Name: one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Menschliches Blut wurde von gesunden Freiwilligen mit vorheriger schriftlicher Einwilligung nach Aufklärung und Zustimmung von der Institutional Review Board der National Tsing Hua University in Hsinchu, Taiwan gesammelt. 1. Expression von rekombinantem HP-NAP in E. coli <ol><li> Bereiten Sie das Plasmid pET42a-NAP die DNA - Sequenz von HP-NAP von H. enthält , pylori 26695 Stamm wie zuvor beschrieben 16. Herstellung der Plasmide, die die DNA-Sequenz von HP-NAP mit den gewünschten Punktmutationen enthalten, wie beschrieben (siehe Protokoll, Schritt 8). </li><li> Transformation 10 ng der oben genannten DNA - Plasmide in E. coli BL21 (DE3) kompetente Zellen durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C, streak die Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , enthaltend 50 &amp; mgr; g / ml Kanamycin, und Inkubation der Platten bei 37 ° C für 16 Stunden. </li><li> Beimpfen einzelne Kolonien in einzelne Röhrchen mit 5 ml LB-Brühe mit 50 ug / ml Kanamycin und wachsen sie als Vorkulturen bei 37 ° C für 16 Stunden mit bei 170 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Beimpfen von 2 ml der oben Vorkultur Zellen in 200 ml LB-Brühe, die 50 ug / ml Kanamycin in einem 1-l-Kolben. Inkubieren des beimpften Kulturkolben bei 37 ° C für 2 h mit bis die Absorption bei 600 bei 170 rpm Schütteln nm etwa 0,4-0,5 durch einen UV / VIS-Spektrophotometer detektiert erreicht. </li><li> Hinzufügen 80 ul 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in der obigen Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM, die Expression von HP-NAP zu induzieren. Inkubieren der Kultur für 3 h, bis die Absorption bei 600 nm etwa 1,6-1,7 erreicht hat. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 6.000 × g bei 4 ° C für 15 min den Überstand zu entfernen. Lagern Sie das Zellpellet bei -70 ° C bis zur Reinigung. </li></ol> 2. Herstellung der löslichen Proteinfraktion, die HP-NAP Anmerkung: Alle der folgenden Schritte durchgeführt werden bei 4 ° C. <ol><li> Resuspendieren 50 ml der Zell pEllet in Protocol Schritt 1.6 hergestellt, in 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl, enthaltend 0,13 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0.03 mM N-alpha-Tosyl-L-Lysinyl-Chlormethylketon (TLCK) und 0,03 mM N-Tosyl-L-phenylalaninyl-Chlormethylketon (TPCK) bei 4 ° C , wie zuvor beschrieben 16. </li><li> Stören die Bakterienzellen durch die Bakteriensuspension durch einen Hochdruckhomogenisator bei einem Bereich von 15.000 bis 20.000 psi für 7-mal bei 4 ° C betrieben verläuft. </li><li> Zentrifuge das Zelllysat bei 30000 × g bei 4 ° C für 1 Stunde die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen zu trennen, indem eine Ultrazentrifuge. Den Überstand als lösliche Proteinfraktion in ein Becherglas. </li><li> Messung der Proteinkonzentration der löslichen Proteinfraktion von der Bradford-Methode eines kommerziellen Kits mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard verwendet, gemäß der Anweisungen des Herstellers. </li><li> In 177,6 ul 1 N HCl in 20 ml the lösliche Proteinfraktion aus Protocol Schritt 2.3 erhaltenen 8,0 pH im Bereich von pH 9,0 bis sein pH-Wert einzustellen. </li><li> Hinzufügen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl zu der obigen Proteinlösung auf die endgültige Proteinkonzentration machen 0,5 mg / ml sein. </li></ol> 3. Reinigung von rekombinantem HP-NAP Von E. coli durch Negativ - Modus Batch - Chromatographie mit DEAE Ionenaustauscherharze <ol><li> Vorbereitung 15 ml DEAE-Harze. <ol><li> Abwiegen 0,6 g trockenes Pulver aus DEAE-Harze und suspendieren sie in 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl bei Raumtemperatur für mindestens 1 Tag. </li><li> Zentrifugieren des Harzes bei 10.000 x g bei 4 ° C für 1 min. </li><li> Entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl. </li><li> Wiederholen Protokoll 3.1.2 bis 3.1.4 vier weitere Male Schritte. </li><li> Lagern Sie die 15 ml siedelten Harz (50% ige Aufschlämmung in 30 ml Tris-Puffer) bei 4 ° C für die spätere Verwendung. Hinweis: Alle folgenden Schritts werden bei 4 ° C durchgeführt. </li></ol></li><li> Hinzufügen 45 ml der löslichen Proteine ​​in Protokolls hergestellt Schritt 2,6-15 ml des Harzes und rühre das Protein / Harzaufschlämmung mit einem Magnetrührer bei 4ºC für 1 Stunde. </li><li> Gießen das Protein / Harz-Aufschlämmung in eine Plastik- oder Glassäule mit einem Absperrhahn versehen. Lassen Sie das Harz unter Schwerkraft absetzen. </li><li> Öffnen des Absperrhahns die Proteinlösung zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als der ungebundenen Fraktion, die das gereinigte HP-NAP enthält. </li><li> 15 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl in die Säule. </li><li> Öffnen des Absperrhahns der Waschpuffer zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als Waschfraktion. </li><li> Wiederholen Protokoll 3,5-3,6 vier weitere Male die Schritte, die zusätzlichen Waschfraktionen zu sammeln. </li><li> 15 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in eine Säule. </li><li> Öffnen des Absperrhahns der Elutionspuffer zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als Elutionsfraktion. </li><li> Wiederholen Protokoll 3,8-3,9 vier weitere Male die Schritte, die zusätzlichen Elutionsfraktionen zu sammeln. </li></ol> 4. Puffer Exchange und Endotoxin Entfernung von HP-NAP Gereinigt durch Negativ-Modus Batch-Chromatographie mit DEAE Resins Hinweis: Das gereinigte HP-NAP in E. ausgedrückt coli muss ausgesetzt werden , den Austausch und Endotoxin Entfernung zum Puffern vor Neutrophilen zu stimulieren. <ol><li> Führen Dialyse Puffer des gereinigten HP-NAP nach Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) zu ändern, pH 7,2, bei 4 ° C durch einen Dialyseschlauch mit Molekulargewichtsgrenze von 14 kDa verwendet , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> Filtern Sie die dialysiert HP-NAP durch eine syringe Filter mit einem positiv geladenen, hydrophilen Membran angebracht auf eine 20 ml Einwegspritze mit Raten von 2,5 bis 4 ml / min bei 4 ° C im Bereich Strömungs Endotoxin zu entfernen. </li></ol> 5. Charakterisierung der molekularen Eigenschaften von gereinigtem rekombinantem HP-NAP durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blotting, Native-PAGE, Gelfiltrationschromatographie und Circulardichroismus-Spektroskopie <ol><li> Analyse des gereinigten rekombinanten HP-NAP durch SDS-PAGE und Western Blotting mit Hybridomkulturüberständen enthält monoklonaler Maus - Antikörper MAb 16F4 25 , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> Analysieren Sie den gereinigten HP-NAP durch native-PAGE und Gelfiltrationschromatographie seinen oligomeren Status zu prüfen , wie zuvor 26 beschrieben. </li><li> Analysieren Sie den gereinigten rekombinanten HP-NAP durch Circulardichroismus - Spektroskopie seine Sekundärstruktur zu untersuchen , wie zuvor 26 beschrieben. </li></ol> 6. Bewertung der Reinheit des HP-NAP durch Silberfärbung eines SDS-PAGE-Gel <ol><li> Bereiten Sie die Befestigungslösung, Sensibilisierungslösung, Silberlösung, Entwicklungslösung, Stopplösung und Waschlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers einer Silberfärbung Kit. </li><li> Führen Silberfärbung eines SDS-PAGE-Gel nach den Anweisungen des Herstellers einer Silberfärbung Kit. </li><li> Erwerben, um das Bild des Gels mit einem Abbildungssystem. </li></ol> 7. Messung der ROS-Produktion aus Neutrophilen induziert durch HP-NAP <ol><li> Isolieren menschlicher Neutrophile aus humanem heparinisiertem Blut durch Dextran - Sedimentation durch Dichtegradientenzentrifugation gefolgt , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> Die Messung der ROS-Produktion von neutrophilen Granulozyten stimuliert mit HP-NAP durch eine Luminol-abhängige Chemilumineszenz Assay. <ol><li> Schalten Sie auf einem Plattenlesegerät und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Legen Sie einleer flachen Boden 96-Well-Platte, weiß im Inneren der Plattenleser Kammer, so dass sie auf 37 ° C zu erwärmen. </li><li> Bereiten Sie die Stimulus Mischungen in D-PBS, pH 7,2, enthaltend 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2 und 13,3 &amp; mgr; M 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol) mit der Anwesenheit und Abwesenheit von 0,67 uM Endotoxin entfernt HP-NAP, hergestellt aus Protokoll Schritt 4.2. </li><li> Stellen Sie die Konzentration von humanem Neutrophilen hergestellt aus Protocol Schritt 7,1-2 x 10 6 Zellen / ml in D-PBS, pH 7,2, enthaltend 5 mM Glukose. </li><li> In 50 ul Neutrophilen-Suspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, während. </li><li> Zugabe von 150 &amp; mgr; l der Stimulus Mischungen aus Protokolls hergestellt Schritt 7.2.2 in die Vertiefung mit Neutrophilen in einem Zeitintervall von 5 Sekunden pro Vertiefung. </li><li> Messen der Emission von Chemilumineszenz für 5 sec pro Vertiefung über einen Zeitraum von 3 Stunden durch einen Plattenleser. </li></ol></li></ol> 8.Aufbau von DNA-Plasmiden HP-NAP Mutants durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -basierte Standort direkte Mutagenese Hinweis: PCR-basierte Website-direkte Mutagenese wurde im Grunde erzeugt , wie zuvor 27 beschrieben mit der Ausnahme , dass die &quot;stille&quot; Restriktionsstellen an die Mutagenese - Primer eingeführt wurden durch ortsgerichtete Mutagenese (SDM) -Assist Software 28. <ol><li> Führen PCR-Reaktion. <ol><li> Werden 10 ng von Plasmid pET42a-NAP, 1 uM Mutagenese - Primer - Paare , die in Tabelle 1, 200 uM Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) und 3 Einheiten von High-Fidelity PCR Enzymmischung in ein PCR - Röhrchen entionisiertes Wasser enthielt, was eine endgültige Volumen von 25 &amp; mgr; l. </li><li> Initiieren Sie die PCR-Zyklen bei 95 ° C für 10 min , um die Matrizen - DNA zu denaturieren , und 12 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 1 Minute folgt, m T kein -5 ° C für 1 Minute und 72 o C für 6 min. </li><li> Beenden Sie die PCR-Zyklen mitein Temperschritt bei T m pp -5 o C für 1 Minute und ein Verlängerungsschritt bei 72 ° C für 30 min. </li></ol></li><li> Behandlung von 15 &amp; mgr; l des PCR-Produktes mit 0,4 &amp; mgr; l DpnI-Restriktionsenzym bei 37 ° C für 2 Stunden und dann analysieren 2 ul der Dpn I-behandelten PCR-Produkt durch Agarose-Gelelektrophorese. </li><li> Screen-Mutanten. <ol><li> Transformieren 2 &amp; mgr; l des PCR - Produkts in E. coli DH5 kompetenter Zellen durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C. </li><li> Verbreiten Sie die transformierten Zellen auf einer LB-Platte, die 50 ug / ml Kanamycin und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden. </li><li> Isolieren der Plasmid-DNA aus den Bakterienkolonien einen handelsüblichen alkalischen Lyse-Kit nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Behandeln die Plasmid-DNA isoliert in Protocol Schritt 8.3.3 mit XhoI-Restriktionsenzym, das Vorhandensein der gewünschten stille Mutationen zu verifizieren dem Protokoll des Herstellers entsprechend. </li><li> Ablauf derPlasmid-DNA durch das Protokoll Schritt 8.3.4 mit T7-Promotor-Primer bestätigte die Korrektur der kodierenden Sequenzen von HP-NAP-Mutanten dem Protokoll des Herstellers entsprechend bestätigen. </li></ol></li></ol>

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HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

Die negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE Anionenaustauscherharze präsentierten zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in E coli geeignet. Die pH - Werte der Puffer in den Schritten der Zell - Lyse und Reinigung verwendet werden , sind sehr kritisch , um die Löslichkeit von HP-NAP in E. , um sicherzustellen , coli - Lysaten und effiziente Trennung von rekombinantem HP-NAP von Wirtszellverunreinigungen, respectively. Bakterielle Zellen sollten bei einem pH von 9,0, ...

Helicobacter pylori (H. pylori) ist eine Hauptursache von Gastritis und Magengeschwüren. Dieses Bakterium ist auch als Karzinogen beim Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung, Teil der Weltgesundheitsorganisation im Jahr 1994 eingestuft Es wurde geschätzt , dass die Prävalenz von H. pylori - Infektion ist 70% in den Entwicklungsländern und 30-40% in den Industrieländern 1. Auch wenn die Infektionsrate von H. pylori wird in den Industrieländern abnimmt, die Infektionsrate von H. pylori in den Entwicklungsländern ist 2 immer noch hoch. Die Standardbehandlung H. auszurotten pylori - Infektion besteht aus der Verabreichung eines Protonenpumpenhemmers, PPI, und zwei Antibiotika, Clarithromycin und Amoxicillin oder Metronidazol 3. Allerdings ist der Anstieg der Antibiotikaresistenz in der H. pylori verwandtes Geschwür Therapie die Entwicklung neuer Strategien drängt o zu verhindernr die Infektion zu heilen. Entwicklung von präventiven und / oder therapeutischen Impfung gegen H. pylori könnte einen alternativen Ansatz bieten H. zu steuern pylori - Infektion. Neutrophilen-aktivierende Protein Helicobacter pylori (HP-NAP), ein wichtiger Virulenzfaktor von H pylori, wurde zuerst in Wasserextrakten von H. identifiziert pylori mit der Fähigkeit , Neutrophile zu aktivieren , um an endotheliale Zellen anheften und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 4 herzustellen. Neutrophile Infiltration der Magenschleimhaut in H. gefunden pylori - infizierten Patienten mit aktiver Gastritis kann bei der Entzündung und Gewebeschädigung des Magens führen. So Neutrophilen eine pathologische Rolle spielen , indem sie die Aktivierung HP-NAP kann eine Magenentzündung zu induzieren, die weiter Geschwür oder H. verursacht pylori -assoziierten Magenerkrankungen. Dennoch ist HP-NAP ein potentieller Kandidat für die klinische Anwendung 5,6. Aufgrund der immunogene und immunmodulatorische Proschaften von HP-NAP könnte dieses Protein verwendet werden, um Impfstoffe, therapeutische Mittel und Diagnose-Tools zu entwickeln. Eine klinische Studie wurde unter Verwendung von rekombinantem HP-NAP als eine der Komponenten eines Proteins Impfstoff gegen H. durchgeführt pylori. Dieser Impfstoff besteht aus rekombinanten HP-NAP, Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) und vacuolating cytotoxin A (VacA) Proteine ​​mit Aluminiumhydroxid formuliert und hat sich weiter beim Menschen sicher und immunogen zu sein 7 gezeigt. Auch wirkt HP-NAP als ein potenter Immunmodulator T - Helfer Typ 1 (Th1) -polarisierte Immunantworten für die Krebstherapie 8 und nach unten zu regulieren Th2-vermittelte Immunreaktionen durch allergische Reaktionen und parasitäre Infektionen 9,10 ausgelöst auszulösen. Wie für die Diagnostik, wurde Serum - Antikörper gegen HP-NAP in H. zu erkennen rekombinanten HP-NAP-basierten ELISA angewendet pylori - infizierten Patienten 11. Eine Studie zeigte , dass der Pegel des HP-NAP-spezifische Antikörper in Seren von H. pylori -infizierten Patienten mit Magenkrebs als die 12 von Patienten mit chronischer Gastritis signifikant höher war. Eine andere Studie zeigte auch , dass Serumantikörper gegen HP-NAP mit der Anwesenheit von nicht-Cardia Adenokarzinom des Magens 13 verbunden sind. So können rekombinante HP-NAP-basierten ELISA Serum - Antikörper gegen HP-NAP für die Prognose von Magenkrebs in H. zu erkennen , anzuwenden pylori - infizierten Patienten. Zusammengenommen können das gereinigte HP-NAP weiter für die Prävention, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie. Unter den verschiedenen zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP Methoden exprimiert in Escherichia coli (E. coli) in seiner nativen Form berichtet so weit, einem zweiten Reinigungsschritt beteiligt Gelfiltrationschromatographie hochreines HP-NAP zu erhalten , ist erforderlich 14-16 . Hier wird ein Verfahren unter Verwendung von negativen Modus batch-Chromatographie mitDiethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen wird zur Reinigung von HP-NAP beschrieben überexprimiert in E. coli mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit. Dieses Reinigungsverfahren wurde auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0, fast keine andere Proteine ​​außer HP-NAP werden aus der ungebundenen Fraktion gewonnen. Diese Reinigung Ansatz unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in negativen Modus ist einfach und zeitsparend durch Reinigung von rekombinantem HP-NAP über Einstufen-Chromatographie durch die Erhebung von der ungebundenen Fraktion ermöglicht. Neben HP-NAP mehrere andere Biomoleküle, wie beispielsweise 17 Viren, Immunoglobulin G (IgG) 18, Hämoglobin 19, Proteinphosphatase 20 und Virulenzfaktor Flagellin - 21, wurden auch durch Ionenaustauschchromatographie zu reinig in negativer berichtet Modus. Der negative Modus wird für die Ionenaustauschchromatographie bevorzugt, wenn die Verunreinigungen gering sindvorhandenen Komponenten in der Probe unterzogen , bis 22 gereinigt werden. Die Anwendung der negativen Chromatographie bei der Reinigung von natürlichen oder rekombinanten Biomoleküle wurde 23 vor kurzem überprüft. Der vorliegende Bericht liefert eine Schritt für Schritt - Protokoll für die Expression von rekombinanten HP-NAP in E. coli, Lyse der Zellen und die Reinigung von HP-NAP unter Verwendung von negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE - Ionenaustauschharze. Wenn ein Protein für die Reinigung erwünscht für Ionenaustauschchromatographie in Negativmodus geeignet ist, könnte das beschriebene Protokoll auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&amp;amp;supplier=search&amp;amp;name&lt;br/&gt;=IPTG%20</td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Protein standard (bovine serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&amp;nbsp;</td><td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&amp;ndash;Sephadex &amp;nbsp;A-25 chloride form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por dialysis tubing</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>with molecular weight cutoff of 14 kDa&lt;br/&gt; http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Acrodisc&amp;reg; units with Mustang&amp;reg; E membrane</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min&lt;br/&gt; http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&amp;nbsp; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>for gel filtration chromatography&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne silver staining kit, protein</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure&lt;br/&gt;_16963/17144002</td></tr><tr><td>Flat bottom 96-well white plate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protected from light&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Expand &amp;nbsp;long template PCR system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>source of High Fidelity PCR enzyme mix&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Product Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td><td>Hitachi&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>out of market and upgraded to a new model&lt;br/&gt; http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; lysates&lt;br/&gt; http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>for gel filtration chromatography&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>LAS-3000 imaging system</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>discontinued and replaced&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>for chemiluminescence detection&lt;br/&gt; http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

Helicobacter pylori Neutrophilen-aktivierendes Protein (HP-NAP) ist ein wichtiger Virulenzfaktor von Helicobacter pylori (H. pylori). Es spielt eine entscheidende Rolle in H. pylori induzierte Magenentzündung durch verschiedene angeborene Leukozyten einschließlich Neutrophile, Monozyten und Mastzellen aktiviert werden . Die immunogene und immunmodulatorische Eigenschaften von HP-NAP machen es zu einem möglichen diagnostischen und Impfstoffkandidaten für H. pylori und ein neuer Medikamentenkandidaten für die Krebstherapie. Um erhebliche Mengen an gereinigtem HP-NAP für seine klinische Anwendung, ein effizientes Verfahren dieses Protein mit hoher Ausbeute und Reinheit zu erhalten, verwendet zu reinigen eingerichtet werden muss. In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur einstufigen negativen chromatographischen Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in Escherichia coli (E. coli) unter Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen beschrieben (z. B. Sephadex) in Batch-Modus. Rekombinante HP-NAP bildet fast 70% des Gesamtproteins in E. coli und wird nahezu vollständig in der löslichen Fraktion nach Zelllyse bei pH 9,0 gewonnen. Unter der optimalen Bedingung bei einem pH von 8,0, wird der Großteil der HP-NAP in der ungebundenen Fraktion gewonnen , während die endogenen Proteine ​​aus E. coli effizient durch das Harz entfernt. Dieses Reinigungsverfahren unter Verwendung von negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE - Ionenaustauschharze ergibt funktionelle HP-NAP aus E. coli in seiner nativen Form mit hoher Ausbeute und Reinheit. Das gereinigte HP-NAP könnte weiter zur Verhütung, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.

Die schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens negativer Reinigung rekombinanter HP-NAP exprimiert in E. coli durch DEAE - Ionenaustauschharze in Batch - Modus verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Reinigungsverfahren auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0 fast keine andere Proteine ​​außer HP-NAP in nativer Form aus der ungebundenen Fraktion (...

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Eine hohe Ausbeute Verfahren zur einstufigen negativen Reinigung von rekombinanten Helicobacter pylori in Escherichia coli Neutrophile aktivierendes durch Verwendung Diethylaminoethyl Harze im Batch - Modus überexprimiert Protein (HP-NAP) beschrieben ist. HP-NAP durch dieses Verfahren gereinigt ist vorteilhaft für die Entwicklung von Impfstoffen, Medikamente oder Diagnostika für H. pylori -assoziierte Krankheiten.

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K Aufrufe.  National Tsing Hua University.  Eine hohe Ausbeute Verfahren zur einstufigen negativen Reinigung von rekombinanten Helicobacter pylori in Escherichia coli Neutrophile aktivierendes durch Verwendung Diethylaminoethyl Harze im Batch - Modus überexprimiert Protein (HP-NAP) beschrieben ist. HP-NAP durch dieses Verfahren gereinigt ist vorteilhaft für die Entwicklung von Impfstoffen, Medikamente oder Diagnostika für H. pylori -assoziierte Krankheiten. 

Serie: One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Forschung

Biochemie

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is also a key component in the development of new therapeutics. The evolving era of functional proteomics is fueling the demand for high-throughput protein purification and improved techniques to facilitate this. It was hypothesized that a multi column plate adaptor (MCPA) can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. This method offers an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum, rivaling the speed of an automated system. The MCPA can be used to recover milligram yields of protein by an affordable and time efficient method for subsequent characterization and analysis. The MCPA has been used for high-throughput affinity purification of SH3 domains. Ion exchange has also been demonstrated via the MCPA to purify protein post Ni-NTA affinity chromatography, indicating how this system can be adapted to other purification types. Due to its setup with multiple columns, individual customization of parameters can be made in the same purification, unachievable by the current plate-based methods.

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biologie

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Immunologie und Infektion

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many bacteria. There are a variety of methods for quantifying polyP in biological materials, many of which are either labor-intensive or insensitive, limiting their usefulness. We present here a streamlined method for polyP quantification in bacteria, using a silica membrane column extraction optimized for rapid processing of multiple samples, digestion of polyP with the polyP-specific exopolyphosphatase ScPPX, and detection of the resulting free phosphate with a sensitive ascorbic acid-based colorimetric assay. This procedure is straightforward, inexpensive, and allows reliable polyP quantification in diverse bacterial species. We present representative polyP quantification from the Gram-negative bacterium (Escherichia coli), the Gram-positive lactic acid bacterium (Lactobacillus reuteri), and the mycobacterial species (Mycobacterium smegmatis). We also include a simple protocol for nickel affinity purification of mg quantities of ScPPX, which is not currently commercially available.

We describe a simple method for rapid quantification of inorganic polyphosphate in diverse bacteria, including Gram-negative, Gram-positive, and mycobacterial species.

Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

qPCR-basierte schnelle, nicht-invasive Diagnose von Helicobacter pylori-Infektionen und Antibiotikaresistenzen

Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-Based Rapid Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Antibiotic Resistance

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to its increasing antibiotic resistance. It is the causative agent of chronic active gastritis, peptic ulcer disease, and gastric cancer and has been classified as a Group I Carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. Therefore, the rapid and accurate diagnosis of H. pylori and the determination of its antibiotic resistance are important for the efficient eradication of this bacterial pathogen. Currently, H. pylori diagnosis methods mainly include the urea breath test (UBT), the antigen test, the serum antibody test, gastroscopy, the rapid urease test (RUT), and bacterial culture. Among them, the first three detection methods are noninvasive, meaning they are easy tests to conduct. However, bacteria cannot be retrieved through these techniques; thus, drug resistance testing cannot be performed. The last three are invasive examinations, but they are costly, require high skills, and have the potential to cause damage to patients. Therefore, a noninvasive, rapid, and simultaneous method for H. pylori detection and drug resistance testing is very important for efficiently eradicating H. pylori in clinical practice. This protocol aims to present a specific procedure involving the string test in combination with quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for the rapid detection of H. pylori infection and antibiotic resistance. Unlike bacterial cultures, this method allows for easy, rapid, noninvasive diagnosis of H. pylori infection status and drug resistance. Specifically, we used qPCR to detect rea for H. pylori infection and mutations in the 23S rRNA and gyrA genes, which encode resistance against clarithromycin and levofloxacin, respectively. Compared to routinely used culturing techniques, this protocol provides a noninvasive, low-cost, and time-saving technique to detect H. pylori infection and determine its antibiotic resistance using qPCR.

Autor im Rampenlicht: Nachweis und Behandlung der Helicobacter pylori-Infektion 

The protocol presents a noninvasive method for the rapid diagnosis of Helicobacter pylori stomach infections through the string test and determines its antibiotic resistance to clarithromycin and levofloxacin using quantitative polymerase chain reaction (qPCR).

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to ...

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von

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Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz