Name: isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
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This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).

Erhalten der Galle von Patienten durch ERCP (ERCP) bedarf der Zustimmung eines menschlichen Probanden Studienprotokoll vom Institutional Review Board. Alle hier vorgestellten Arbeit wurde von der Johns Hopkins University Institutional Review Board genehmigt. 1. exosome Isolation von Bile <ol><li> Führen Sie ERCP (ERCP). Der Patient wird in Rückenlage und intubieren. <ol><li> Übergeben Sie einen Duodendoskop durch den Mund des Patienten und legen Sie sie in den zweiten Teil des Duodenum und die großen Papille identifizieren. </li><li> kanülieren Selektiv Choledochus ein dreilumiger Papillotom vorbelastet mit einem 0,035 Zoll (0,9 mm) hydrophile Führungsdraht durch das Einfügen. </li><li> Schieben Sie den Führungsdraht unter Durchleuchtungskontrolle nach links Hepatikus da gelegentlich kann es schwierig sein, den Cysticus vom rechten Hepatikus zu unterscheiden, dann voraus, um denSphinkterotom 5 cm in den Gallengang eine stabile Position zu erwerben. </li><li> Entfernen Sie den Führungsdraht, fügen Sie eine 10 ml Spritze mit dem Führungsdrahtöffnung durch den Luer-Lock und aspirieren die Galle mit 10 ml Unterdruck. </li><li> Entfernen Sie die Spritze die Galle enthält, mit der ERCP fortzufahren, indem der Führungsdraht wieder einsetzen und Kontrastmittel durch die Injektionsöffnung Injizieren des Gallenbaum zu trüben. </li><li> Übertragen Sie die gesammelten Galle in einen 15-ml-Röhrchen auf Eis und auf Eis halten, bis sie bereit mit dem Zentrifugationsschritt, um fortzufahren. Vorsicht: Handschuhe tragen sich selbst und die Proben zu schützen! Behandeln Sie die Galle als eine mögliche Quelle der Infektion, wie es Hepatitis-A-Virus-Partikel enthalten kann! </li><li> Halten Sie die Probe (n) auf Eis. Entweder fahren Sie mit Schritt 1.2 oder Zentrifuge bei 500 × g bei 4 ° C für 10 min und dann einfrieren bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Hinweis: Um diese Art und Weise gespeichert Proben für mehrere Jahre routinemäßig verwendet wurden mit 19 guten Ergebnissen. </li></ol&gt; </li><li> Transfer 400 ul Galle in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zu sammeln Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Probe (n) bei 16.500 × g für weitere 20 Minuten bei 4 ° C, um den Überstand von weiteren Trümmer zu löschen. Entsorgen Sie die Rohre in dem Biohazard Abfall. Alternativ drehen Sie die Proben in einer Ultrazentrifuge statt. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie sie in einem Bio-Sicherheitsschrank mit einer Spritze durch einen 0,2 um Polyethersulfon (PES) Membranfilter, die eine gute Durchflussraten und niedrige Proteinbindung alle Partikel zu entfernen, die größer als 200 nm belassen. </li><li> Pipettieren der filtrierte Überstand Röhrchen Ultracentrifuge und PBS hinzufügen, so dass die Rohre mehr als 2/3 voll sind. Wenn die Röhren weniger Flüssigkeit enthalten als das, werden die Rohre während der Zentrifugation kollabieren! Tubes kann mehrmals gewaschen, autoklaviert und wiederverwendet werden. </li><li> Pellet Exosomen die durch Ultrazentrifugation bei 120.000 xg für 70 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation Blick auf die Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen manchmal kleine gelbe Pellets sehen; dies sind die Exosomen. </li><li> Überstand verwerfen, indem sie vorsichtig dekantieren und den Abfall zu desinfizieren durch Bleichmittel auf eine Endkonzentration von 10% v / v Hinzufügen und lassen Sie es 20 Minuten lang stehen. </li><li> Für nachgeschaltete Experimenten gepuffert entweder die Pellet (s) in einem kleinen Volumen der geeigneten Lösung (dh Radioimmunpräzipitation - Assay (RIPA) Puffer für die Proteinisolierung, RNA Lysepuffer für miR isolation) oder resuspendieren es in 50-150 ul Phosphat verarbeiten Salzlösung (PBS) , die bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung (quantitative Echtzeit - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Proteinextraktion etc.) oder verwendet zur Charakterisierung der exosome Herstellung durch TEM oder Nanopartikel optische Analyse gespeichert werden kann entweder . </li></ol> 2. exosome Identifikation durchTransmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder Kryo-EM <ol><li> Resuspendieren extrazellulären Vesikeln in 100 ul PBS pipettiert. Idealerweise verwenden Exosomen, die bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert wurden nicht, vor allem wenn die Isolation zum ersten Mal durchgeführt wird. </li><li> Adsorbieren ein 20-ul-Aliquot (etwa 2 ug) bis 400 mesh Kohlenstoff beschichteten Parlodion Kupfergitter für 2 min und lassen bei RT trocknen. </li><li> Befestigen Sie den Exosomen in 1% (v / v) Glutaraldehyd (EM-grade) für 5 min bei RT durch Tropfen vorsichtig auf die getrocknete Zubereitung platzieren. </li><li> Waschen Sie die Gitter zweimal mit Wasser für 5 Minuten und dann Fleck EVs mit 1% Wolframatophosphorsäure (PTA) für 30 Sekunden gegenüber. </li><li> Erwerben Bilder mit einem Elektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV bei einer Vergrößerung von 20.000-Ausgangs und 100.000 · zu erhöhen, wenn die Größe der Partikel bestimmt wird. Hinweis: Andere preps wie Schichtung auf Formvar Kohlenstoff beschichteten 200 mesh Kupfer oder Nickel Gitter und Kontrastfärbung like 1% oder 2% Uranylacetat für 10-15 min sind möglich. </li><li> Für Kryo-EM, mischen, um ein 20-ul-Aliquot (etwa 2 ug) mit 60 &amp; mgr; l Protein G Gold 10 nm (Verhältnis 1: 3). Dies wird dazu beitragen, die exosome Durchmesser zu bestimmen. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf glow-entladen C-Flach löchrigen Kohlenstoff Gitter und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen durch Abtupfen. Frieren Sie die Gitter von ihnen sofort in flüssigem Ethan getaucht wird. </li><li> Montieren Sie die Gitter in einem cryoholder in flüssigem Stickstoff. </li><li> Erwerben Sie die Bilder bei 200 kV mit einer Vergrößerung von 20.000-und 100.000 ·. </li></ol> 3. exosome Identifizierung von Multi-Parameter-Nanopartikel-Optische-Analyse <ol><li> Resuspendieren der isolierten Exosomen in 100 ul PBS pipettiert. </li><li> Verdünnte Exosomen in 600 &amp; mgr; l PBS bei mehreren verschiedenen Verhältnissen (wie 1:50 1: 100, 1: 300, 1: 600 und 1: 1.200). </li><li> Visualisieren Sie die Exosomen durch Laserlichtstreuung mit dem entsprechenden Gerät und Software in Echtzeit nach manufacturer Protokoll 20. </li><li> Erhöhen Sie den Pegel der Kamera im Aufnahmemodus, bis alle Partikel sichtbar werden, dann stellen Sie den Fokus auf die Partikel glatt aussehen. </li><li> Während im Standard-Modus, um die Kamera auf das niedrigste Niveau zu verringern, dass die Partikel noch zu sehen ist, bei Bedarf Kamera-Auslöser und die Verstärkung einzustellen, dies zu erreichen. </li><li> Eine Sichtprüfung 20-100 Partikel sind auf dem Bildschirm sichtbar zu gewährleisten, wenn das Gerät nicht spülen und die Verdünnung in PBS einzustellen. </li><li> Dann stellen Sie die Aufnahmedauer auf einen Wert zwischen 30 bis 60 Sekunden. Nachdem das Video aufgenommen wird, stellen Sie die Verarbeitungsparameter, bis alle Partikel auf dem Bildschirm identifiziert werden und die Videodatei verarbeiten. </li></ol> 4. exosome Charakterisierung durch Western Blot <ol><li> Lyse exosome Pellets 2-5 ml Galle in 100 ul eiskaltem Radioimmunopräzipitation-Assay (RIPA) Puffer mit einem Proteaseinhibitor durch Auf- und Abpipettieren gründlich mischen Lysaten kräftig für 30 Sekundenauf einem Vortex die Proteine ​​wirksam zu solubilisieren. </li><li> Während die meiste Zeit nicht notwendig, puls Beschallung der Proben auf Eis mit 2 Impulsen für 10 sec jede volle Lyse sicherzustellen verwenden. </li><li> Pellet unlösliches Material durch Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4 ° C für 5 min und Überstand in ein sauberes Röhrchen. </li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration mit einem Verfahren der Wahl (dh Bicinchoninsäure (BCA), Coomassie modifizierte Lowry, 660 nm Protein Assay, etc.) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Das Verfahren ist nicht so wichtig, solange das gleiche Verfahren durchgängig verwendet wird, Ergebnisse zu erzielen, die über Experimente verglichen werden kann. </li><li> Last 50 ug Protein pro Probe in Laemmli-Puffer nach dem Erhitzen der Probe bei 95 ° C für 5 min in ein Bohrloch eines Polyacrylamidgels für die Elektrophorese (PAGE). </li><li> Elektrophorese der Proben auf den PAGE-Gele für 1,5 Stunden und übertragen Sie die getrennten Proteine ​​auf eine Nylonmembran. </li><li> BSperren der Membran (en) mit 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20 (TBS-T) 1 Stunde lang, dann inkubieren mit Exosom-spezifischen Antikörper wie Anti-CD63 und Anti-TSG-101 bei einer Verdünnung von 1: 500 bevorzugt O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Membranen mit TBS-T 3 x 10 min inkubieren, dann mit einem geeigneten, passenden HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper in 5% Magermilch in TBS-T für 1-2 h bei RT. </li><li> Waschen der Membran (en) 3 x 5 min mit TBS-T und detektieren die spezifischen Proteine ​​mit Chemilumineszenz-Reagenzien nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Bild die Membranen mit Folie oder einem digitalen Bildgebungssystem gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 5. MicroRNA Isolation von den isolierten Exosomen Hinweis: Isolierung von miRNA aus Gallen Exosomen ist eine modifizierte miRNA Isolation auf einem handelsüblichen Kit basierend durchgeführt, aber jede andere RNA Isolierungsverfahren können verwendet oder angepasst werden. <ol><li> In 300 &amp;# 181; l Lyse / Gebäude Puffer zum exosome Pellet (isoliert von 400 ul Galle), Wirbel, Pipette oder gehen durch eine Nadel / Spritze vollständig lysieren die Exosomen ein homogenes Lysat zu erhalten. </li><li> In 1/10 (30 &amp; mgr; l) Volumen von miRNA Homogenat Additive und gut mischen durch Vortexen oder das Rohr mehrere Zeit invertieren. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten auf Eis. </li><li> Hinzufügen ein Volumen von Säure-Phenol: Chloroform gleich dem anfänglichen Homogenat (300 ul). </li><li> In 5 ul 5 fmol / ul Cel-miR 39 und Wirbel für 30-60 Sekunden. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 10.000 × g bei RT die wässrige zu trennen (oben) und organische (untere) Phasen. </li><li> aspirieren Sie vorsichtig die obere Phase durch Pipettieren und in ein frisches Röhrchen, während das Volumen übertragen Feststellung. Entsorgen Sie die organische Phase in den entsprechenden organischen Abfallbehälter. </li><li> Zur Bereicherung für kleine RNAs 1/3 Volumen von 100% Ethanol auf den wiederhergestellten wässrigen Phase hinzugeben und mischen durch gründliches Vortexen oder Umkehren des tumehrmals sein. </li><li> Pipettieren das Lysat / Ethanol-Mischung auf der Filterpatrone, bis zu 700 &amp; mgr; l zu einer Zeit. </li><li> Zentrifugieren Sie die Patronen für 15 s bei maximal 10.000 xg oder gelten Vakuum der Mischung durch den Filter passieren. </li><li> Das Filtrat und wenn das Lysat / Ethanol-Mischung 700 &amp; mgr; l übersteigt, übertragen Sie den Durchfluss in ein frisches Röhrchen und wiederholen Sie den Vorgang zu sammeln alle Filtrate. Diese Filter enthält RNA Fraktionen frei von kleinen RNAs und kann verwendet werden, um diese größere RNAs zu erholen. </li><li> In 2/3 Volumen von RT 100% Ethanol auf das Gesamt Filtrat und gründlich mischen durch Vortexen. </li><li> Pipettieren das Filtrat / Ethanol-Gemisch auf eine zweite Filterpatrone. Nach wie vor das maximale Volumen, das auf einmal angewendet werden kann, beträgt 700 &amp; mgr; l. </li><li> Zentrifuge für 15 Sekunden bei 10.000 × g oder Vakuum wird in Schritt 5.10 beschrieben. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch, und wiederholen, bis das gesamte Filtrat / Ethanol-Mischung gefiltert wurde. </li><li> bewerben 70081; l miRNA Waschlösung 1 auf die Filterpatrone, Zentrifuge für 5-10 sec oder Vakuum anzuwenden und den Durchlauf verwerfen. </li><li> Waschen Sie den Filter mit 500 ul Waschlösung 2/3, wie in Schritt 5.16 getan. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal mit 500 ul Waschlösung 2/3, wie in Schritt 5.16, entsorgen Sie die Durchfluss und legen Sie den Filter wieder in das Sammelrohr. </li><li> Drehen die Filterpatrone für 1 min bei 10000 xg gesamte restliche Fluid aus dem Filter zu entfernen. </li><li> Übertragen, um die Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen und anzuwenden 100 &amp; mgr; l heißem (95 ° C) Nuklease-freies Wasser auf die Mitte des Filters. </li><li> Drehen Sie die Baugruppen für 20-30 sec bei maximaler Geschwindigkeit um die RNA zu erholen. </li><li> Sammeln des Eluats und sofort verwenden oder lagern bei -80 ° C. </li></ol>

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None of the authors have competing financial interests.

Um zuverlässig Exosomen isoliert von Galle nutzen, ist es wichtig, eine gleichbleibend hohe Qualität Isolierungsverfahren zu verwenden, um qualitativ hochwertige Proben im Gegenzug erhalten. Die Methodik in diesem Dokument definiert ist, eine gut etablierte Weg Exosomen und miRNA aus menschlichen Galle zu isolieren. Sie weist auf mehrere entscheidende Schritte bei der Charakterisierung der isolierten Exosomen, die bei einem Minimum sollte Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse und Western-Blots umfas...

Wie bei anderen biologischen Flüssigkeiten, also der Muttermilch, Plasma oder Urin, Galle enthält Exosomen, lipidreiche Vesikeln 1-4. Exosomen können biologische Funktionen in Empfängerzellen 5, 6, eine Form von Zell-Zell - Kommunikation induzieren oder zu verändern , die 4, Teil ihrer normalen Funktion 7-9 sein könnten. Exosomen können miRNA - Arten enthalten , die 10 eine wertvolle Quelle für Biomarker für die Diagnose zur Verfügung stellen kann. miRNAs Profile haben beträchtliche Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als diagnostisches und prognostischen Marker für eine Vielzahl von Krankheiten 11-14 gewonnen. miRNA selbst kann in biologischen Flüssigkeiten, möglicherweise veröffentlicht von toten Zellen und die Menge der Schuppen Zellen gefunden werden kann, stark von einer zugrundeliegenden Krankheit beeinflusst werden. Die miRNA Profil von Exosomen geben nicht unbedingt die miRNA Profil der Ursprungszelle 6, 10, 15-17, noch Exosomen können miRNA Unterschriften tragen, die für die elterliche ce charakteristisch sein könntell eine Tumorzelle mögen. Tumor-abgeleitete Exosomen wurden im Plasma von Patienten mit Lungenadenokarzinom, Prostatakrebs und anderen Tumoren 8, 16, 18 identifiziert. Das Ziel dieser Methode ist die zuverlässige und robuste Isolierung der Exosomen aus menschlichen Gallenproben, weitgehend unabhängig von ihrer vorherigen Handhabungsverfahren. Es wurde Galle als eine zuverlässige Quelle von miRNA für die mögliche Diagnose von Erkrankungen des Gallengangs wie Cholangiokarzinom 19 zu verwenden , entwickelt. Es besteht aus mehreren Schritten Zentrifugation mit zunehmender Geschwindigkeit Exosomen zu isolieren und möglicherweise zu anderen biologischen Flüssigkeiten anwendbar.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) membrane filter</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td><td>Roche distributed by Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile

Exosome Forschung in den letzten drei Jahren hat sich stark den Umfang einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomarkern und deren therapeutische Verwendungen ausgeweitet. Exosomen sind microRNAs (miRs) gezeigt enthalten kürzlich. Mirs haben sich als wertvolle Biomarker für diagnostische Zwecke entstanden sind. Als Probenentnahme in Kliniken und Krankenhäusern sehr unterschiedlich ist, variiert miRNA-Isolierung aus Voll Galle erheblich. Um das zu erreichen robuste, genaue und reproduzierbare miRNA Profile gesammelt Gallenproben auf einfache Weise erforderte die Entwicklung eines qualitativ hochwertigen Protokoll zu isolieren und Exosomen von Galle zu charakterisieren. Das Verfahren erfordert mehrere Zentrifugationen und einen Filtrationsschritt mit einer abschließenden Ultrazentrifugationsschritt die isolierten Exosomen zu pelletieren. Elektronenmikroskopie, Western-Blots, Durchflusszytometrie und Multi-Parameter-Nanopartikel-optische Analyse, soweit verfügbar, sind von entscheidender Bedeutung Charakterisierung Schritte, um die Qualität der E zu validierenxosomes. Für die Isolierung von miRNA aus diesen Exosomen, das Lysat mit einem unspezifischen, synthetische miRNA aus einer Spezies , wie Caenorhabditis elegans Spiking, das heißt, Cel-miR-39 , ist wichtig für die Normierung der RNA - Extraktionseffizienz. Die Isolierung von Exosomen von Gallenflüssigkeit nach dieser Methode ermöglicht die erfolgreiche miRNA Profilierungs von Gallenproben für mehrere Jahre bei -80 ° C gelagert.

Da Exosomen zu klein sind, durch regelmäßige Mikroskopie nachgewiesen werden oder Durchflusszytometrie, Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse durchgeführt werden. Die Nanopartikel optische Analyse hat den Vorteil gegenüber der Elektronenmikroskopie, dass es auch quantitative und bietet Größenverteilung und Konzentration. Das Gerät führt einen fein fokussierten Laserstrahl durch ein Glasprisma in die Probe. Die Brownsche Bewegung der isolierten Vesikeln wird üb...

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Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

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JoVE Journal

Medicine

10.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Serie: Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Forschung

Biochemie

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Krebsforschung

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Genetik

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biologie

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...