Name: immunomagnetic separation of fat depot-specific sca1high adipose-derived stem cells (ascs)
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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Diese Arbeit wird von NIH DK095137 (THC) unterstützt. Wir danken den aktuellen und ehemaligen Labor-Mitglieder, die an der Entwicklung und Verfeinerung der beschriebenen Verfahren beigetragen.

Ethik-Statement: Die University of Michigan Ausschuss für Benutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) hat sich für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortierforschung, National Research Council) alle Methoden und Protokolle gemäß dem Leitfaden genehmigt. Die Mäuse werden in einer von der Universität Michigan Vivarium gehalten und haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser und hielt auf einem 12 Stunden Hell / Dunkel-Zyklus gegeben. 1. Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Primärkulturmedien DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G und 1x Antibiotika / Antimykotika. Dies wird verwendet, um Gewebe zu halten, bevor die Verdauung. Legen Sie Lager und aliquoten in 37 ºC Wasserbad. </li><li> Bereiten fünf Milliliter Typ III Kollagenase-Lösung auf 5 mg / ml in HBSS gelöst (+ Ca + Mg) für jede Art von Fettpolsters isoliert ist, bis zu fünf Mäusen. Wenn zum Beispiel SQ und VIS aus einem einzigen Genotyp zu isolieren, machen 10 ml, wenn Wildtyp und Mutante SQ und VIS, 20 ml zu machen. Der pH-Wert auf 7,4 und sterile Filter. Aliquote in 50-ml-Röhrchen. Nehmen Sie sich weg vom Licht. </li><li> Verwenden Sie 70% Ethanol Operationsfeld zu desinfizieren. Wischen Sie und Deckel mit einem blauen Pad. Sprühen Sie etwas Ethanol auf dem blauen Kissen. </li><li> Verwenden Sie die 22 G Nadeln ein absorbierendes Kissen auf der Styroporplatte festzunageln und schneiden mit einer Schere. Sprühen Sie das Pad mit Ethanol dann das Brett auf dem blauen Kissen gesetzt und mit einem anderen blauen Kissen abdecken, bis Dissektion beginnt. </li><li> Füllen Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit Ethanol und in einem Stand neben dem OP-Feld. Legen Sie die Schere und Pinzette in Ethanol. </li><li> Füllen Sie ein weiteres 50-ml-Röhrchen mit PBS plus 1x anti-anti für Ethanol aus chirurgischen Werkzeugen zu spülen. </li><li> In der Haube, Etikett 60-mm-Schalen für jeden Gewebetyp und füllen mit Kulturmedien auf 37 ° C erwärmt. Legen Sie die Platten neben dem OP-Bereich. </li></ol> 2. Isolierung von subkutanem (SQ) Fettpolster <ol><li> Euthanize Maus mit einer Überdosis von Isofluran und Pneumothorax. </li><li> SanftSpray-Maus mit 70% Ethanol und lag dem Rücken. Pin die Pfoten auf die Schaumplatte mit 22 G Nadeln. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des Unterleibs. die Spitze der Schnitt mit der Zange halten, nehmen Sie die Schere und die Haut vor dem Peritoneum trennen. </li><li> Sobald die Haut aus dem Peritoneum vom Abdomen auf den Thorax getrennt ist, spiegeln die Haut vom Peritoneum in Richtung des Kopfes durch entlang der Seite des Körpers seitliche Schnitte in der Haut. </li><li> Spiegeln die verbleibende Haut in den Leisten Fett vom Körper weg halten und Stift mit 22 G Nadeln an der Platte nach unten. </li><li> Wechseln Sie zu einer feinen Schere und Pinzette. Besorgen Sie sich die Leistenfettpolster mit der Zange am Ursprung in der Nähe des Peritoneum und schnippeln entfernt zwischen der Haut und Leisten- Fett in Richtung der Leiste voran Vermeidung der SQ mit der Haut zu kontaminieren. </li><li> Legen Sie die insolated Leistenfettpolster in der 60-mm-Schale bezeichnet. </li></ol> 3. Isolierung von Visceral (VIS) Fettpolster <ol><li> In ähnlicher Weise zu Schritt 2.5, schneiden Sie das Peritoneum geöffnet, um die viszerale Fettpolster und gut aus. </li><li> Bewegen Sie den Darm weg in Richtung des Thorax. </li><li> Besorgen Sie sich die VIS Fettpolster am distalen Ende und sanft nach oben ziehen. Präparieren Sie das VIS Fettpolster, während vorsichtig epididymal auszuschließen (oder des Uterus, wenn weibliche Mäuse verwendet wird) Gewebe. </li><li> Platz in der Bezeichnung Schale und wiederholen Sie den Schritt 3.3 für den verbleibenden VIS-Pad. </li></ol> 4. Collagenaseverdau von Fettpolstern <ol><li> Verschieben 60 mm-Schalen auf die Gewebekultur Kapuze und absaugen Medien. </li><li> Mince die Fettpolster mit einer gebogenen Schere fügen Sie dann zu Kollagenase-Lösung. Achten Sie darauf, die Schere und Zange zwischen Gewebetypen mit Ethanol und PBS zu spülen. </li><li> Schütteln bei 300 rpm und 37 ° C für 10-20 min, bis Gewebe verdaut werden. Es ist akzeptabel, wenn einige Stücke von SQ noch sichtbar sind. Dies wird in einem späteren Schritt zu richten. </li><li> 25 ml Kulturmedien auf die Kollagenase-Lösung die collag zu stoppenenase Behandlung und Pipette nach oben und unten 10-mal mit einer 10 ml serologische Pipette die verdaute Gewebe zu verteilen. </li><li> Der Stamm-Zellen eine 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb verwendet wird. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. </li><li> Sorgfältig Medien abdekantieren nicht das Pellet zu stören und zu 5 ml sterilem Wasser zu dem Pellet hinzu und sanft Pipetten Zellen zu suspendieren. Warten Sie 2 min Erythrozyten zu lysieren. </li><li> 25 ml Medium mit 10% FBS und Dehnungs Zellen durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Dekantieren Medien und Pellet in 1 ml Kulturmedium. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung von 1: 1 Trypanblau. </li><li> Platte 1 x 10 6 Zellen in einer Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen. </li></ol> 5. Magnetzellseparation <ol><li> Nach etwa 4 bis 6 Stunden der Zelladhäsion, spülen die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg). Distanzieren anhaftenden Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin. Verdünnen Trypsin Zellsuspension in 1 ml Trennpuffer und Spin5 min bei 300 x g. </li><li> Überstand entfernen. Die Zellen in 500 &amp; mgr; l Puffer. Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot und zählen Zellen eine Zählkammer. </li><li> Spin-Zellen für 5 min bei 300 x g. </li><li> Überstand entfernen vollständig. Die Zellen in 90 &amp; mgr; l Puffer. In 10 ul anti-Sca1-FITC primären Antikörper. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g. Vollständig entfernen Überstand. </li><li> Die Zellen in 80 ul Puffer. In 20 ul anti-FITC-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in 500 &amp; mgr; l Puffer. </li><li> Legen Sie Spalte in der Magnethalterung und spülen Säule mit 500 &amp; mgr; l Puffer. </li><li> Hinzufügen Zellsuspension zu Spalte. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren. </li><li> Sammeln Sie die unbeschriftete Sca1 - &lt;/ Sup&gt; Zellen und Säule 3-mal mit 500 &amp; mgr; l Puffer waschen. Nur neue Puffer hinzuzufügen, wenn der Behälter leer ist. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren. </li><li> Entfernen Sie Spalte aus dem Magnethalter und in einen 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ml Säulenpuffer und Sca1 + eluieren durch geliefert Kolben durch die Säule Reservoir drückt. </li><li> Spin down Zellfraktionen für 5 Minuten bei 300 x g. Die Zellen in 1 ml Kulturmedium. </li><li> Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot aus den markierten und unmarkierten Fraktionen und zählen Zellen eine Zählkammer. </li><li> Platte jede Zellfraktion in 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li></ol> 6. Überprüfung der Immunomagnetische Trennung von Sca1 hohe ACSs mit Durchflusszytometrie <ol><li> Spülen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg) und distanzieren Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min. Die Zellen in 1 ml Kulturmedien und zählen eine Zählkammer. </li><li> Erhalten&gt; 10 6 </sup&gt; Zellen in 1 ml Kulturmedien und Zentrifuge bei 300 g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.3 zwei weitere Male. </li><li> Die Zellen mit 1 ml 2% Ziegenserum + 2% BSA und Block 30 min bei RT. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Lösung blockiert. </li><li> Hinzufügen Ratte IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 &amp; mgr; g, 1: 400) oder anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 &amp; mgr; g, 1: 400), in 100 &amp; mgr; l PBS mit 2% Ziegenserum und 2% BSA + PBS bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln. </li><li> 1 ml kaltem PBS zu den Zellen. Zentrifuge 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.9 zwei weitere Male. </li><li> Die Zellen in 1 ml PBS. Pass Zellsuspensionen durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb in der Vorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier zeigen wir die Isolierung und immunomagnetischer Zellseparation von murinen ASCS aus verschiedenen Fettpolster und deren Verwendung für die in - vitro - Experimenten. Die vorgestellte Methode ist wirksam für die schnelle Isolierung von großen Anzahl von Sca1-positive ASCS, die über die technisch aufwendige und teure FACS-vermittelte Isolierung von ASCS 9,14 vorteilhaft ist. Anders als FACS, ist immunomagnetischen Zelltrennung erlauben nicht die Verwendung von mehreren Antigen zur Id...

Stammzell - Antigen 1 (Sca1 oder Ly6A / E) wurde zuerst als ein Zelloberflächenmarker von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen 5,6 ausgedrückt identifiziert. Die stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von Fettgewebe aus Maus - Fettdepots erhalten ist eine heterogene Population von Zellen von Fibroblasten umfasst, Makrophagen, vaskulären Endothelzellen, Nervenzellen und Adipozyten Progenitorzellen 7. Adipocyte Vorläuferzellen oder Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCS) sind nicht-lipidbeladenen Zellen , die in das Kollagen-reiche perivaskulärem extrazellulären Matrix (ECM) 8 befinden. Etwa 50% des SVF von ASCS bestehen, die als linien negativ charakterisiert sind (Lin -) und CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. Die meisten dieser Zellen sind Sca1 +: CD24 - Adipozyten - Progenitoren, die von Adipozyten - Differenzierung in vitro geeignet sind; jedoch nur ein Bruchteil der Zellen (0,08% SVF) bildet Sca1 <soben&gt; +: CD24 + Zellen , die durchaus in der Lage vermehren und differenzieren zu Adipozyten in den in - vivo - Bedingungen 9 sind. Trotz der möglichen Einschränkung der ohne Unterscheidung CD24 + Zellen aus CD24 Sca1 + SVF mit - Zellen, Isolierung Sca1 + ASCS von Fettdepots immunomagnetischer Zelltrennung unter Verwendung ist eine effiziente und praktische Ansatz , um die zellautonome Phänotyp der primären Adipozyten Vorläuferzellen zu bestimmen. Auf dem Gebiet der Adipositas und Diabetes, Gewebefibrose und Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Wartung von Typ-2 - Diabetes 3 ​​spielen. Vor kurzem Tokunaga et al. zeigten , dass von Leisten- isolierten High - Zellen Sca1 (oder subkutan, SQ) und perigonadal (oder viszerale, VIS) 10 verschiedene Gen - Signaturen und ECM - Umbau in vitro C57BL6 / J Fettdepots aufweisen. MMP14 (MT1-MMP), ein prototypisches Mitglied der membran typ Matrix - Metalloproteinase (MMP) Familie vermittelt die Entwicklung von weißen Fettgewebe (WAT) durch seine kollagenolytischer Aktivität 1. Beispiele für Experimente , die mit den Zellen kann durch das folgende Protokoll sind die dreidimensionale Kultur, Differenzierung Studien, Kollagenabbau - Assays und RNA - Sequenzierung 10,11 isoliert und angereichert durchgeführt werden. Der Abbau Assays sollten mit Säure extrahierten Kollagen durchgeführt werden , um die Erhaltung der Telopeptid 11,12 zu gewährleisten. Das folgende Protokoll wird die Methoden nachweisen primären Zellen vaskuläre Stroma aus verschiedenen Fettdepots zu isolieren und zu Adipozyten-Vorläuferzellen unter Verwendung von immunomagnetischer Zelltrennung zu bereichern. Die Gültigkeit der Zellsortierung mit Fluss bewertet werden Zytometrie und durch den Einsatz von Sca1-GFP - Mäuse , die GFP in Sca1 + Zellen exprimieren, angetrieben durch einen Sca1 Promotor 13.

<table><tbody><tr><td>Type 3 Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004182</td><td>Tissue digestion</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>High-glucose culture medium</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Media antibiotic</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Media antifungal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&amp;mu;m cell strainer</td></tr><tr><td>60 mm plates</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Large</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Fine, curved tip</td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8&amp;rdquo; needles</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5&amp;rdquo; needles</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 microbead kit (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&amp;ordm;Ab and anti-FITC microbeads 2&amp;ordm;Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS running buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Blue chux pads</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent pads</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td>Use from 50 ml tubes</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom tube</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&amp;ndash;Ca, &amp;ndash;Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>For collagenase solution</td></tr><tr><td>Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid</td><td>Prepare in house&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>Prepare in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO&lt;sub&gt;3&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetic separation of fat depot-specific sca1high adipose-derived stem cells (ascs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Anreicherung von Sca1 hohe ASCS aus verschiedenen Fettpolster. Die vaskuläre Stromazellen aus SQ Fett Anzeige Fibroblasten-ähnliche isoliert, gestreckt Zellform unabhängig von Sca1 Expressionsniveau (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite, VIS (EWAT-derived) Sca1 hoch und Sca1 niedrigen Zellen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Zellform. Wie SQ (iWAT abgeleitete) Sca1 <sup...

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Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

6.8K Aufrufe.  Biointerfaces Institute, University of Michigan. We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Serie: Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Immunologie und Infektion

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Biologie

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Medizin

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen aus Fettgewebe

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

Autor im Rampenlicht: Isolierung und Identifizierung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1

Zusammenfassung

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Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten