This work was supported by Biotech Risk Assessment Grant Program competitive grand no. 2006-39454-17438 to A. Snow, K. Mercer, and H. Alexander from the United States Department of Agriculture, National Institute of Food and Agriculture. Experiments using this method were conducted at and supported by the University of Kansas Field Station, a research unit of the Kansas Biological Survey and the University of Kansas. The authors would like to thank P. Jourdan and E. Regnier for helpful reviews on earlier versions of this manuscript. Additionally, this work was aided by the contributions of the staff at the University of Kansas Field Station, Waterman Farm at the Ohio State University (OSU), the USDA Ornamental Plant Germplasm Center at OSU, and the Seed Biology Lab in the Department of Horticulture and Crop Science at OSU, especially E. Renze, S. Stieve, A. Evans, and E. Grassbaugh, for technical support.

1. Sammeln Samen aus mehreren Arten oder kontrollierte Kreuze einer einzelnen Spezies Hinweis: Dieses Beispiel verwendet Samen von 15 Kreuztypen innerhalb der Spezies Helianthus annuus (Sonnenblume) mit wilden, Hybrid- und Pflanzenarten wie die mütterliche (Saatgutvermehrungs) Eltern. <ol><li> Am Ende der Vegetationsperiode sammeln reifen Samenkapseln in etikettierte Tüten. Saubere Samen von Spreu und Ort Samen in Umschläge mit elterlicher Kreuztyp im Standardformat beschriftet (dh mütterliche x väterlicherseits). </li><li> Bulk seed zusammen in großen Umschläge unter Verwendung gleicher Mengen von Saatgut aus einer gleichen Anzahl von identischen Elternquertypen. Zum Beispiel 100 Samen von 10 Cross-Typen mit den gleichen mütterlichen und väterlichen Eltern. Beschriften Sie die Umschläge mit Identifizierung (Kreuztyp). Diese großen Umschläge sind Samen Meister für die Verwendung bei der Besetzung von Grabstreifen in Abschnitt 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody&gt; <tr><td></td><td colspan="3"> Maternal Eltern </td></tr><tr><td> Väterliche Eltern </td><td> Wild: wXw </td><td> F 1: WXC </td><td> Crop: CxC </td></tr><tr><td> Wild: wXw </td><td> 0% wXw </td><td> 25% F 1 x B † </td><td> 50% CXW † </td></tr><tr><td> BC: WxF1 oder F1xW </td><td> 12,5% WxBC </td><td> 37,5% F 1 XBC </td><td> 62,5% CxBC </td></tr><tr><td> F 1: WXC </td><td> 25% WXF 1 † </td><td> 50% F 1 xF 1 </td><td> 75% CxF 1 † </td></tr><tr><td> F 2: F 1 xF 1 </td><td> 25% WXF 2 </td><td> 50% F 1 xF 2 </td><td> 75% CxF 2 </td></tr><tr><td> Crop: CxC </td><td> 50% WXC † </td><td> 75% F 1 xC † </td><td> 100% CxC </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Kinderkreuz tfür den Einsatz in der Saatgutgrab Experiment ypes von Hand hergestellt Bestäubung. Sunflower Ernte-Wild Hybrid - Kreuz - Typen wurden mit Handbestäubung hergestellt. Für alle Quertypen aufgelistet die mütterliche Eltern erste und die väterliche Eltern zweiten aufgeführt. Kreuztypen markiert mit † sind Teil der gegenseitigen Kreuztyp-Paare mit den gleichen% Crop-Allele, aber unterschiedliche mütterliche Eltern. Tabelle wurde zuvor veröffentlicht in: Pace, BA et al. (2015) 15. 2. Erstellen von benutzerdefinierten Seed Beerdigung Strips HINWEIS: Für dieses Beispiel hatten wir drei Entnahmedatum Behandlungen und 15 Wiederholungen, so benötigt man 45 Streifen insgesamt. In diesem Beispiel werden 15 Fächer pro Streifen so, wir genug feinmaschigen Polyestergewebe oder Moskitonetz zu Haus 15, 7 x 10 cm Fächer erforderlich. Siehe Abbildung 1. <ol><li> Beginnen Sie mit einer 20 x 105 cm Stoffstreifen für jeden Samen Streifen schneiden. </li><li> Messen und markieren Fächer, dann falten Sie den Stoff in zwei Hälften. Mit einem high Temperaturklebepistole, Siegel einen kurzen (10 cm) Ende. Sobald der Kleber leicht abkühlt, aber nicht vollständig, drücken Sie die Stoffseiten zusammen, um eine Dichtung zu schaffen. VORSICHT: Hochtemperatur-Kleber und Klebepistole Tipps können Verbrennungen verursachen, wenn Berührung mit der Haut verlängert. </li><li> Klebelinien aus dem gefalteten Rand zum offenen kurzen Ende in jedem Fach-Marke. Drücken Sie die beiden Stoffseiten zusammen entlang der Leimfugen, um sicherzustellen, Dichtungen ohne Löcher zwischen den Kammern. Samen der Migration zwischen den Kammern tragen zur experimentellen Fehler. HINWEIS: Nun, da die Fächer geschaffen wurden, sollte die ungefalteten Kante offen und bereit bleiben Samen und deren identifizierende Informationen (Cross-Name) zu empfangen. </li><li> Randomly Samen Quertypen Fächern für jeden Streifen zuordnen. <ol><li> Füllen seed Kompartimenten mit einer einheitlichen Anzahl von Samen (20 für jedes Fach werden in diesem Beispiel verwendet wird). Für Etiketten, verwenden industrielle Filzstiften auf cut-to-fit Kunststoff-Garten Darts, so dass sie in der Lage sindstandhalten Bestattung. HINWEIS: Alternative Markierungsverfahren verwendet werden. </li><li> Nach jedem Fach mit Saatgut und dessen Etikett gefüllt ist, verschließen Sie das Fach sofort mit der Klebepistole Hochtemperatur. Gehen Sie, bis das gesamte Saatgut Streifen vollständig abgedichtet ist. Beschriften Gesamtband in der ersten Kammer mit replizieren, Block und / oder Behandlungsinformationen. HINWEIS: Für unsere Studie, da wir zeitlich Umzüge hatten, Blöcke und replizieren Streifen innerhalb der Blöcke, enthalten wir alle diese Informationen. </li><li> Prüfen Sie, ob Lücken zwischen den Kammern und Spot Kleber nach Bedarf, bevor zum nächsten Streifen übergeht. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54663/54663fig1.jpg" /> Abbildung 1. Burial schematische Samenstreifen. Beispiel Grabstreifen , die Quertyperkennung für einzelne Fächer. Maternal Eltern zuerst genannt mit dem väterlichen Eltern zweiten aufgeführt. Farben zeigen verschiedene mütterliche Abstammung,mit gelb für wild, blau für F 1 Hybrid und Rot für Ernte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54663/54663fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54663/54663fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. von Bury Seed-Streifen auf dem Gebiet <ol><li> Dig Plots auf die angegebene Tiefe zu Haus Streifen. Ordnen Sie Streifen zu einzelnen Blöcken, in denen Streifen zufällig angeordnet sind, zum Entfernen Datum zu ermöglichen, wie der Haupthandlung und Fach Identität (in diesem Beispiel Cross-Typ) als subplot in der Analyse verwendet werden soll. </li><li> Abdeckleisten mit Erde. Cut Metallgewebe Metallgewebe 10 cm größer als Plots und Ort über begraben Streifen zu sein. Verwenden Sie U-Pins zu sichern Kanten und Abdeckung Tuch Kanten mit Erde. HINWEIS: Diese Abdeckung ist für den Ausschluss Wühlen Samenprädatoren. Als weitere Option Mercer et al. 13 aufgebaut und Kisten mit Hardware-Tuch vergraben, die die Samenstreifen aufgrund des intensiven Gopher Druck in ihrem Bereich loca umgebention.) </li><li> Legen Sie farbige Vermessungs Flaggen Streifen Lage und Entfernung zu unterscheiden Daten klare schriftliche Aufzeichnungen zu ergänzen. </li></ol> 4. Excavate Strips und Seed Bewerten <ol><li> Dig Samenstreifen zugeordnet zu einer bestimmten Entfernung Datum. Pflegen Sie die Streifen in einem kühlen feuchten Umgebung, bis sie das Labor, in dem Samen Auswertung stattfinden wird erreichen. Dies kann durch Wickeln der Streifen in nassen Zeitung erreicht werden und sie in einem Kühler für den Transport oder Versand über Nacht platziert. </li><li> Spülen Sie Schlamm und Boden aus dem Streifen in Wasser, bis Streifen wird nicht dunkel Samen sauber genug, dass äußere Ablagerungen sind. </li><li> Mit einer Schere öffnen ein Fach zu einer Zeit, zu schneiden. Graf gekeimten Samen und entfernen. Graf klar toten Samen (zB Fäulnis oder verfaulten Samen). Legen Sie nicht gekeimten Samen auf markierten, nasse Petri-Größe Löschpapier weiter ungekeimter, ruhend, und toten Samen unterscheiden. <ol><li> Legen Sie Petrischalen mit gekeimtenSamen in einer Wachstumskammer für Normalkeimbedingungen: 25 ° C / 10 ° C 12 Stunden Tag / Nacht. Lassen Samen einer Woche keimen. Alle, die zu tun, diese als tragfähige zählen, aber nicht gekeimten, da sie nicht keimen unter Feldbedingungen. </li></ol></li><li> Nach der Wachstumskammer Behandlung verbleibenden Test nicht gekeimten Samen für die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Tetrazolium Chlorid (TZ) 13. Um dies zu erreichen, eine prozentuale Lösung von TZ geeignet für die Studie Spezies mit dem AOSA Tetrazolium Testing Handbuch 14 bilden. Für dieses Beispiel wird eine 1% ige Lösung verwendet. <ol><li> Schneiden Sie die gekeimten Samen in der Mitte und legen Sie eine Hälfte waren der Embryo und Endosperm sichtbar sind in einer Petrischale mit genug TZ Lösung, um die Samen zu decken (Samen können schwimmen, das ist in Ordnung). </li><li> Legen Sie TZ Petrischalen in einem Inkubator bei 30 ° C eingestellt und 3 Stunden warten. Hinweis: Höhere Temperaturen in einer schnelleren Reaktion führt, wenn gewünscht, aber overstaining ist ein Risiko. </li></ol></li> &lt;li&gt; Entfernen Petrischalen aus dem Inkubator und zu bewerten. Samen, die in ihre Embryonen rot gefärbt haben, sind keimfähig, während ungefärbte Samen tot sind. Wenden Sie sich an AOSA Tetrazolium Testing Handbuch für weitere Einzelheiten über Scheidungsgrenzfällen und bestimmten Arten. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir Methoden für die Verwendung von Saatgut Grabstreifen Keimung der Samen, Dormanz und Sterblichkeit von verschiedenen Saatgutvorräte zu vorgewählten Zeitperioden auf dem Gebiet zu beobachten. Die Vorteile der Verwendung von Streifen eher als einzelne Pakete liegen in (1) die Geschwindigkeit des Bandes und Fach Konstruktion über die Schöpfung der einzelnen Pakete; und (2) die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Entfernens von mehreren Fächern in einer Bewegung ohne die Gefahr eines Pakets Wegl...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zuverlässig Samen Überleben im Laufe der Zeit unter Feldbedingungen zu beurteilen. Bodensamenbanken sind eine Reserve von verteilt, durchführbare noch nicht gekeimten Samen verteilt entweder auf der Bodenoberfläche, innerhalb von Oberflächen Streu oder innerhalb des Bodenprofils, das 1,2 transient oder für viele Jahre andauern kann. Bei der Saatgut Bestattung Methoden ähnlich denen hier vorgestellten einer Studie von 17 Jahren angewendet wurden mehrere Dutzend Arten verwendet wurden keimfähige Samen getestet 3 in viele der Arten gefunden. Samenruhe ist ein Block Keimung auf Saatgut , bis die entsprechende Kombination von Bedingungen für Sämling Überleben 4 entstehen. ruhend Rest können Samen lassen rauen Bedingungen, wie niedrigen Temperaturen im Winter, Nährstoffmangel, oder saisonale Trockenheit überleben, bis ein externer Trigger für Dormanz-Release für die Keimung ermöglicht. Auslöser für Dormanz-Freisetzung kann variieren von der Exposition gegenüber verlängert Kälte, Verbindungen, die durch f linksire oder physischen Angriff auf die Samenschale durch Abrieb oder Kontakt mit tierischen Magensäure 5. Als Keimung Cues können aus der Vergangenheit natürliche Selektion Gattungen oder Arten spezifisch und oft führen sein, maladaptive Keimung der Samen ist das, was zu einem ungünstigen Zeitpunkt erfolgt, und in Samen oder Sämling Sterblichkeit oder schlechte Sämlingwachstum führen kann. Während dormancy hat sich zu einer Reihe von Arten auf die Mechanismen der Dormanz Freisetzung (zB körperliche dormancy, physiologische Dormanz), 6 Samenruhe bleibt eine der am wenigsten verstandenen Themen in der Pflanzenbiologie basiert klassifiziert. So Feldstudien, die zur Beurteilung des Status der einzelnen Samen oder Gruppen von Saatgut unter relevanten ökologischen Bedingungen haben eine höhere Aussagekraft als die erlauben, die einfach auf Standard-Keimtests im Labor verlassen. Ausnutzung von Saatguteigenschaften können Einblick in die Mechanismen der Ruhe bieten. Kontrolle der Keimruhe ist Complex, einschließlich der genetischen Kontrolle der physiologischen und morphologischen Faktoren. Während ein volles Verständnis der Breite der Dormanz Mechanismen noch aufgeklärt werden, hat ein allgemeines Modell entstanden, eine Rückkopplungsbeziehung zwischen den beiden Pflanzenhormone Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) 7 beteiligt sind . In diesem verallgemeinerten Modell für Saatgut mit einer physiologischen Komponente zu ihrem Schlummer, dient GA als Signal für dormancy Release, während ABA in den Ruhezustand zu halten dient. Maternal genetische Effekte sowie die mütterliche Wachstumsumgebung kann durch mütterlich erzeugte Gewebe und Entwicklungssignale 8 dormancy und andere Samen Merkmale wie Größe beeinflussen. Maternal erzeugt äußeren Strukturen (oder Samen Beläge) dormancy halten kann, mit physiologischer Signale manchmal in Kombination. Da maternalen Samen Beläge von der Mutterpflanze die Gene gesteuert werden, können sie spiegeln nicht die tatsächliche Kern genetische Make-up Samen. Wir haben unsed die Helianthus annuus achenes aus einer Reihe von Pflanzenwild Hybrid kreuzt diese mütterlichen gegen Embryo genetische Effekte auf Saatgut Eigenschaften 9,10. So , die verschiedene Spezies, Cross - Typen oder Genotypen gehören Entwürfe Studie herauszukitzeln über die auflesen kann Ökologie und Genetik von Samenruhe, die Keimung und das Überleben. Ein wichtiges Beispiel dafür, wie die Keimung der Samen und das Überleben Phänotypen Populationsdynamik beeinflussen können im Pflanzen-Wildhybridzonen zu sehen. Auswahl während der Domestikation von Kulturpflanzen beseitigt die meisten dormancy und reduziert die Fähigkeit des Samen außerhalb der Vegetationsperiode zu überleben. Doch Genfluss oder Hybridisierung zwischen den Kultur- und Wildarten in Pflanzenwildhybridzonen können Ernte-Allele (oder genetische Varianten) in eine Wildpopulation, mit möglichen Auswirkungen auf die Samenbank Dynamik wieder einführen. Hybrids zwischen Kultur- und Wild Verwandten möglicherweise in Pflanzenwildhybridzonen gefunden besitzen kanneine Vielzahl von Zwischen Dormanz Phänotypen, mit nur wenigen Phänotypen erwarteten Bedingungen außerhalb der Kultivierung (zB Wintermonate) 11 , um zu überleben. Das Ziel dieses Manuskript ist zu zeigen, wie die Samen Grabstreifenmethode verwenden, können wir die Keimung, Dormanz, und das Überleben einer Reihe von Samenarten zu unterschiedlichen Zeitperioden zu bewerten, um ihre natürliche Variation unter Feldbedingungen zu untersuchen. In unserem Beispiel verwendeten wir Sonnenblumenkerne aus 15 Pflanzenwildtypen Hybrid-Kreuzung, da wir daran interessiert, von Mutter und Embryo genetische Effekte auf die Samenmerkmale sind.

<table><tbody><tr><td>Small coin envelopes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large coin envelopes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fine meshed polyester mosquito netting</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>high-temperature glue gun</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>high-temperature glue stick refills</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Industrial permenant markers</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic garden labels</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shovel</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal mesh hardward cloth</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surveyor&#039;s flags, multiple colors</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wet newspaper</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cooler</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>blotter paper</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temp. controlled growth chamber</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>razor blades</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrazolium chloride</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>water</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>heat incubator</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reliable method for assessing seed germination, dormancy, and mortality under field conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Kreuz - Typen mit unterschiedlichen mütterlichen Abstammungs und Ernte - Allels Prozentsatz (Tabelle 1) unterschied sich über die Entfernung Daten in Prozent gekeimt, gekeimten und toten Samen (Abb. 2 und 3). Mit TZ Prüfung von gekeimten Samen, fanden wir einige wirklich ruhenden Samen in der zweiten Entfernung (Frühjahr) (Tabelle 2), während alle durch die dritte Entfernung nicht gekeimten Samen (Feder) gefunden wu...

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Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Beurteilung der Samen überleben, Keimung und Dormanz unter Feldbedingungen mit begraben, markierten Samen Streifen und Tetrazoliumchlorid (TZ) Vitalitätstests.

Zuverlässige Methode zur Beurteilung der Samenkeimung Dormanz und Mortalität unter Feldbedingungen

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

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Serie: Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Semi-High Throughput Screening für potentielle Dürre-Toleranz in Kopfsalat (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) Keimplasmasammlungen

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Forschung

Umwelt

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protokolle für Robust Herbizidresistenz Testing in verschiedene Unkrautarten

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Immunologie und Infektion

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Biologie

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

Analyse des Einflusses von zusammengesetztem Salzstress auf die Samenkeimung und Salztoleranzanalyse von Pfeffer (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

Preparation of Intact Tissue for Microscopic Analysis of the Endosperm Cell Layer in Developing and Mature Arabidopsis Seeds

In Arabidopsis seeds, the endosperm, a single layer of living cells located between the embryo and the testa, plays a critical role in regulating seed maturation, dormancy, and germination. Microscopic analysis of intact endosperm cells is essential for understanding the physiological functions of the endosperm at cellular and molecular levels. However, sample preparation has been challenging due to the small size of Arabidopsis seeds and the location of the endosperm cell layer beneath the testa. This article details the preparation of intact endosperm cell layer samples suitable for microscopic observation and analysis in both developing and mature seeds. This method enables the observation of large areas and numerous intact endosperm cells without requiring fixation or sectioning. Additionally, the protocol utilizes only standard laboratory equipment, such as injection needles, precision forceps, and stereo microscopes. This approach successfully enables high-resolution live-cell imaging of fluorescent signals, such as green fluorescent protein (GFP), in intact endosperm cells. This method allows for the observation of intracellular localization and movement of various proteins, as well as the morphology of organelles, in the endosperm cells of different Arabidopsis mutants. This protocol contributes to the elucidation of novel endosperm functions and expands the potential for cellular and molecular studies of this essential tissue.

This protocol describes the preparation of intact samples of the endosperm cell layer in Arabidopsis thaliana seeds. The method requires only common laboratory equipment, such as an injection needle and precision forceps, and enables high-resolution fluorescent live-cell imaging of endosperm cells in both developing and mature seeds.

Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

In Arabidopsis seeds, the endosperm, a single layer of living cells located between the embryo and the testa, plays a critical role in regulating seed ...

Zuverlässige Methode zur Beurteilung der Samenkeimung Dormanz und Mortalität unter Feldbedingungen

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Semi-High Throughput Screening für potentielle Dürre-Toleranz in Kopfsalat (