li><li> Lassen Sie die Abschnitte bei 42 ° C auf DEPC-behandeltem Wasser zu glätten. Verwenden Sie Filterpapier, um das Wasser vom Rand abfließen. </li><li> Berg Gewebe auf dem Schlitten durch den Schieber auf einem 42 ° C heißen Platte über Nacht platzieren. </li></ol></li></ol> 3. Gewebefärbung <ol><li> Entparaffinierung <ol><li> Sammeln Sie die Folien von der heißen Platte und legen Sie sie in einem Färbebank. In 150 ml Xylol in einem Färbeküvette in Dunstabzug und tauchen Sie das Rack in Xylol für 5 min. </li></ol></li><li> Rehydrierung <ol><li> Bereiten verschiedenen Konzentrationen von Ethanollösungen (100%, 95%, 70%, 50% und 30%) in DEPC-behandeltem Wasser und füllt 150 ml Lösung in verschiedene Färbeschalen, respectively. </li><li> Rehydrieren der Proben durch eine Reihe von Ethanolkonzentration abnimmt, wobei jeder Schritt für 3 min bei Raumtemperatur. Die Objektträger in der Färbebank ein Gefäß in ein anderes Gefäß mit different Ethanolkonzentrationen: 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, 50% Ethanol und 30% Ethanol. </li><li> Nach Rehydrierung, tauchen die Proben in ddH 2 O 3 min. </li></ol></li><li> Hämatoxylin-Färbung <ol><li> Stain Gewebeproben von Gewebeschnitten in Hämatoxylinlösung für 1,5 min eingetaucht wird. </li><li> Spülen kurz in ddH 2 O , enthaltend 1 bis 2 Tropfen 12 N Salzsäure (HCl) für ein paar Sekunden, und dann kurz waschen in ddH 2 O. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Dehydratisieren der Proben durch eine Reihe von zunehmenden Ethanolkonzentrationen für 3 min bei Raumtemperatur: 30% Ethanol, 50% Ethanol, 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol. Deaktivieren Sie die Proben mit Xylol in der Abzugshaube für 5 min. </li></ol></li><li> Montage <ol><li> Drop-in geeigneter Weise 600 ul Xylol-basierten Montagemedium auf Folie. Vorsichtig ein Deckglas über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen bilden Bilder von guter Qualität zu erhalten. </li><li> Lassen Sie die Folien über Nacht trocknen an der Luft. Beachten Sie die Probe unter einem Mikroskop am nächsten Tag. Hinweis: Die Bilder wurden bei 25X bis 400X Vergrßerung erfasst abhängig von der Größe der Proben. </li></ol></li></ol> 4. In Situ Hybridization <ol><li> Probe-Synthese <ol><li> Klon Phalaenopsis aphrodite Actin genspezifischen codierende Sequenz unter Verwendung der Primer 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;und 5&#39;- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3&#39; (242 bp PCR - Amplikon zu erhalten) und CyclinB1; 1 - Gen - spezifischen Kodierungssequenz unter Verwendung der Primer 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39; und 5&#39;- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;(um 327 bp PCR - Amplicon) , wie 12 beschrieben. </li><li> Ligieren die spezifischen codierenden Sequenzen in Vektoren (zB pGEMT) nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Erzeugen Digoxigenin (DIG) markierte Sense und Antisense-Sonden unter Verwendung von SP6 / T7 DIG RNA Labeling Kit nach Herstelleranweisungs. </li></ol></li><li> In situ Hybridisierung <ol><li> Schneiden Sie die 2. und 3. Achselknospe Gewebeschnitt (10 &amp; mgr; m Dicke) erzeugt , um die Hybrid-Cut - Verfahren, und montieren Scheiben auf beschichtete Folie. </li><li> Entparaffinieren Gewebeschnitte in Xylol (siehe 3.1.1), rehydrieren Konzentrationen von Ethanol (siehe 3.2.2) und Verdau mit 2 mg / ml Proteinase K bei 37 ° C für 30 min in abnimmt. </li><li> Führen in situ Hybridisierung gemäß dem Protokoll vorher beschriebenen 11,13 mit einigen Modifikationen, dh mit Hybridisierungstemperatur für Actin als 59 ° C und 60 ° C für CyclinB1;. 1 Hybridisieren Objektträger mit 40 ng DIG-markierter RNA - Sonde. </li><li> Verwenden Nitroblautetrazolium / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl - phosphat (NBT / BCIP) -Lösung Hybridisierungssignale zu erfassen , wie 11 beschrieben. </li></ol></li></ol>

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Pflanzenzellen haben starren Zellwände, zähen Fasern, Kristalle und hohem Wassergehalt, die Gewebe Zerreißen Probleme bei Pflanzengewebe Schnitte verursachen. Obwohl Paraffinbasis Sektionieren häufig für Pflanzengeweben verwendet wird, zerreißen die endogene Kristalle oft das Pflanzengewebe während des Schneidens (Abbildung 1). Aufgrund der von Natur aus hohen Wassergehalt innerhalb der Pflanzenzellen, Kryostat-basierte Schnitte verursacht häufig gebrochene Zellen und rissig Gewebeschnitten. In der vorliegenden Studie wird eine kombinierte Paraffineinbettung und Kryoschnittes Protokoll Hybrid-Cut genannt wurde entwickelt und gute Qualität Gewebeschnitte wurden erhalten. Dieses Protokoll löst das Problem mit hohem Wassergehalt assoziiert durch Paraffineinbettung Einführen und verringert die Reißwirkung durch während des Schneidens (Abbildung 3) Paraffinwachs bei niedriger Temperatur aushärtet. Daher ist dieses modifizierte Protokoll vorteilhaft entweder über Paraffinbasis Sectioning oder Kryoschneiden Pflanzengewebe Integrität zu bewahren. Dieses Manuskript zeigt , dass die Hybrid-Cut - Verfahren bewahrt Gewebeintegrität in vielen Geweben von Phalaenopsis - Orchideen wie Achselknospe, Samen und PLB, etc., die ein hohes Maß an Kristallen (Abbildungen 3-4) enthalten. Darüber hinaus ist dieses Protokoll zugänglich Getreidekulturen wie Fortpflanzungsorgane und Blätter von Reis, Mais und Weizen , die mit hohem Siliciumdioxidgehalt (Abbildungen 5-6) enthalten. Vermutlich kann dieses Protokoll angewendet werden, um Pflanzen zu holzig hohe Faser enthält. In der Regel gründlich Festsetzung Gewebe ist sehr wichtig für Hybrid-Cut. Wir fanden , dass Formaldehyd-Alkohol-saure Säure (FAA) Fixiermittel besser ist als PFA die Gewebeintegrität von einigen widerspenstigen Geweben wie axial Knospen, Wurzeln, etc. Allerdings, PFA funktioniert besser als FAA bei der Erhaltung der RNA - Integrität zu erhalten. Daher wird empfohlen, PFA zu behebenProbe für die in - situ - Hybridisierung (ISH) Arbeit. Das hier beschriebene Protokoll wird für RNA ISH Experiment entworfen. Daher wurden alle Reagenzien hergestellt RNA-Abbau zu vermeiden, durch RNase Kontamination durch DEPC Behandlung beseitigt werden. Wenn Hybrid-Cut Abschnitt ist für anatomische Studien, regelmäßige Umkehrosmose (RO) Wasser und die davon abgeleiteten Puffer oder Reagenzien sind akzeptabel. Reduktionsprobengröße und der Dicke auf weniger als 3 mm ist für die Infiltration hilfreich. Außerdem sind zunehmende Tauchzeit zur Entwässerung und Infiltration für harte Textur Gewebe notwendig. Begrenzung dieses Protokoll könnte Probleme aufgrund von unzureichender Fixierung verursacht, Dehydrierung und Infiltration der Probe. Daher Einstellung der Verarbeitungszeit für jeden Schritt ist entscheidend für gute Qualität Paraffinblock zu erzeugen. Normalerweise braucht härtere Gewebe längere Bearbeitungszeit als weicher Gewebe. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Hybrid-Cut erfolgreich in Kombination wi gearbeitetth ISH räumliche Verteilung der ausgewählten Transkripten (Figur 7) bereitzustellen. Zusammenfassend ist dieses Protokoll für die Untersuchung der Pflanzenanatomie und stellt eine gewebespezifische RNA Karte der ausgewählten Gene nützlich. Zusätzlich kann es andere molekulare Studien wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay, Fluoreszenz - in situ - Hybridisierung (FISH) und Immunfärbungstechniken angewendet werden. Im Ergebnis ist dies eine verbesserte Gewebeschneide Protokoll sowohl nützlich und hilfreich für Forscher in Pflanzengemeinschaften.

Die Paraffinbasis Schnittverfahren ist eine weit verbreitete Technik für anatomische Studien. Erhaltung der intakten Gewebes Anatomie ist wichtig für die morphologische und biologische Untersuchungen. Das Paraffin eingebettete Schnitte Technik ist vorteilhaft, da Paraffineinbettung Zell- und Gewebemorphologie behält. Zusätzlich Paraffinblöcke können bequem für längere Zeit gelagert werden. Allerdings, in Paraffin eingebettete Schnitte ist für Pflanzengewebe enthält, intrazellulär Kristalle nicht geeignet. Kristalle innerhalb der Zellen häufig Paraffin Bänder und Gewebe schädigen Integrität reißen während des Schneidens. Im Gegensatz zu Paraffin Schneide ist Kryoschneiden relativ schnell und Abschnitte können ohne Fixierung, serielle Dehydratation oder Einbettmediums Infiltration 1 erhalten werden. Kryoschnitte sind kompatibel mit vielen Anwendungen , wie der Immunhistochemie, Hybridisierung in situ, und Enzymhistochemie. Der andere Vorteil von Kryoschneiden istdaß dieses Verfahren geht nicht durch ein Spannungs Denaturierung Prozesse wie hohe Temperatur und chemischen Behandlungen werden so zelluläre Moleküle gut innerhalb der Gewebeabschnitte 2 erhalten. Kryoschneiden ist im allgemeinen bevorzugt über Paraffinbasis für Studien in tierischen Geweben sectioning. Allerdings ist Kryoschneiden nicht die erste Wahl in Pflanzen, weil Gefriertemperatur manchmal Bildung von Eiskristallen verursacht, die die Qualität der Abschnitt Integrität beeinträchtigen. Obwohl osmoregulation wie Saccharoselösungen, Polyethylenglykol (PEG) oder Glycerin - 3 berichtet Kristall Eisbildung unter Gefrierbedingungen zu verringern, ist die Verbesserung geringer als optimal. Zur Anpassung an unterschiedliche Umgebungen, verschiedene Pflanzen haben oft unterschiedliche Gewebebeschaffenheit und Pflanzenzellen entwickelt haben starren Zellwände, zähen Fasern zu bilden, und Kristalle 4,5. Zum Beispiel sind unlösliche Kalziumoxalatkristallen und Kieselkörper relativ häufig inPflanzen 6. Silicate Körper / Kristalle wurden berichtet wird, um Anlagenarchitektur erhalten, Geradheit, und Verhütung von Krankheiten oder Schädlings in Getreidepflanzen 7-9. Die Topf Orchideen und Schnittblumen Orchidee Markt floriert und es ist eine wachsende Branche. Phalaenopsis aphrodite (Phalaenopsis) ist einer der wichtigsten Export Zierpflanzen in Taiwan. Erhebliche Anstrengungen wurden unternommen , um die morphologischen und physiologischen Veränderungen der Blüten Prozesse in Phalaenopsisorchideen zu verstehen gemacht. Floral Spitzen von Phalaenopsisorchideen aus Achselknospen an der Blattbasis eingeleitet. Nach einer Zeit der kühlen Umgebungstemperatur (etwa eineinhalb Monate), Achselknospen vergrößern, brechen dormancy und ragen aus dem Blattbasis in jungen Blumenspitzen zu entwickeln. Um die physiologischen verstehen, zellulären und molekularen Prozesse der Spitze Initiation ist es wichtig, eine stabile anatomische Technik zu entwickeln, um Visualize Gewebe oder Marker in einer angemessenen Weise. Doch das Vorhandensein von allgegenwärtigen Kristalle in Orchidee Geweben, insbesondere in Achselknospen, macht anatomische Arbeit schwierig. Hier haben wir versucht, Abschnitt Integrität von widerspenstigen Pflanzengewebe zu verbessern, die als technisch anspruchs bisher angesehen wurden. Hier zeigen wir ein verbessertes Protokoll namens Hybrid-Cut. Es ist ein Paraffinbasis Schnittverfahren, das einen Kryostaten durchgeführt wird. Paraffinausgießstation löst mit hohem Wassergehalt in Pflanzengewebe. Sectioning bei niedrigen Temperaturen härtet der Paraffinblock, reduziert Kristall Problem zu reißen, und die Integrität Gewebe erheblich verbessert. Dieses Protokoll deutlich verbessert die Gewebeintegrität für widerspenstige Pflanzenproben.

<table><tbody><tr><td>Embedding Center model EC780-1</td><td>CSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome model RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat model CM 1950</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Scope A1 microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog medium including vitamins</td><td>Duchefa Biochemia</td><td>M0222.0050</td><td></td></tr><tr><td>RNase free surface decontaminant</td><td>Apex</td><td>10-228</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Bio Basic Inc.&amp;nbsp;</td><td>D801154</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, crystal (KCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Showa</td><td>19430160</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20)</td><td>J.T. Baker</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100)</td><td>J.T. Baker</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials</td><td>Newastar</td><td>DG60805-00020</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator vacuum</td><td>Violet Bioscience Inc.</td><td>TS-402030</td><td></td></tr><tr><td>Rotary vane pump RZ2.5</td><td>Vacuubrand</td><td>36149406</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>J.T. Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Sub-X&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803670</td><td>Xylene substitute</td></tr><tr><td>Paraplast Plus&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>39602004</td><td>Tissue embedding paraffin</td></tr><tr><td>SUPERFROST micro slide glass</td><td>Matsunami</td><td>S7441</td><td></td></tr><tr><td>FSC 22 Clear&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801480</td><td>Optimal Cutting Temperature compound (OCT)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylenes, Purified</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>HX305311</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Micromount</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801731</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>pGEM T-easy vector</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP stock solution</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrid-cut: an improved sectioning method for recalcitrant plant tissue samples

Anlagenteil Integrität Pflege ist wichtig für an der Zell-, Gewebe- detaillierten anatomischen Strukturen zu studieren oder sogar Organebene. Allerdings haben einige Pflanzenzellen starren Zellwände, zähen Fasern und Kristallen (Calciumoxalat, Siliciumdioxid, etc.) und mit hohem Wassergehalt , die stören oft Gewebeintegrität während des Schneidens Pflanzengewebe. Diese Studie stellt eine einfache Hybrid-Cut Gewebe Schnittverfahren. Dieses Protokoll modifiziert eine Paraffinbasis Sektionieren Technik und verbessert die Integrität von Gewebeschnitten aus verschiedenen Pflanzen. Pflanzengewebe wurden in Paraffin eingebettet, bevor bei -16 ° C in einem Kryostaten sectioning. deutlich Sectioning bei niedrigen Temperaturen gehärtet, um die Paraffinblöcke, reduziert Reißen und Kratzen und eine verbesserte Gewebeintegrität. Dieses Protokoll wurde erfolgreich sowie widerspenstigen Gewebe wie reproduktives orga zu Kalziumoxalat-reiche Phalaenopsisorchidee Gewebe aufgetragenns und Blätter von Reis, Mais und Weizen. Darüber hinaus könnte die hohe Qualität von Gewebeschnitten von Hybrid-Cut in Kombination verwendet werden , mit in - situ - Hybridisierung (ISH) räumliche Expressionsmuster von Genen von Interesse bereitzustellen. Abschließend ist dieses Protokoll besonders nützlich für die widerspenstigen Pflanzengewebe mit einem hohen Kristall oder Silica-Anteil. Gute Qualität Gewebeschnitte ermöglichen morphologische und andere biologische Studien.

Hybrid-Cut Verbessert die Integrität von Gewebeschnitten die Anatomie der reproduktiven Blüthenbau zu verstehen, ist wichtig, um die zugrunde liegende Mechanismus der Blütenbildung in Orchideen für die Untersuchung. Allerdings macht die Akkumulation von intrazellulären Calcium - Oxalat - Kristalle in Phalaenopsisorchideen solche Studien , die eine anspruchsvolle Aufgabe. Um die Probleme im Zusammenhang mit umgehen , indem Kristalle während des Schneidens verursacht Reißen (Abbildung 1), entwickelten wir ein System , das wir Hybrid-Cut genannt. Dieses Protokoll verbindet traditionelle Paraffineinbettung und Kryoschnittes Techniken. Wir testeten erste Hybrid-Cut in Achselknospen von Phalaenopsis - Orchideen , weil sie für die Gewebesteifigkeit und hoher Kristallgehalt berüchtigt sind. Axillary Knospe Gewebe in 4% wurde PFA (siehe Protokoll, Schritt 1.3). Nach Serien Ethanol-Dehydratisierung und Paraffinwachs infiltration, die Achselknospe in einem Paraffinblock eingebettet. Der Block wurde auf eine geeignete Größe zugeschnitten vor (2A) sectioning. Eine kleine Menge der OCT wurde dann in der Mitte des Kryostaten Stufe (2B) aufgebracht ist . Der Paraffinblock wurde dann auf die Stufe über Oktober haftete. Die Stufe wurde in einem Kryostat für 10 min inkubiert vollständigen Verfestigung der OCT zu ermöglichen , bevor sectioning (2C) , und dann Kryoschnitt wurde in einem -16 durchgeführt ° C Kammer (2D). Als Vergleich wurde ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthält, Schnitte regelmäßigen Mikrotom ausgesetzt. Wie in 1A gezeigt, schwere Einreißen der Paraffin Bändern wurde nach Mikrotom Schnitte beobachtet. Die Gewebeintegrität und Zellstruktur wurde ebenfalls beeinträchtigt (1B). Hybrid-Cut, auf der anderen Seite,hergestellt intakte Gewebeschnitte (3A) mit konservierten strukturellen Integrität (3B). Die Anwendung der Hybrid-Cut zu verschiedenen Geweben von P. Aphrodite Um die Ansprechbarkeit von Hybrid-Cut zu testen, die wir getestet verschiedenen Geweben von Phalaenopsis Orchideen. Es ist oft schwierig Abschnitte von Samen mit Integrität gute Gewebe weil der gehärteten Samenschalen zu erhalten. Unter Verwendung dieses Protokolls, detaillierten Strukturen der Samen wurden nach sectioning (4A) aufbewahrt. Wie in 4A, Eiweißkörper gezeigt, 14 die gemeinsamen Speicherprodukte werden konnte eindeutig identifiziert werden . Hybrid-Cut arbeitete auch erfolgreich und zeigte die detaillierte Strukturen des Sprossapikalmeristem des einmonatigen alten Protocorm (die gekeimten Struktur aus einem Samen) (4B) undProtocorm-like-Körper (PLB, 4C). Die intrazellulären Kristalle wurden in Abschnitte von PLB. Phalaenopsisorchideen haben dicke und saftigen Blätter beobachtet und sie führen Crassulacean-Metabolismus (CAM) -Typ Photosynthese 15. Der Querschnitt der Blattspreite zeigte große Mesophyllzellen und Gefäßbündel enthält Xylem und Phloem (4D). Paar stomatal Öffnungen wurden auf der abaxial Blattoberfläche während der Tageszeit (4D) beobachtet. In der Tat entwickelte CAM - Pflanzen Kohlenstoff Gewinn zu maximieren , sondern gleichzeitig den Wasserverlust durch ihre Stomata öffnen in der Nacht unter trockenen Bedingungen 15,16 minimieren. Die Wurzel Apikalmeristems von P. aphrodite ist in 4E gezeigt. Die Wurzelspitze Zellen erschien eine beträchtliche Anzahl von Kristallen enthalten, die nach dem Schneiden (4E) erhaltene sehr gut waren. Längsschnitte der jungen Blumen Spikes versehen informatIonen über die Architektur der jungen Blumen primordials (4F). Außerdem Kelchblätter, Blütenblätter, labellum und pollinia deutlich von dem Längsschnitt der jungen Blütenknospen identifiziert werden konnten, die eine Differenzierung in dieser 5 mm Blütenknospe (4G) abgeschlossen haben. Beachten Sie, dass Kristalle in den Kelchblättern der jungen Blütenknospen angesammelt wurden. Kurz gesagt, funktioniert dieses Protokoll konsequent Gewebeintegrität zu erhalten und intakte Morphologie ermöglicht anatomische und mögliche zelluläre Studien produziert. Hybrid-Cut Behält Gewebeintegrität in Getreidekulturen Wir auch Hybrid-Cut auf Getreide wie Reis, Weizen und Mais getestet, hohem Silica - Anteil 17,18 enthalten. Wie in 5 gezeigt, wurden die Gewebeintegrität von Querschnitten von Reis, Weizen und Maisblätter wesentlich durch die Hy verbessertebrid-Cut-Verfahren. Xylem, Phloem, Mesophyllzellen, Stomata und bulliform Zellen, die der Blattspreite unkontrolliert ins Rollen Wasserverlust zu vermeiden, wurden aus Abschnitten von Reisblättern eindeutig identifiziert werden. Der Kranz Anatomie, Mesophyllzellen und Gefäßbündel des Maisblatt 19,20 wurden eindeutig identifiziert. Es war interessant eine hohe Dichte von Stomata auf zu finden sowohl die adaxial und abaxial Seiten Maisblättern (Abbildung 5). Das Verhältnis von adaxial und abaxial Stomata von 0,7 in Mais wurde bisher 21 berichtet. Darüber hinaus arbeitete dieses Protokoll auch erfolgreich die detaillierte Morphologie der Zellen von Ährchen aus Reis, Weizen und Mais (Abbildung 6) zu liefern. Ährchen sind dafür bekannt, reichlich Kieselsäure 9 enthalten. Normalerweise, das führt zu Schwierigkeiten bei der Durchführung von Gewebe Schnitte. In Situ Hybridization <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Genomic und transkriptomischen Ansätze werden häufig die Funktionen von Genen zu annotieren verwendet. Die Bereitstellung der räumlichen Verteilung der Transkripte der Gene von Interesse in Entwicklungs- oder ökologischen Rahmenbedingungen ist wichtig , neue Einblicke in die möglichen Funktionen der Gene hinzuzufügen. In-situ - Hybridisierung (ISH) entwickelt wurde , Genexpressionsmuster auf der Ebene der Gewebe 11 zu lokalisieren 22-25. Zusätzlich kann ISH bieten zellulären und in einigen Fällen subzellulären, Auflösung von mRNA Verteilung in mehrzelligen Organismen 26. Während der ISH, ist RNA und Gewebeintegrität wesentlich zuverlässige räumliche Informationen über das ausgewählte Transkript zu erhalten. Wir testeten ISH das Hybrid-Cut - Protokoll Aktin - Gen (PATC157348) kloniert wurde unter Verwendung der Primer 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;und 5&#39; AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3 &#39;zu bekommen 242 bp PCR - Amplikon Cyclin B1:.. 1 (PATC146999) Genspezifischen codierende Sequenz unter Verwendung der Primer 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;Und 5&#39; ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;327 bp PCR-Amplikon zu erhalten. Nach ISH, Actin und Cyclin B1: 1 - Genexpression wurde in junge und reife Achselknospen überwacht (Abbildung 7). Beide Gene wurden in meristematischen Zellen von 2. und 3. Achselknospen ausgedrückt, mit stärkeren Signalen in 3 rd Achselknospen detektiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass Hybrid-Cut gute Anatomie behalten und räumliche Genexpressionsmuster liefern. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" /> Abbildung 1: Traditionelle Paraffin Abschnitt verursacht schwere Zerreißen von Gewebe Ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthielt , wurde regelmäßig Mikrotom Schnitte unterzogen.. Arges Reissen der Paraffin Bänder wurde nach traditionellen Mikrotom Schnitte (A) beobachtet </strong&gt;. Die Gewebeintegrität und Zellstruktur wurde auch (B) beeinträchtigt werden . Die Pfeile zeigen die starke Abreißen des Gewebeschnitts. Pfeilspitze zeigt die Kristallkörper. Maßstabsbalken 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Hybrid-Cut Schnittverfahren Ein Achselknospe Gewebe wurde in PFA fixiert und Gewebe wurden dehydriert, infiltriert mit Paraffinwachs und in einem Paraffinblock eingebettet. Der Paraffinblock wurde auf eine geeignete Größe (A) getrimmt. Optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) wurde in der Mitte des Kryostaten Stufe (B) aufgetragen. Der Paraffinblock wurde in den Oktober auf dem Kryostaten Stufe angebracht. Bei niedriger Temperatur, der Paraffinblock<html> wurde in den Kryostaten Stufe über OCT (C) eingehalten werden . Gewebeschnitte wurden in der Kryostatkammer bei -16 ° C (D) geschnitten. Maßstabsbalken repräsentieren 0,5 cm (A) und 1 cm (BD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" /> Abbildung 3: Hybrid-Cut Verbessert Abschnitt Integrität Ein Paraffinblock eine Achselknospe von Phalaenopsis - Orchideen enthielt , wurde auf Hybrid-Cut ausgesetzt sectioning (A) und das Hybrid-Cut - Verfahren hergestellt Abschnitte mit ausgezeichneten Gewebeintegrität (B).. Die Pfeilspitze zeigt die endogene Kristallkörper in der Achselknospe Gewebe eingebettet. Maßstabsbalken 100 um.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" /> Abbildung 4: Anwendung von Hybrid-Schnitt auf verschiedene Gewebeschnitte von Phalaenopsis - Orchideen Verschiedene Orchidee. Gewebe wurden unter Verwendung der Hybrid-Cut - Verfahren, wie im Längsschnitt Orchideensamen , die im reifen Stadium (A), im Längsschnitt Protocorm (B), Längsschnitt von Protocorm artigen Körpern (PLB) (C), Querschnitt im Schnitt von Blattspreite (D), Längsschnitt Wurzel (E), Längsschnitt der jungen Blumenspitze (F) und Längsschnitt der jungen Blütenknospen (G). Gewebeschnitte wurden durch Hämatoxylin gefärbt. SC, Samenmantel; PB, Proteinkörper; M,meristem; MP, Mutter PLB; DP, Tochter PLB; Ad, adaxial Blattoberfläche; Ab, abaxial Blattoberfläche; St, Stomata; MC, Mesophyll-Zelle; VB, Gefäßbündel; RC, Wurzelkappe; fb, Blütenknospe; Se, Kelchblatt; Pe, Blütenblatt; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, Kallus. Pfeilspitzen zeigen Kristalle. Maßstabsbalken stellen 20 &amp; mgr; m (AE) und 200 &amp; mgr; m (FG). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Hybrid-Cut Behält Blattgewebe Integrität in mehreren Getreidesaaten Vergleich von Blattgewebe der traditionellen Paraffin - Verfahren (linkes Feld) und die Hybrid-Cut - Technik in dieser Studie (rechte Tafel) entwickelt worden ist . Bilder zeigen Blattquerschnitte von Reis, Weizen und Mais. MC, Mesophyll-Zelle; Ph, Bast; St, Stomata; BC, bu<html> lliform Zelle. Die Pfeile zeigen das Abreißen von Gewebeschnitt. Pfeilspitzen zeigen Kieselkörper. Die blaue gestrichelte Kreise zeigen Kranz Anatomie in C4-Mais. Maßstabsbalken 20 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" /> Abbildung 6:. Hybrid-Cut Behält Ährchen Gewebeintegrität in mehreren Getreidesaaten Vergleich der Gewebeintegrität von Ährchen Abschnitte zwischen traditionellen Paraffin und Hybrid-Cut Methoden. Die Pfeile zeigen das Abreißen von Gewebeschnitt. Pfeilspitzen zeigen Kieselkörper. Maßstabsbalken 20 &amp; mgr; m (Reis), und 200 &amp; mgr; m (Weizen und Mais). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" /> Abbildung 7: In - situ - Hybridisierung von Actin und CyclinB1; 1 Expressionsmuster in den Achsel Bud von Phalaenopsis - Orchideen Gewebeschnitten des 2. Achselknospen und 3. Achselknospe wurden die Hybrid-Cut - Verfahren hergestellt werden.. Insgesamt 40 ng Actin und CyclinB1; 1 DIG-markierten Sonde wurden für die Hybridisierung verwendet. Die Sense-Sonde wurde als negative Kontrolle verwendet. Die Pfeile zeigen die Fortpflanzungs meristem der Achselknospe. Maßstabsbalken 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Forschung

Biologie

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of tissue specific expression is limited because of problems in dissecting individual tissues. Expression data needs to be confirmed and complemented with expression patterns using e.g. in situ hybridization, a technique used to localize cell specific mRNA expression. The in situ hybridization method is laborious, time-consuming and often requires extensive optimization depending on species and tissue. In situ experiments are relatively more difficult to perform in woody species such as the conifer Norway spruce (Picea abies). Here we present a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including P. abies. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, we could use the protocol to study tissue specific expression of homologous genes in male reproductive organs of one gymnosperm and two angiosperm species; P. abies, Arabidopsis thaliana and Brassica napus. The protocol worked equally well for the species and genes studied. AtAP3 and BnAP3 were observed in second and third whorl floral organs in A. thaliana and B. napus and DAL13 in microsporophylls of male cones from P. abies. For P. abies the proteinase K concentration, used to permeablize the tissues, had to be increased to 3 g/ml instead of 1 g/ml, possibly due to more compact tissues and higher levels of phenolics and polysaccharides. For all species the RNase treatment was removed due to reduced signal strength without a corresponding increase in specificity. By comparing tissue specific expression patterns of homologous genes from both flowering plants and a coniferous tree we demonstrate that the DIG in situ protocol presented here, with only minute adjustments, can be applied to a wide range of plant species. Hence, the protocol avoids both extensive species specific optimization and the laborious use of radioactively labeled probes in favor of DIG labeled probes. We have chosen to illustrate the technically demanding steps of the protocol in our film.
Anna Karlgren and Jenny Carlsson contributed equally to this study.
Corresponding authors: Anna Karlgren at Anna.Karlgren@ebc.uu.se and Jens F. Sundstr&#246;m at Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

We describe a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including Norway spruce. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, the protocol may be used in studies of different tissues and species.

Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Entwicklungsbiologie

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Neurowissenschaften

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

Das Schneiden und schwimmende Methode für Paraffin-eingebetteten Gewebe für Schneiden

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Medizin

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

Eine einfache Trockenschnittmethode zum Erhalt von Vollkornharzund und ihren Anwendungen

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...