EMS wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (NIH) [Grant-Nummer R01HL120919] unterstützt; der American Heart Association [Gewährungsnummer 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA Auszeichnung von der NIH [Grant-Nummer UL1 TR000042]; und Startup-Mittel aus dem Aab CVRI. MAT wurde zum Teil durch einen Zuschuss an die University of Rochester School of Medicine and Dentistry vom Howard Hughes Medical Institute Med-In-Grad-Initiative unterstützt; und eine institutionelle Ruth L. Kirschstein National Research Service Award von der NIH [Grant-Nummer GM068411].

HINWEIS: Alle Experimente mit Mäusen von der Universität Ausschuss für Tier Ressourcen an der Universität von Rochester genehmigt. 1. Epicardial Outgrowth Kulturassay (1A) <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie 5 ml Medium A für die primäre epikardialen Zellisolierung durch Ergänzung Medium 199 (M199) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep). </li><li> Vorwärmen Medium A und 100 ml Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) in einem 37 ° C Wasserbad °. </li><li> Erlauben kollagenbeschichtete chamber slides für 30 min auf Raumtemperatur erwärmen. </li><li> 100 l Medium A in jede Vertiefung der Kammer Rutsche und sanft drehen, um die Kollagenoberfläche gleichmäßig zu beschichten. Wiederholen Sie dies für 8-12 Brunnen. Entfernen Sie das Medium nach dem Beschichtungskammern. </li><li> Aliquot vorgewärmte HBSS in zwei 10 cm 2 Platten mit jeweils 50 ml HBSS. </li></ol></li><li> Isolieren Embryonale Herzen von schwangeren Mutter auf 11,5 Tage post coitum (DPC).30 <ol><li> Anästhesieren Maus mit 0,5 ml von 13 mg / ml Ketamin / 0,88 mg / ml Xylazin Cocktail in 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) über intraperitoneale Injektion. Bestätigen Sie die richtige anesthetization einen Zeh Prise Test. Eine sanfte pinch ist ausreichend, um zu bestimmen, ob die Maus anspricht. Jede Bewegung oder Pfote zurückzuziehen zeigt das Tier nicht ausreichend zu tun Operation narkotisiert. Euthanize durch zervikale Dislokation. </li><li> Legen Sie die Maus Bauchseite nach oben und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol Kontamination durch Haare zu reduzieren. </li><li> Drücken Sie die Haut mit einer Pinzette und schneiden einen seitlichen Schnitt am Bauch mit chirurgischen Schere. Halten Sie die Haut fest und ziehen Sie dann auseinander Richtungen in Richtung Kopf und Schwanz in entgegenwirkt. </li><li> Pinch das Peritoneum mit einer Zange und Schneiden mit einer Schere in die Bauchhöhle zu belichten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Decidua entlang der Mesometrium durch Schneiden. Übertragen Sie die seziert Decidua auf vorgewärmt HBSS im ersten10 cm 2 - Platte. </li><li> Trennen Sie die Decidua von zwischen Embryonen zu schneiden. </li><li> Übertragen eines Embryos in die zweite 10 cm 2 - Platte mit vorgewärmter HBSS unter einem Binokular. Entfernen Sie vorsichtig die extraembryonic Gewebe und Dottersack, dann den Embryo enthaupten. </li><li> Klemmen Sie die Brustwand mit einer Pinzette und reißen das Gewebe auseinander an der Mittellinie, Freilegung der Brusthöhle. </li><li> Legen Sie die Zange hinter dem Herzen. Fassen Sie den Ausflusstrakt und ziehen Sie das Herz weg vom Embryo. Trennen Sie die Lungenwege und Lunge aus dem Herzen, wenn noch angebracht. </li></ol></li><li> Übertragen Sie das Herz auf eine einzelne Vertiefung der Kollagen-beschichteten Objektträger und legen Sie es dorsalen Seite nach unten (Abbildung 1B). Wiederholen Sie die Schritte 1.2.7-1.3 für jeden Embryo. </li><li> Sobald alle Herzen zu einzelnen Vertiefungen übertragen worden ist , die Kammer inkubieren Rutsche für 30 min bei 37 ° C, 5% CO 2 ausreichende Haftung an der Kollagenmatrix zu ermöglichen. </li><li> sorgfältig hinzufügen20-50 &amp; mgr; l vorgewärmtes Medium Explantat A um jedes Herz. Wichtig: Nehmen Sie das Medium nicht addieren sich zu schnell oder zu einem Niveau oberhalb des Herzens, sonst Herzen, die von Kollagen Substrat ablösen kann. </li><li> Kultur die Herzen bei 37 ° C, 5% CO 2 für ungefähr 24 Stunden epikardialen Auswuchs zu ermöglichen. Anmerkung: Auswüchse kann bereits 3-4 h der Kultur (1C) und in erster Linie besteht aus Mesothelzellen Anzeige cobblestoned Morphologie mit minimaler mesenchymale Zellkontamination (Figuren 1D, E) beobachtet werden. Repräsentative Ergebnisse wurden mit einem Präpariermikroskop mit einer Kamera ausgestattet erworben. </li></ol> 2. Genetische Ablation und Induktion der EMT in Epikardiale Auswüchse Vorsicht: Behandeln Sie Adenoviren mit Sorgfalt nach anerkannten Richtlinien der biologischen Sicherheit. <ol><li> Bereiten Sie 15 ml Medium B (M199 mit 1% FBS und 1% Pen / Strep) und Pre-warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Für Exzisionfloxed Allele, bereiten Explantation Medium B , ergänzt mit 2,5 x 10 4 pfu / ml Adenovirus exprimieren Cre - Rekombinase (Ad / CRE) oder Kontrollvirus. Hinweis: Adenovirale vermittelte Überexpression von Kandidatengenen können auch gain of function Phänotypen zu bewerten durchgeführt werden. Virustiter sollte durch den Endverbraucher bestimmt. </li><li> mit einer Pinzette vorsichtig Epikard abgereicherte Herzen aus Auswuchs Kulturen zu entfernen. Übertragen Herzen auf 1,5-ml-Röhrchen mit 800 ul Trizol und bei -80 ° C für eine spätere RNA-Isolierung und Genexpressionsanalyse. </li><li> Waschen jeder Vertiefung mit DPBS Blutzellen und überschüssige Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Hinzufügen 500 ul Explantat - Medium B mit Adenovirus ergänzt (n) zu jedem Auswachsen der Kultur und Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Für EMT Induktion entfernen Medien und füllt mit 37 ° C Explantation Medium B ergänzt mit rekombinanten Transforming Growth Factor (TGF) -β1 [10 ng / ml] oder Vehikel (4 mM hydrochloric Säure (HCl), enthaltend 1 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)). Kultur Explantate für weitere 24 h bei 37 ° C, 5% CO 2. Fahren Sie mit dem Gen / Protein-Expressionsanalysen oder Immunzytochemie, wie in den nachfolgenden Protokollen beschrieben. Anmerkung: Die Induktion der epikardialen EMT wurde mit verschiedenen Konzentrationen von TGF-β1 im Bereich von 0,5 ng / ml stimuliert worden - 10 ng / ml 26,31-33. Höhere Konzentrationen von Liganden in unspezifischen führen kann an alle TGF-β-Rezeptoren binden. Die Konzentration von TGF-β1 sollten die spezifischen experimentellen Ziele widerspiegeln. </li></ol> 3. Genexpressionsanalyse von Epikardiale Auswüchse <ol><li> Thaw Epikard verarmten Herzen zuvor in Trizol gespeichert (2.2). </li><li> Absaugen Medien aus EPDC Kulturen und waschen zweimal mit DPBS. </li><li> In 800 ul Raumtemperatur Trizol Kulturen bis zur Explantation. </li><li> Inkubieren Epikard abgereicherte Herzen und EPDC Kulturen in Trizol für 5 min bei Raum temperatu<html> Re. Pipette nach oben und unten das Zehnfache der lysierten Probe zu homogenisieren. Hinweis: Innere weitere Pipettieren erfordern, um vollständig zu homogenisieren. </li><li> Übertragen Lysate bis 1,5-ml-Röhrchen und fahren Sie mit der Gesamt-RNA Isolierung pro Anweisungen des Herstellers. In 10 ug Glykogen vor der Fällung RNA-Ausbeute zu erhöhen. Eine gegebene Explantation wird etwa 0,5 bis 1,0 &amp; mgr; g RNA ergeben. </li><li> Entfernen Sie kontaminieren DNA mit DNase I und Reverse transkribieren 0,5 ug mRNA pro Anweisungen des Herstellers. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der epikardialen Explantate und / oder Induktion von EMT mit quantitativen reversen Transkription (qRT) -PCR 34 mit SYBR grün und die in der Tabelle beschriebenen Marker 1. Normalisieren - mRNA - Spiegel zu Glycerinaldehyd - 3-Phosphat - Dehydrogenase (GAPDH) und berechnen relativen Expression unter Verwendung von die 2 - ΔΔCt Verfahren 35. Typische Ergebnisse sind in 2A gezeigt. </li></ol>title &quot;&gt; 4. Protein-Analyse von Epikardiale Auswüchse <ol><li> Absaugen Medien aus EPDC Kulturen und waschen zweimal mit DPBS. </li><li> In 10 ul eiskaltem Protein Lysepuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,0, 1% Triton X-100, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail) zu jeder Kammer gut und legen Sie die Kammer gleiten auf Eis. Schneiden Sie ca. ¼ des Bodens auf einer P200 Pipettenspitze ab und verwenden Sie das restliche Stück der Zellen aus der Folie zu kratzen. Pipette nach oben und unten zu lysieren epikardialen Zellen und in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Beschallen lysiert Explantate auf niedrig (160 W) für 5 min in einem Bad Eiswasser mit 30 Sekunden EIN und AUS-Zyklen. </li><li> Zentrifuge Lysate 10 min bei 10000 · g, 4 ° C. Überstand in ein frisches Röhrchen und Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Protein - Assay 36. Hinweis: Eine gegebene Explantation wird Ausbeute von bis zu 1,5 &amp; mgr; g Gesamtprotein. Wir haben gefunden, dass die Bündelung Explantate von zwei Herzen eind Beladung 2 ug Protein pro Vertiefung ist ausreichend glatten Muskulatur α-Aktin (ACTA2) und 9 GAPDH zu erkennen. Die Detektion von anderen Zielproteine ​​erfordern können mehrere Proben Explantat Pooling wie durch den Endverbraucher bestimmt. </li></ol> 5. Immuncytochemie von Epikardiale Auswüchse <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus Explantation Kulturen und waschen zweimal mit DPBS. </li><li> Fügen Sie vorsichtig 500 ul 4% (v / v) Paraformaldehyd oder eiskaltem Methanol in jede Vertiefung und fixieren Explantate für 5 Minuten bei Raumtemperatur oder 10 min bei -20 ° C. Fix nach Antikörper-Spezifikationen, wie vom Hersteller empfohlen. </li><li> Entfernen Fixiermittel und spülen jede Vertiefung mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 500 ul 0,1% (v / v) Triton X-100 in DPBS für 5 min. </li><li> Entfernen Permeabilisierung Lösung und Spülen mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Blockieren die Zellen mit 10% Serum in DPBS für 30 min bei Raum temperatuRe. </li><li> Fahren Sie mit dem primären Antikörperfärbung pro Herstellerempfehlungen und optimale Bedingungen, wie durch den Endverbraucher bestimmt. </li><li> Entfernen Antikörperlösung und Spülen mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Bewerben sekundären Antikörper den Anweisungen des Herstellers und counterstain mit einem geeigneten Kern Farbstoff. </li><li> Entfernen Antikörperlösung und Spülen mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Entfernen Kammer Gleitwänden den Anweisungen des Herstellers und fügen Medium wässrige Montage direkt an die Zellen. Legen Sie ein Deckglas über die Zellen und Dichtung mit Nagellack. 2D unter Verwendung von invertierten konfokalen Rastermikroskopie - Typische Ergebnisse sind in Figur 2B gezeigt. </li></ol> 6. Ex Vivo Kulturassay (3A) <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Vorbereitung 12 ml ex vivo - Kulturmedium unter Verwendung eines (1: 1) -Mischung aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM): M199 , ergänzt mit 10%FBS und 1% Pen / Strep. </li><li> In einem 37 ° C Wasserbad, vorwärmen ex vivo Kulturmedium und 100 ml HBSS. </li><li> Aliquot 1 ml vorgewärmtes Medium in 8-12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte. </li><li> Transfer vorgewärmt HBSS auf zwei 10 cm 2 Platten, mit je 50 ml. </li></ol></li><li> Isolieren embryonalen Maus-Herzen in HBSS von schwangeren Dämme bei 12,5 dpc (wie in 1.2 beschrieben). </li><li> Übertragen jedes Herz zu einer einzigen Vertiefung der 24 - Well - Platte , die ex vivo Kulturmedium. Inkubieren der Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 unter leichtem Schaukeln oder manuell eine Schaukelplattform Anhaften zu verhindern. Ab sofort gehen 7.1 zu treten. </li></ol> 7. Epikardiale Labeling und EMT Induktion in Ex - vivo - Kulturen <ol><li> Um das Epikard etikettieren, bereiten 12 ml 37 ° C ex vivo - Kulturmedium , supplementiert mit 3,0 x 10 6 pfu / ml Ad / GFP. Für die gezielte Ablation von floxed Allele, Transfer 6 ml Ad / GFP Kulturmedium in ein neues 15 ml konischen Röhrchen ergänzt. Hinzufügen Ad / Cre oder Kontroll - Adenovirus zu einer Endkonzentration von 1,5 x 10 6 pfu / ml. Note: Verstärkung von Funktionsanalysen können auch mit geeigneten Adenovirus-vermittelte Genübertragung durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig von jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit einer P1,000 Pipettenspitze mit dem Kulturmedium. </li><li> Sanft Kulturmedium mit Adenovirus (n) in jede Vertiefung ergänzt hinzuzufügen. </li><li> Die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden unter leichtem Schütteln. </li><li> Für EMT Induktions bereiten 12 ml 37 ° C ex vivo - Kulturmedium , enthaltend 10 ng / ml TGF-β1 und 20 ng / ml platelet-derived growth factor (PDGF) -BB oder Vehikel (4 mM HCl , enthaltend 1 mg / ml BSA ). </li><li> Kulturmedium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit einer P1,000 Pipettenspitze vorsichtig entfernen. Spülen Sie leicht die Herzen mit 1 ml DPBS. </li><li> Entfernen Sie die DPBS und ergänzen Herzen mit ex vivo Kultur michdium enthaltend TGF-β1 und PDGF-BB oder Vehikel. </li><li> Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2 unter leichtem Schütteln. </li></ol> 8. Kryokonservierung und Immunhistochemie von Ex Vivo Cultures <ol><li> Bereiten Sie die Herzen für die Kryokonservierung. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Herzen zweimal mit eiskaltem DPBS. </li><li> 1 ml 4% (v / v) Paraformaldehyd zu jedem Herzen und fixieren für 2 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen Herzen zweimal mit DPBS. Übertragen Sie die Herzen an die frische Brunnen mit 1 ml 10% (w / v) Saccharose in DPBS. Die Platte über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Sorgfältig übertragen Herzen neue Brunnen mit 18% (w / v) Saccharose in DPBS vorbereitet. Die Platte über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Übertragen jedes Herz zu einem cryomold haltiges Gewebe Einfriermedium. Sofort Blöcke einfrieren flüssigem Stickstoff und bei -80 &amp; # verwenden176; C. </li></ol></li><li> Abschnitt Herzen bei 5 um ein Kryostat und Platz Gewebeschnitte auf positiv geladene Objektträger verwenden. Shop gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung. </li><li> Führen Immunhistochemie auf Abschnitte zur Erfassung des Unter epikardialen Basalmembran. <ol><li> Auftauen Folien für Temperatur mindestens 30 min bei Raum. </li><li> Rehydrieren die Abschnitte durch zweimal in DPBS für 5 min unter leichtem Schütteln waschen. </li><li> Permeabilisieren Abschnitt mit 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Objektträger zweimal in DPBS für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Blot überschüssige DPBS und definieren die Färbung Region mit einem hydrophoben Markierungsstift. Blockabschnitte mit 10% Serum in DPBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Block und anwenden Kollagen Typ IV-Antikörper (ColIV, 1: 200) in Block verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einer feuchtigkeitsgesteuerten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in DPBS für5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Verdünnte fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper (1: 500) und DAPI (1: 5.000) in DPBS und gelten für den Folien. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur. Wählen Sie einen geeigneten sekundären Antikörper mit einem Emissions- und Anregungswellenlänge verschieden von GFP. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 min unter leichtem Schütteln. Berg Träger mit Eindeckmediums. </li></ol></li></ol> 9. Imaging und Quantifizierung von Ex - vivo - Kulturen <ol><li> Haben Sie einen verblendet Benutzer Bild und zu quantifizieren gefärbten Schnitten. Bild mindestens fünf nicht aufeinanderfolgende Gewebeschnitte aus einem gegebenen Herz in 4-5 beliebigen Stellen entlang der Epikard (Rand des Herzens) mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Typische Ergebnisse sind in Figur 3B Verwendung invertierter konfokalen Rastermikroskopie gezeigt. </li><li> Zählen Sie manuell die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen in einem gegebenen Bild. Identifizieren EPDC als GFP po Migrationsitive Zellen innerhalb oder außerhalb des subepikardialen Basalmembran ColIV entfernt. Bestimmen den Prozentsatz der GFP-Zellen, wie die Anzahl von migrierenden GFP positive Zellen über die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen in einem gegebenen Bild migrieren. Typische Ergebnisse sind in 3C-D mit invertierten konfokalen Rastermikroskopie gezeigt. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir detaillierte Methoden skizzieren primäre epikardialen Zelle durch Auswuchs zu isolieren und EPDC Migration in ex vivo Herz Kulturen verfolgen. Für Auswuchs Kulturen variiert die geeignete Zeit, um das Epikard abgereicherte Herz zu entfernen leicht zwischen den Experimenten. Eine regelmäßige Überwachung der Explantate nach einer Inkubation über Nacht wird empfohlen, um das Ausmaß der epikardialen Auswuchs zu messen und um das Herz zu extrahieren, bevor Fibroblasten erscheinen. Um sicherzust...

Das Epikard ist eine einzelne Schicht aus Mesothelzellen, die Linien das Herz und die Auswirkungen Herz Entwicklung, Reifung und Reparatur. Durch eine hoch koordinierten Austausch von parakrine Signale ist die innige Dialog zwischen dem Myokard und Epikard unverzichtbar für kardiale Wachstum und der Bildung von Nicht-Myozyten - Herzabstammungslinien 1. Epikardiale abgeleiteten Zellen (EPDC) ergeben sich aus einer Untergruppe von epikardialen Zellen durch eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 2, dringen in den subepikardialen Raum und das darunter liegende Myokard und unterscheiden weitgehend in koronaren Gefäßwandzellen und kardialen Fibroblasten, und ein geringerem Maße, Endothelzellen und Kardiomyozyten 3-9. Die Regulierungsmechanismen epikardialen EMT und EPDC Invasion haben die koordinierte Aktion verschiedener Moleküle einschließlich sezerniert Liganden 10-13, Zelloberflächenrezeptoren und Adhäsionsmoleküle 14,15, regel zugeschrieben wordenToren der apikal-basale Polarität 16,17, kleine GTPasen 18,19 und Transkriptionsfaktoren 2,20,21. Während viele der molekularen Effektoren der EPDC Migration definiert wurden, ein besseres Verständnis der physiologischen Signale, die EPDC Mobilisierung im Embryo stimulieren kann die Entwicklung von Strategien beschleunigen diesen Prozess bei Erwachsenen für eine verbesserte Herz-Reparatur zu manipulieren. Ziel Studien neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, verlassen sich auf die Reinigung von dieser Zellpopulation oder die Migration einzelner epikardialen Zellen zu verfolgen. Eine oder eine Kombination von Markergenen, einschließlich Wt1, Tcf21, Tbx18 und / oder Aldh1a2, wird üblicherweise um die fötale Epikard 1 zu identifizieren. die Verwendung dieser Marker jedoch zu verfolgen EPDC Migration nicht optimal ist, als Ausdruck der epikardialen Markierungen im Laufe der Herzentwicklung nachlässt und wird oft verloren, wenn epikardialen Zellen transdif laufenferenzierung in mesenchymalen Zellen. Die Anwendung des Cre / loxP - System in Verbindung mit lineage-Tracing - Reporter wurde in permanent Markierung des Epikard und seine Abkömmlinge während Herzentwicklung und nach ischämischer Verletzung im erwachsenen 7,22,23 nützlich. Mehrere epikardialen beschränkten Cre Linien wurden 1 erzeugt und verwendet werden , weit EPDC und für die bedingte Gen - Deletion Strategien zu beschriften. Diese Studien haben die Charakterisierung verschiedener Abstammungen epikardialen geführt, und die Identifizierung von kritischen Mediatoren von EPDC Motilität und Differenzierung. Allerdings akkumulieren Hinweise darauf , auch die Epikard eine heterogene Population von Vorläuferzellen 4,24,25 ist. Somit wird nur eine Teilmenge von epikardialen Zellen gerichtet werden, um einen gegebenen Cre-Treiber. Um die gesamte Epikard unabhängig von Cre Spezifität, eine Reihe von Labors zu beschriften haben Auswuchs cul genutztture Systeme oder ex - vivo - Verfahren der Organkultur zu epikardialen Zellen treu zu isolieren oder zu beschriften , ohne in Abhängigkeit von der Expression eines genetischen Abstammungslinie Marker 26-28. Für die Ex - vivo - Migrationsstudien, sind embryonale Herzen vor dem epikardialen EMT und in Medium mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) exprimierenden Adenovirus (Ad / GFP) 9,18 ergänzt isoliert. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Markierung des gesamten Epikard eher als eine Untergruppe von Zellen, die durch Cre-vermittelte Rekombination. Herz - Kulturen werden anschließend mit bekannten Induktoren von EMT ausgesetzt , um die Mobilisierung von EPDC 28,29 zu stimulieren. Ex - vivo und in - vivo - Analysen werden ergänzt durch in vitro epikardialen Explantation Kulturen, die sind ein besonders nützlicher Ansatz für die Erkundung detaillierten Mechanismen der Fahrt EPDC Migration. Hier beschreiben wir Verfahren zur Isolierung von primären epikardialen Zellen für in vitro - Studien von epicardial EMT sowie ein Organkultursystem für die ex vivo - Analysen von EPDC Motilität. Wir haben vor kurzem gezeigt , den Nutzen und die Robustheit dieser Methode durch genetisch die myocardin-related transcription factor Modulation (MRTF) / Serum Response Factor (SRF) Signalisierungsachse 9 Aktin-basierte Migration von EPDC zu manipulieren. Während unsere Ergebnisse notwendig für die Regulierung EPDC Migration eines Signalwegs zu markieren, sind diese Verfahren geeignet ist, die Mechanismen zu entwirren, die gemeinsam EPDC Migration und Differenzierung zu orchestrieren. Darüber hinaus könnte das Explantat und ex vivo - Kultursystemen in Funktionsbildschirme implementiert werden , um neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung für therapeutische Anwendungen in der Herzregeneration zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Hyclone&amp;nbsp;</td><td>SH3002201</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution</td><td>Hyclone</td><td>SH3003102</td><td>HBSS</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Hyclone</td><td>SH3025301</td><td>M199</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3002802</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gemini&amp;nbsp;</td><td>100-106</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td><td>Corning</td><td>354557</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24-well plates</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Equipped with Leica KL300 LED might source</td></tr><tr><td>Confocal miscroscope</td><td>Olympus</td><td>1X81</td><td>Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode&amp;nbsp;</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor beta 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>100-B-001</td><td>TGF-&amp;beta;1</td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor BB</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>220-BB-010</td><td>PDGF-BB</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>15596-026</td><td>Caution, hazardous material</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>DNaseI</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>Life Technologies</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>BioRad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibtor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Goat-anti-rabbit 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-rabbit 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-mouse 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11005</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>monoclonal antibody, clone 1A4</td></tr><tr><td>Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td><td>Life Technologies</td><td>MA1-46028</td><td>monoclonal antibody, clone 6F-H2</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO1</td><td>Life Technologies</td><td>40-2200</td><td>polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Collagen Type 4</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>polyclonal antibody</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-B</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Disposable mictrotome blades&amp;nbsp;</td><td>Sakura Finetek</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td>positively charged, 25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Disposable base molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

Eine einzelne Schicht aus epikardialen Zelllinien das Herz, parakrine Faktoren, die die Bereitstellung von Kardiomyozyten Proliferation stimulieren und Herz-Kreislauf-Vorläufern während der Entwicklung und Krankheit direkt beitragen. Während eine Anzahl von Faktoren in Epikard abgeleitete Zelle (EPDC) Mobilisierungs gebracht wurde, werden die Mechanismen ihrer späteren Migration und Differenzierung regeln schlecht verstanden. Hier stellen wir in vitro und ex vivo - Strategien EPDC Motilität und Differenzierung zu studieren. Zunächst beschreiben wir ein Verfahren zur primären epikardialen Zellen durch Auswachsen aus der Kultur embryonaler Mäuseherzen erhalten. Außerdem stellen wir ein detailliertes Protokoll dreidimensionale Migration von markierten EPDC in einem Organkultursystem zu bewerten. Wir bieten Beweise für diese Techniken, die genetische Deletion von myocardin bezogenen Transkriptionsfaktoren im Epikard EPDC Migration abschwächt. Dieser Ansatz dient als Plattform Kandidat Modifikatoren der EPDC zu bewertenBiologie und könnte verwendet werden, genetische oder chemische Bildschirme zu entwickeln neuartigen Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, die für die Herzreparatur nützlich sein könnten.

Das Epikard effizient sein kann mit einem Auswuchs Kulturtest isoliert durch Ausnutzung seiner äußeren Stelle zu nehmen und die Entwicklungs Plastizität und intrinsische Zugverhalten der EPDC nutzen. Murinen embryonalen Herzen werden bei E11.5 vor epikardialen EMT und kultivierten dorsalen Seite nach unten auf kollagenbeschichteten chamber slides 26 (1A, B) isoliert. Explantierte Herz wird schrumpfen weiter; jedoch wird das Epikard zu der Kollagenmatrix haf...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K Aufrufe.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

Serie: Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Ingenieurwesen

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Biologie

Elektroporationsbasierte Transgenese von Herzzellen in Mausherzen

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autor im Rampenlicht: Transgenese von Herzzellen für schnelles Gen-Screening

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und

Zusammenfassung

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Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym