This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

1. Herstellung der Kapillarreaktor <ol><li> Schneiden die 100 &amp; mgr; m Innendurchmesser (ID) x 360 um Außendurchmesser (OD) Kapillare auf eine Länge von 7-8 cm, und die 20 &amp; mgr; m ID x 90 um OD Kapillare 3-5 cm mit der Glaskapillare Spalter; unter dem Mikroskop zu überprüfen, dass beide Kapillarenden eine saubere, gerade geschnitten haben, ohne vorstehende Grate. </li><li> Legen Sie die 20 &amp; mgr; m ID x 90 &amp; mgr; m OD Kapillare in ein Ende der 100 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD Kapillare, auf einer Länge von ca. 6 mm; im Bedarfsfall zu beachten, diese Operation unter dem Mikroskop. </li><li> Tragen Sie eine kleine Tröpfchen Kleber E6000 um die Kreuzung der 90 &amp; mgr; m OD / 100 &amp; mgr; m ID Kapillaren mit dem Ende eines Q-Tip, und lassen Sie den Leim Heilung O / N bei RT. </li><li> Schneiden die eingelegte 20 um ID x 90 um OD Kapillare auf eine Länge von ~ 10-15 mm; dies wird der Elektrospray-Ionisations-Emitter sein. </li><li> Vorgeschnittene die 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK und 1/16 &quot;OD PTFE Wanneing in Stücke von 4-5 cm in der Länge; diese werden die Hülsen in der Kapillar-Gewerkschaften verwendet werden, um eine leckfreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Schließen Sie das andere Ende der 100 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD Kapillare zu einer PEEK Vereinigung; verwenden, um eine 1/32 &quot;PEEK Hülse für eine leckagefreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Insert / ziehen ein Stück ~ 5 cm lange 1/16 &quot;PTFE-Schlauch in das entgegengesetzte Ende der Union. </li><li> Wiegen ca. 4 mg C18 (5 um) Teilchen in einer vorgereinigten / getrocknete 2 ml Glasphiole; 0,5 ml Isopropanol, schließen Sie die Aufschlämmung in dem Ultraschallgerät Bad das Fläschchen und zu verteilen. </li><li> Ziehen Sie mit einer 250 &amp; mgr; l-Spritze etwa 200 &amp; mgr; l Brei, legen Sie die Spritzennadel in den 1/16 &quot;PTFE-Schlauch der PEEK-Vereinigung, und verzichten Sie langsam den Schlamm in den 100 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD Kapillare, beobachten unter dem Mikroskop als die Kapillare füllt sich mit Teilchen bis zu einer Länge von 2-3 mm Verpackung erreicht wird, dies wird der Mikroreaktor (Abbildung 1) werden , um die 20 μ.m ID Kapillare behält die Partikel im Mikroreaktor durch eine Keystone - Effekt. 15 </li><li> Spülen Sie das Mikroreaktor mit ~ 50 &amp; mgr; l Lösung von H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, und dann mit ~ 50 &amp; mgr; l Lösung von H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Herstellung von Beispiellösungen Hinweis: Operationen, die aus organischen Lösungsmitteln und Säuren und Herstellung der Lösung beinhalten Handhabung sind in einem Abzug durchgeführt werden. Schutzbrille, Handschuhe und Schutzkleidung. <ol><li> Spülen mit CH 3 OH und trocknen einige Glasfläschchen (4 ml) und Polypropylenröhrchen (15 ml). </li><li> Herstellung von 10 ml einer Lösung von H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in einem 15 ml Polypropylenröhrchen durch Mischen von 9,8 ml H 2 O mit 200 &amp; mgr; l CH 3 CN; mischen durch Beschallung. </li><li> Herstellung von 10 ml einer Lösung von H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in einem 15 ml Polypropylenröhrchen durch Mischen von 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O mit 5 ml CH 3 CN; mischen durch Beschallung. </li><li> Herstellung von 4 ml einer angesäuerten wässerigen Lösung (TFA 0,01% v / v) durch Zugabe von 4 &amp; mgr; l TFA (10%) auf 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in einem 4 ml - Glasfläschchen; mischen durch Beschallung. </li><li> Herstellung von 4 ml einer angesäuerten organischen Lösung (TFA 0,01% v / v) durch Zugabe von 4 &amp; mgr; l TFA (10%) auf 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in ein 4 - ml - Glasgefß; mischen durch Beschallung. </li><li> Man wiegt 16 mg NH 4 HCO 3 mit einer analytischen Mikrowaage in einem 4-ml-Glasampulle; 4 ml des H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) Lösung und zu dispergieren durch Beschallung; dies führt zu einer 50 mM Lösung von NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in wässrigem Puffer. </li><li> Wiegen 5 mg eines Standard - Proteins (beispielsweise Rinderserumalbumin, Hämoglobin - α / β, Cytochrom C, Carboanhydrase, α-2-HS-Glycoprotein, etc.) mit einem analytischen Mikrowaage in einem 4 - ml - Glasampulle; 4 ml DI water und zerstreuen durch Beschallung; Dies führt in der Regel in einem hohen &amp; mgr; M-Ebene Konzentration Lösung. </li><li> Bereiten Sie 1 ml Proteinlösung (1-2 uM) durch die hohe uM-Level - Konzentration Lösung mit einem geeigneten Volumen von NH 4 HCO 3 (50 mM) wässrigen Puffer verdünnt; mischen durch Beschallung. </li><li> Bereiten Sie die Trypsin - Lösung (5 uM) durch Auflösen von 20 &amp; mgr; g - Sequenzierung-Grade - Trypsin in 170 &amp; mgr; l NH 4 HCO 3 (50 mM) wässrigen Puffer; zerstreuen durch Beschallung. </li></ol> 3. Versuchsaufbau Anmerkung: Die LTQ-MS-System mit einer modifizierten ESI-Quelle ausgestattet ist, der ein Haus gebaut XYZ-Stufe enthält, die verschiedenen Probeneingabe Ansätze des Massenspektrometers ermöglicht Schnittstelle. <ol><li> Trennen Sie das Kapillarreaktor aus der PEEK-Anschluss und eine Verbindung mit dem PEEK-T-Stück. </li><li> Legen Sie eine ~ 2 cm lange Pt-Draht in der Seiten Arm des PEEK-T; verwenden, um eine 1/32 &quot;PEEK Hülse für die Bereitstellung einerleckagefreie Verbindung und für die Pt-Draht isolierend. </li><li> Verbinden einer 50 um x 360 um ID OD (~ 0,5 m lang) Probenübertragungs Kapillare zu dem entgegengesetzten Ende des PEEK Tee; verwenden, um eine 1/32 &quot;PEEK Hülse für eine leckagefreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Sichern Sie die PEEK-T-Stück auf der XYZ-Bühne und positionieren Sie den ESI Emitter ~ 2 mm entfernt von dem Massenspektrometer Einlasskapillare. </li><li> Schließen Sie den Pt-Draht an die ESI-Stromversorgungsquelle des Massenspektrometers. </li><li> Schließen Sie das andere Ende der Proben Transferkapillare auf die Edelstahl-Vereinigung; verwenden, um eine 1/16 &quot;PEEK Hülse für eine leckagefreie Verbindung bereitstellt. </li><li> Schließen Sie einen 4-5 cm langen 1/16 &quot;PTFE - Schlauch mit dem gegenüberliegenden Ende des Edelstahl Union und legen Sie die 250 &amp; mgr; l Spritzennadel in dem PTFE - Schlauch, biegen Sie an der Pumpe und stellen Sie die Durchflussrate auf den gewünschten Wert (zB 2 &amp; mgr; l / min). </li><li> Eingangs Tandem-MS-Datenerfassungsparameter in das Softwarepaket, das die MS-Gerät ein steuertals eine Methode Datei bereit Setup-d speichern Sie die Analyse für die Durchführung; für das LTQ-MS-System verwenden, um die abhängigen Analyseparameter folgende Daten: dynamische Ausschluss für 180 Sekunden mit Ausschluss Masse Breite ± 1,5 m / z freigegeben; ein MS um eine Zoom gefolgt Scan und MS 2 Scans auf den Top - 5 - intensivsten Peaks, Zoom Scanbreite von ± 5 m / z; stoßinduzierte Dissoziation (CID) auf Isolationsbreite eingestellt Parameter 3 m / z, normalisierten Kollisionsenergie von 35%, die Aktivierung Q 0,25 und Aktivierungszeit 30 ms. </li></ol> 4. Mikrofluidik-Setup <ol><li> Bereiten einer mikrofluidischen Vorrichtung aus Glas oder polymeren Substraten; 16-18 die Anordnung der Vorrichtung ist in Figur 2A, die aus einem Mikroreaktor (1) (0,13 mm Breite x 2 mm Länge x 50 um tief) , die mit einem Einlass (2 ), Auslass (3) und einer Seitenöffnung (4); die Verbindungskanäle für fluidische Manipulationen sind ~110 &amp; mgr; m breit und ca. 50 &amp; mgr; m tief; eine mehrkanalige Struktur (5), bestehend aus ~ 1,5-2 &amp; mgr; m tief x 10 um breit x 100 um lang platziert Mikrokanäle 25 &amp; mgr; m voneinander entfernt, als ein Filter wirken , werden die Partikel in den Mikroreaktor zum Halten. </li><li> Aktivieren Fluidabgabe Verbindungen zu dem Chip durch spezialisierte Verbinder mit den Einlassöffnungen Kleben oder durch ein polymeres Stand Konzeption , die Armaturen für Flüssigkeitsabgabe (2B) aufnimmt. 16 </li><li> Bereiten einer Aufschlämmung von Teilchen C18 (5 um), wie in Schritt 1.8; die Aufschlämmung auf den Mikroreaktor mit einer Spritze zu liefern unter Verwendung von 1/16 &quot;PTFE - Schlauch mit dem Chip - Seitenanschluß (4) verbunden, dichten den Port nach Partikelbeladung mit Epoxidkleber und Heilung für 1 h in einem Ofen bei 90 ºC 16. </li><li> Legen Sie eine Kapillare (20 &amp; mgr; m ID x 90 &amp; mgr; m Außendurchmesser x 10 mm Länge) in der Austrittsöffnung, Dichtung mit E6000 Leim und lassen Heilung O / N; dies wird der ESI Emitter werden ( <strong&gt; 6). </li><li> Schließen Sie eine 50 &amp; mgr; m ID x 360 &amp; mgr; m OD (~ 0,5 m lang) Probentransfer Kapillare mit dem Chip Einlassöffnung (2); das entgegengesetzte Ende der Kapillare verbinden, wie beschrieben in einen 250 &amp; mgr; l-Spritze und der Spritzenpumpe, in 3,6-3,7. </li><li> Legen Sie eine leichte PEEK T - Anschluss auf der Probenübertragungsleitung kurz vor dem Einlassöffnung (2) und legen Sie eine Pt - Draht auf der Seite-Arm des T, wie in 3.2 beschrieben; dies wird die ESI-Elektrode sein. </li><li> Sichern Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung auf der XYZ-Bühne mit dem ESI-Emitter positioniert ~ 2 mm entfernt von dem Massenspektrometer Einlasskapillare; die MS für die Analyse vorzubereiten, wie in 3.8 beschrieben. </li></ol> 5. Probe Beladen, proteolytischen Abbau und Elution für MS-Analyse Anmerkung: Alle Lösung / sample Transferschritte werden mit Hilfe einer Spritzenpumpe durchgeführt, und sollte für einige weitere Minuten ermöglichen abzuschließen, für die Toten-Volum zu kompensierenes mit den Übertragungsleitungen verbunden sind und von dem Mikroreaktor; die notwendige Zeit hängt von den Strömungsgeschwindigkeiten abhängig beteiligt. <ol><li> Spülen Sie das Mikroreaktor und bereiten sie für die Analyse durch eine wässrige Lösung von NH 4 HCO 3 Infundieren (50 mM) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) bei 2 &amp; mgr; l / min für 5 min; verwenden, um eine 250 &amp; mgr; l-Spritze. </li><li> Laden Sie die Proteinprobe (1 &amp; mgr; M) auf dem Mikroreaktor durch Infundieren der Probenlösung bei 2 ul / min für 5 min; verwenden, um eine 250 &amp; mgr; l-Spritze. </li><li> die Trypsin-Lösung (5 &amp; mgr; M) über das adsorbierte Protein auf der Mikroreaktor bei 2 ul / min für 1-3 min ziehen lassen. </li><li> Quenche die proteolytische Verdauung durch den Mikroreaktor mit einer angesäuerten wässrigen Lösung von TFA Spülen (0,01% v / v) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) bei 2 &amp; mgr; l / min für 5 min; verwenden, um eine 250 &amp; mgr; l-Spritze. </li><li> Starten Sie das Protein unter Elution aus dem Mikroreaktor verdauen durch eine angesäuerte organische Lösung von TFA Infusion (0,01%v / v) in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) bei 300 nl / min. </li><li> Schalten Sie den MS-Daten-Erfassungsprozesses und der ESI-Spannung (~ 2000 V); erwerben MS-Daten die Datenerfassungsparameter zur Verfügung gestellt in Schritt 3.8 verwendet wird; Die Elution der tryptischen Peptide beobachten. </li></ol> 6. Datenverarbeitung <ol><li> Verarbeiten Sie die Tandem-MS-Daten mit einer Suchmaschine kompatibel mit dem rohen MS-Datenformat. <ol><li> Verarbeiten Sie die LTQ-MS Raw-Dateien einen Organismus spezifischen minimal redundanten Proteindatenbank verwendet wird; laden die Rohdaten in der Suchmaschine, stellen Sie die Eltern und Fragmentionenmassentoleranzen zu 2 und 1 Da jeweils nur voll tryptischen Fragmente verwenden, um mit bis zu zwei für die Suche verpasst cleavages; nicht für posttranslationale Modifikationen ermöglichen; stellen Sie die oberen und mittleren Vertrauen False Discovery Rate (FDR) bis 1% und 3%, bzw., und erlauben keine posttranslationalen Modifikationen. </li></ol></li><li> Filtern Sie die Daten nur hoch Vertrauen zu wählenPeptid entspricht den Proteinen in der Datenbank; bewerten die Protein- und Peptid-Level-Ergebnisse. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Der Mikroreaktor in dieser Arbeit beschriebenen bietet eine einfach zu implementierende Versuchsaufbau zur Durchführung einer enzymatischen Verdauung der Proteine ​​MS-Analyse und Identifizierung in weniger als 30 min zu ermöglichen. Die klaren Vorteile dieses Systems im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, sind Einfachheit, Geschwindigkeit, niedrige Reagenzienverbrauch und niedrige Kosten. Insbesondere gibt es keine Notwendigkeit für teure immobilisiertem Trypsin Perlen und Patronen. Die Herstellung der Kapill...

Die Identifizierung und Charakterisierung der gereinigten Proteine ​​wird unter Verwendung von MS-Techniken häufig erreicht. Das Protein wird mit einem Enzym verdaut und die Peptide werden weiter durch MS analysiert, indem eine einfache Infusionsversuchsaufbau verwendet. Proteolytische Verdauung ist zur Erzeugung von kleinen Peptidfragmente notwendig, die in der nützlichen Massenbereich von den meisten MS-Analysatoren fallen, und das kann leicht durch geringe Energiestoßinduzierte Dissoziation fragmentiert werden, um Aminosäuresequenzinformation zu erzeugen. Für isolierte Proteine ​​oder Proteingemische einfache, gibt es keine weitere Notwendigkeit für die chromatographische Trennung von Peptiden vor der MS-Detektion. Eine Mischung aus 25-50 Peptide können leicht durch Infundieren der Probe mit einer Spritzenpumpe in den MS-Ionenquelle direkt analysiert werden. Das Massenspektrometer kann die Analyse durchzuführen und die Sequenz eines Proteins innerhalb einer kurzen Zeitrahmen zu bestätigen. Bei modernen Datenerfassungsverfahren kann dieses Verfahren durchgeführt werden wnnerhalb ein paar Minuten oder sogar Sekunden. Der begrenzende Faktor des gesamten Prozesses in Vollendung auf einer kurzen Zeitskala ist die proteolytischen Verdauungsschritt. Normalerweise ist dies ein paar Stunden (oder O / N) durchgeführt über, in Lösung, bei 37 ° C, unter Verwendung von Substrat: Enzym-Verhältnisse von (50-100): 1. Um die enzymatische Digestionszeit auf Minuten oder Sekunden, immobilisierte Enzym Mikroreaktoren, in Form von Mikrofluidik - Reaktoren oder handelsüblichen Kartuschen zu verringern, sind beschrieben worden. 1-6 Typischerweise wird das Enzym durch kovalente, nicht-kovalente / physikalische Adsorption, Komplex immobilisiert 3,6 die verbesserte Effizienz des enzymatischen Verfahrens durch die große Oberfläche-zu-Volumen und Enzym-zu-Substrat - Verhältnisse Bildung oder Verkapselung, aktiviert zu werden. Weitere Vorteile von immobilisierten Reaktoren sind ua Autolyse und Störungen durch das Enzym in MS-Analyse reduziert, Enzymstabilität und Wiederverwertbarkeit verbessert. Eine Vielzahl von Ansätzen unter Verwendung von Glas- oder Polymer mikrofabrizierten Vorrichtungen beschrieben worden sind,Enzyme immobilisiert auf magnetischen Kügelchen durch Antikörper-Antigen - Wechselwirkungen unter Verwendung 7,8 in Gold - Nanopartikel Netzwerke eingeschlossen, 9 in Titandioxid-Aluminiumoxid - Sol-Gele 10 und nanozeolites verkapselt, 11 oder gefangen durch Ni-NTA oder His-Tag - Komplexbildung. 6 Alternativ ebenso wurden 12 Darüber hinaus hat gezeigt , verbesserte proteolytischen Spaltung wurde, offenen Rohr Kapillaren mit immobilisierten Enzymen entwickelt., unter Verwendung von gesteuerten Mikrowellenbestrahlung 13 oder druckunterstützten oder Druckzyklisierung Technologie (PCT) zur Verringerung der Reaktionszeiten auf 30-120 min. 14 Trotz der vielen Vorteile von immobilisierten Enzymreaktoren, die die Kosten der kommerziellen Patronen hoch ist, die Verfügbarkeit von Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Routineanwendung ist begrenzt, und die Verwendung von Mikrowellen- oder PCT Technologien führt Notwendigkeit zusätzlicher Instrumentierung. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zu entwickeln, die circumvezur Durchführung einer enzymatischen Spaltung von Proteinen in der Vorbereitung für MS-Analyse innerhalb von Minuten ngen diese Nachteile, und das kann leicht in jedem Labor durchgeführt werden Forscher mit einem einfachen und effektiven Ansatz zu stärken. Der Ansatz beruht auf der Verwendung von hydrophoben, C18-Teilchen, die in einer Kapillare oder mikrofluidische Vorrichtung vorbelastet sind, und die Adsorption des Protein (e) von Interesse auf den Teilchen durch enzymatischen Verdau während der Infusion des Enzyms über den gefolgten gepackte Bett und nahm Protein (e). In diesem Ansatz wird das Substrat durch nicht-kovalente Wechselwirkungen immobilisiert sind, und das Enzym wird über das immobilisierte Protein infundiert. Die proteolytische Verdauung Effizienz wird durch die große Partikeloberfläche Bereichen erhöht, die das Protein für die enzymatische Verarbeitung, reduzierte Abstände und Diffusionszeiten zu und von der Oberfläche der Teilchen, verbesserte Massenübertragung, keine kovalente Bindung belichten, die die Aktivität des Enzyms beeinflussen können, die Fähigkeit, schnell evaluate Kombinationen verschiedener Enzyme, Entsorgbarkeit und Multiplexen, wenn das Verfahren in einem mikrofluidischen Format ausgeführt. Dieser Ansatz wird unter Verwendung einer Mischung von Standardproteinen und Trypsin-das am häufigsten verwendete Enzym für proteolytischen Verdau vor der ESI-MS-Detektion nachgewiesen. Das Massenspektrometer zur Detektion in dieser Studie verwendet wurde, war eine lineare Quadrupol-Falle (LTQ) -Instrument.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ion trap ESI-MS</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>LTQ</td>
			<td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ stage</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Multiple parts</td>
			<td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>G81-278</td>
			<td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance/Metler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46600-204</td>
			<td>The balance is used to weigh the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath/Branson</td>
			<td>VWR</td>
			<td>33995-540</td>
			<td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump 22</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>552222</td>
			<td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water system&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ZD5311595&#160;</td>
			<td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-410</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (100 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-406</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-402</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (100 &#181;m ID x 360 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (20 &#181;m ID x 100 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP020090</td>
			<td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (50 &#181;m ID x 360 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP050375</td>
			<td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary cleaver</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>23740-U</td>
			<td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Eclectic Products</td>
			<td>E6000 Craft</td>
			<td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Epo-Tek</td>
			<td>353NDT</td>
			<td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 particles (5 &#181;m)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Zorbax 300SB-C18</td>
			<td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe/glass (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81130-1725RN</td>
			<td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal reducing PEEK Union (1/16&#8221; to 1/32&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>ZRU1.5FPK</td>
			<td>This union is used to connect the 250 &#181;L syringe to the microreactor for loading the 5 &#181;m particle slurry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel union (1/16&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>ZU1XC</td>
			<td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>MT.5XCPK</td>
			<td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee connector (light weight)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>C-NTXFPK</td>
			<td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt wire (0.404 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66260-126</td>
			<td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/16&#8221; OD)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>TTF115-10FT</td>
			<td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing (0.015&#8220; ID x 1/16&#8221; OD)</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td>1565</td>
			<td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 &#181;m ID transfer capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing (0.015&#8221; ID x 1/32&#8221; OD)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>TPK.515-25</td>
			<td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean-cut polymer tubing cutter</td>
			<td>Valco</td>
			<td>JR-797</td>
			<td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&#8221; and 1/32&#8217; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial (2 mL)</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>HP-5183-2069</td>
			<td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial (4 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-948</td>
			<td>The vials are used to prepare sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube (15 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-286D</td>
			<td>The vials are used to prepare buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylinder (100 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24710-463</td>
			<td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylinder (10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24710-441</td>
			<td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-386</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (100 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53503-781</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53511-681</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass substrates</td>
			<td>Nanofilm</td>
			<td>B270 white crown, 3&#8221; x 3&#8221;</td>
			<td>These are glass substrates for microchip fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male nut fitting (1/16&#8221;)</td>
			<td>Upchurch</td>
			<td>P203X</td>
			<td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>Upchurch</td>
			<td>N-122H</td>
			<td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Multiple #</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

Die überwiegende Mehrheit der Massenspektrometrie (MS) -Basis Proteinanalyseverfahren beinhalten ein enzymatisches Verdauungsschritt der Detektion vor, typischerweise mit Trypsin. Dieser Schritt ist für die Erzeugung von niedermolekularen Peptide erforderlich, in der Regel mit MW &lt;3000-4000 Da, die innerhalb des effektiven Scan-Bereich der Massenspektrometrie Instrumentierung fallen. Herkömmliche Protokolle beinhalten O / N enzymatische Verdauung bei 37 ºC. Jüngste Fortschritte haben zu der Entwicklung einer Vielzahl von Strategien geführt, in der Regel die Verwendung eines Mikroreaktor mit immobilisierten Enzymen oder aus einer Reihe von komplementären physikalischen Prozessen beteiligt, die die Zeit , die für proteolytischen Verdau zu einigen Minuten (beispielsweise Mikrowellen- oder Hoch reduzieren Druck). In dieser Arbeit beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Lösung, die in einem Labor für die Erreichung schnelle enzymatische Verdauung eines Proteins umgesetzt werden können. Das Protein (oder Proteingemisch) adsorbiert an C18-gebundene Umkehrphasen-Hochleistungormance Flüssigchromatographie (HPLC) Siliciumdioxidteilchen in einer Kapillarsäule vorgespannt, und Trypsin in wässrigem Puffer wird für eine kurze Zeit über die Teilchen infundiert. Zu ermöglichen Online-MS-Detektion, die tryptischen Peptide werden mit einem Lösungsmittelsystem mit einem erhöhten Gehalt an organischen Stoffen direkt in der MS-Ionenquelle eluiert. Dieser Ansatz vermeidet die Verwendung von hochpreisigen immobilisiertem Enzympartikel und erforderlich macht keine Hilfe für den Prozess abzuschließen. Protein Verdauung und vollständige Probenanalyse kann in weniger als ~ 3 min und ca. 30 min bzw. erreicht werden.

Ein repräsentatives Ergebnis eines proteolytischen Verdauungsprozess gleichzeitig durchgeführt auf einer Mischung von Proteinen, mit den oben beschriebenen Mikroreaktoren (Figuren 1 oder 2) ist in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. Die Tabelle , die die einzigartigen Peptidsequenzen umfasst, die ein bestimmtes Protein zu identifizieren, wobei der Quer Korrelation Score (Xcorr) (dh eine Punktzahl, die für die entsprechenden Tandem - Massenspek...

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Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K Aufrufe.  Virginia Tech. A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Serie: Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. However, to achieve robust sample manipulation it is necessary to address device integration with the macroscale environment. To realize repeatable, sensitive particle separation with microfluidic devices, this protocol presents a complete automated and integrated microfluidic platform that enables precise processing of 0.15&#8211;1.5 ml samples using microfluidic devices. Important aspects of this system include modular device layout and robust fixtures resulting in reliable and flexible world to chip connections, and fully-automated fluid handling which accomplishes closed-loop sample collection, system cleaning and priming steps to ensure repeatable operation. Different microfluidic devices can be used interchangeably with this architecture. Here we incorporate an acoustofluidic device, detail its characterization, performance optimization, and demonstrate its use for size-separation of biological samples. By using real-time feedback during separation experiments, sample collection is optimized to conserve and concentrate sample. Although requiring the integration of multiple pieces of equipment, advantages of this architecture include the ability to process unknown samples with no additional system optimization, ease of device replacement, and precise, robust sample processing.

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

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