Name: fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons at JoVE.com

This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Ethics Statement: Verfahren mit Versuchstieren wurden unter Protokolle, die von der Universität Valladolid Stallanlage in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention 123 / Europarat und der Richtlinie 86/609 / EWG zugelassen abgewickelt. 1. Kurz und Langzeitkultur von Ratten-Hippokampus-Neuronen <ol><li> Herstellung von Poly-D-Lysin-beschichtete 12 mm-Glasdeckgläschen. <ol><li> Sterilisieren, Durchmesser 12 mm Deckgläser in Ethanol für mindestens 24 Stunden. Lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen zu trocknen. </li><li> Verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen von Parafilm in einer Petrischale. Decken die Oberfläche jedes Deckglas mit 200 ul 1 mg / ml Poly-D-Lysin. Lassen Sie die Behandlung von O / N. </li><li> Am nächsten Tag waschen Sie die Deckgläser mit doppelt destilliertem sterilem Wasser alle 15 min für 90 min unter sterilen Bedingungen. </li><li> Füllen Sie eine vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium pro Vertiefung. Neurobasal Kulturmedium sollte ergänzt werden,10% fötales Rinderserum, 2% B27, 1 &amp; mgr; g / ml Gentamycin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in der Multischale Platte. Halten sie in einer angefeuchteten 37 ºC und 5% CO 2 -Inkubator bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Isolierung von Neuronen im Hippocampus von neugeborenen Ratten. <ol><li> Vorbereitung 1,8 ml Papainlösung (direkt erworben) in einem Glasfläschchen (20 ul / ml) unter sterilen Bedingungen: bis zu einer Endkonzentration von 20 &amp; mgr; l zu erhalten / ml etwa 40 &amp; mgr; l Papain in 1,8 ml Hank plus 0,6% BSA hinzuzufügen (ul berechnet werden in Abhängigkeit von den Lieferanten Bedingungen). Hanks 0,6% BSA wird durch Mischen von 85 ml HBSS Medium mit 15 ml 4% iges Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt Lösung 4 g BSA in 100 ml HBSS). Bereiten Sie es in einer sterilen Haube. </li><li> Inkubieren Papain in Hank plus 0,6% BSA für 30 Minuten bei 37 ºC vor der Verwendung. Filtern der Lösung unter Verwendung eines 0,22 um Filter vor der Verwendung. </li><li> Vorbereitung Hams F-12-Medium durch Zugabe von Dulbecco-Modifiziertem Eagle-Medium-Pulver (13,5 g pro Liter) in 900 ml doppelt destilliertem sterilem Wasser. Fügen Sie dann 6 g HEPES und 336 mg NaHCO 3 und den pH auf 7,42 mit NaOH 4 N. In sterilem Wasser, um eine 1 L Lösung zu erhalten und filtern es mit einem 0,20 um Polyethersulfon (PES) Flaschenaufsatzfilter. Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube. Schließlich sättigt die Lösung mit CO 2 unter sterilen Bedingungen vor der Verwendung. Shop-Lösungen bei 4 ° C und verwenden Sie sie gekühlt. </li><li> Euthanize Neugeborenen (P0) Rattenjungen durch Enthauptung und waschen Sie den Kopf in sterile HBS Medium. Öffnen Sie den Schädel mit Hilfe einer sterilen Schere. Extrahieren Sie das Gehirn mit einem Spatel und waschen Sie ihn schnell in Hams F-12-Medium. </li><li> Machen Sie einen Schrägschnitt mit Hilfe eines Skalpells in jeder Hemisphäre (1B), und tragen sie zu einer Petrischale mit Ham-F-12-Medium. </li><li> Verwerfen Meningen sorgfältig mit Hilfe von Pinzetten und Dissektion unter einer Lupe. </li> &lt;li&gt; Geben Sie den Hippocampus in einem charakteristischen konkaven Stelle über dem Kortex mit Lupe. Dann trennen den Hippocampus von der Rinde durch vorsichtiges Ziehen von einer Grenze und Entfernen von seiner Position mit Augen Schere. </li><li> Übertragen Sie die Hippocampus-Gewebe bis zu einer 4-Well-Platte mit steriler Hanks Medium ohne Ca 2+ und Mg 2+ und 0,6% BSA aufgefüllt und waschen Hippocampus-Gewebe. Ohne dass die Medien zu schneiden das Gewebe in kleine Stücke (ca. 2 x 2 mm) mit den gleichen Augen Schere. </li><li> Übertragen hippocampalen Stücke zu einer Ampulle, die 1,8 ml vorfiltriert Papainlösung. Dann inkubieren sie bei 37 ° C unter gelegentlichem, leichtem Schütteln. 15 Minuten später, fügen Sie 90 ul DNase I-Lösung (50 ug / ml final) und Inkubation für weitere 15 min. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe mit einem 10 ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Bruchstücke mit frischen Neurobasal Kulturmedium. Erhalten Zellsuspension, indem Gewebefragmente durch eine 5 ml-Kunststoff pipette. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einem Kunststoff sterilen Pasteur-Pipette und Pellet auszusetzen vorsichtig mit 1 ml automatisierte Pipette in 1 ml Neurobasal Kulturmedium. </li><li> Messung der Zelldichte unter Verwendung eines Neubauer-Zählkammer. Legen Sie das Deckglas über die Neubauer-Kammer. Zugabe von 10 &amp; mgr; l Zellsuspension. Stellen Sie sicher, die Zellsuspension in die Kammer gleichmäßig und macht keine Blasen. Zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop und führen entsprechenden Berechnungen, um eine geeignete Tropfen 40-80 ul, enthaltend 30 x 10 3 Zellen erhalten. Die Gesamtzahl der Zellen wird von der Anzahl der verwendeten Tiere ab. </li></ol></li><li> Kurzzeit- und Langzeitkultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen. <ol><li> Im Laufe der vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium hergestellt, bevor und in den Inkubator, Platte aufbewahrt ca. 30 x 10 3 Zellen in einem Rückgang von etwa 50 &amp; mgr; l zu jedemauch der Multischale Platte mit einem Poly-D-Lysin-beschichtete, Durchmesser 12 mm Deckglas. </li><li> Pflegen primären Hippocampus-Zellen in einem befeuchteten 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 2-5 Tage in vitro (DIV, kurzfristige, junge Kulturen) oder&gt; 15 DIV (langfristige, im Alter von Kulturen), bevor Experimente ohne die Kultur Medien. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescence Imaging der cytosolischen Ca 2+ -Konzentration <ol><li> Herstellung von Testlösungen für Fluoreszenz-Imaging. <ol><li> Vorbereitung eines externen HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10, Natrium-HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Vorbereitung eines externen, Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Lösen NMDA in Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) mit einem FINAl Konzentration von 100 &amp; mgr; M und ergänzen Sie es mit 10 uM Glycin. </li><li> Vorbereitung einer HBS enthaltende Lösung KCl anstelle von NaCl durch die Lösung (in mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42). </li></ol></li><li> Laden des Hippocampus-Zellen mit fluoreszierenden Calciumsonde Fura2 / AM. <ol><li> Nehmen Sie die Zellkultur enthält Deckgläser aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit HBS-Medium bei RT durch Übertragung auf ein neues Vier auch Multischale Platte, die 500 &amp; mgr; l HBS pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren Zellen mit Fura2 / AM 4 &amp; mgr; M für 60 min bei RT (25 ° C) an einem dunklen Ort (in der gleichen HBS Medium hergestellt). </li><li> Nach 60 min waschen Deckgläser mit frischen HBS Medium. </li></ol></li><li> Aufnahme von Fluoreszenzbildern von zytosolischen [Ca 2+] in kultivierten Zellen. <ol><li> Schalten Sie die Lampe, Mikroskop, Perfusionssystem, Fluoreszenz-Kamera und Computer. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in einem thermostatisierten Plattform fürOpen 12 mm Deckgläser auf der Bühne des inversen Mikroskop und wählen Sie einen mikroskopischen Bereich unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3). Perfundieren Zellen kontinuierlich mit vorgewärmten (37 ° C) HBS Mediums in Abwesenheit oder Anwesenheit von Testsubstanzen. Aufrechterhaltung der Strömung mit einer Rate von ungefähr 5-10 ml / min. Hinweis: Handy Perfusionssystem für lebende Zellen in einem thermostatisierten Plattform für offene 12 mm Deckgläser montiert. 8-Linien schwerkraftgetriebenen Perfusionssystem mit einer Ventilsteuerung ausgerüstet ist, um die Lösungen zu perfundieren. Eine Vakuumpumpe ist für das Entfernen überschüssigen Mediums verantwortlich. Lösungen werden unter Verwendung eines in-Rohr-Heizung erwärmt. </li><li> Nehmen Sie ein Hintergrundbild mit der Verschluss an beiden Anregungswellenlängen geschlossen. </li><li> Epi-Zellen leuchten abwechselnd bei 340 und 380 nm. Record Licht bei 520 nm alle 5-10 s mit einer Fluoreszenzkamera, die von einer Fura-2 dichroitischen Spiegel gefiltert wird emittiert. </li><li> Wenn die Aufzeichnungszeit beendet ist, speichern Sie die vollständige Sequenz of Bilder bei 520 nm emittiert im Computer zur weiteren Analyse. </li></ol></li><li> Analyse von aufgezeichneten Fluoreszenzbilder. <ol><li> Öffnen Sie das Experiment-Datei. Unter Verwendung des Aquacosmos Software, klicken Sie auf &quot;Verhältnis&quot; und wählen Sie die gewünschte Übersetzungsbereich. Berechnung der pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Sequenz von Verhältnis Bilder zu erhalten. </li><li> Subtrahieren Hintergrund durch Einstellen der &#39;Hintergrund Beseitigung&#39;. Drücken Sie &quot;Start Berechnung &#39;. </li><li> Drücken Sie &#39;Alle Zeitfolge &quot;Knopf und löschen die alten Regions of Interest (ROIs). Zur quantitativen Analyse von Einzelzellen herzustellen neuen Regionen von Interesse oder ROIs entsprechend einzelnen Neuronen. Durchschnitt alle Verhältniswerte in jedem Pixel entsprechend jedem ROI und jedes Bild, um eine Aufnahme von Verhältnisfluoreszenzwerte für einzelne ROIs (Zellen) zu erhalten. </li><li> Um die einzelnen Aufnahmen anzuzeigen exportieren Verhältnis Fluoreszenzwerte entsprechend jeder ROI auf eine grafische progrbin. </li><li> Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Fluoreszenz-Verhältnis in Reaktion auf jede Stimulierung unter Verwendung einer geeigneten Datenanalyse und grafische Software. </li></ol></li></ol> 3. Biolumineszenz-Bildgebung der mitochondrialen Ca2 + -Konzentration <ol><li> Transfektion von kultivierten Hippocampusneuronen mit der mitGAmut Plasmid. HINWEIS: Die Zellen werden zunächst mit dem mitGAmut Plasmid, das ein Mitochondrien-Targeting-Sequenz und eine mutierte Aequorin fehlt ein Ca 2+ Bindungsstelle an das grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert transfiziert. Diese Konstruktion erkennt große Anstiege in der mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme und ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen durch das GFP-Fluoreszenz. Das Plasmid wurde entwickelt und freundlicherweise von P. Brulet und Mitarbeiter 18 (CNRS, Paris) zur Verfügung gestellt. <ol><li> Bereiten Neurobasal TF, enthält Neurobasal Kulturmedium ohne fötales Rinderserum, B27, gentamicin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 2,5 ul Transfektionsreagenz in einem Fläschchen (Lösung A). Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut Plasmid in einem Fläschchen (Lösung B). Sanft hinzufügen Lösung B über Lösung A. Lassen Mischen während 20 min ohne Schütteln. </li><li> Übertragen Sie die Deckgläser haltigen Neuronen im Hippocampus, neue Multischale Platten, enthaltend 200 &amp; mgr; l frisches Neurobasal TF. </li><li> In tropfenweise 100 ul Lösung A + B über jedes Deckglas. Inkubation für 30 min. Entfernen Sie das Medium. Einmal Zellen mit frischem Neurobasal TF waschen. Bringen Sie die Deckgläser auf den ursprünglichen Neurobasal Kulturmedium. </li><li> Kultur Neuronen für zusätzliche 24 h bei 37 ºC und 5% CO 2 nach der Transfektion, um eine effiziente Expression und Ausrichtung der Sonde zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Herstellung von Testlösungen für Biolumineszenz-Bildgebung. <ol><li> Bereiten HBS Lösungen, die NMDA-100 um oder 145 mM KCl alsoben beschrieben (Schritt 2.1). Vorbereitung HBS-Lösung, die 10 mM Ca 2+ und Digitonin 100 uM. </li></ol></li><li> Rekonstitution von Mitochondrien-Targeting Aequorin mit Coelenterazin n. <ol><li> Transferdeck transfiziert Hippocampusneuronen zu einem Vier-Loch-Platte, die 200 &amp; mgr; l HBS. </li><li> In 4 ul Coelenterazin n (200 &amp; mgr; M) zu 200 ul HBS für eine Endkonzentration von 4 &amp; mgr; M und vorsichtig mischen. Inkubation für 2 Stunden bei RT (25 ° C) und bei Dunkelheit. </li></ol></li><li> Aufzeichnungs Biolumineszenz Bilder mitochondriale [Ca 2+]. <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, die Lampe, das Perfusionssystem, Biolumineszenz-Kamera und dem Computer. </li><li> Übertragen rekonstituiert Deckgläser in eine thermostatisierte (37 ° C) Perfusionskammer und perfundieren kontinuierlich mit vorgewärmter HBS-Lösung mit einer Rate von 5-10 ml / min. </li><li> Unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3), wählen Sie eine mikroskopische Feld mit Zellen, die einpoaequorins wie durch Fluoreszenzemission mit der Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) assoziiert mit den FITC-Filter dargestellt. Eine typische Feld kann 1-2 transfizierte Zellen enthalten. Nehmen Sie das GFP-Fluoreszenzbild, mit einer CCD-Kamera. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Licht. Entfernen Sie die dichroitischen haltigen Box in der Lichtpfad befindet. Schalten Sie das Anregungslicht und schließen Sie die Dunkelfeld für völliger Dunkelheit. </li><li> Perfundieren Zellen in 5-10 ml / min mit HBS Medium mit oder ohne Testlösungen bei 37 ° C vorgewärmt. </li><li> Erfassen Photonenemissions Bilder alle 10 sec mit einer Photonenzählung Kamera mit einem Bildprozessor abgewickelt. </li><li> Am Ende jedes Experiments permeabilisieren Zellen mit 0,1 mM Digitonin in 10 mM CaCl 2 in HBS, um alle verbleibenden Photonenemissionen zu lösen. Hinweis: Diese photonischen Emissionen müssen, um die Gesamtphotonenemissionen, eine für die Kalibrierung in Ca 2+ Konzentrationen erforderlichen Wert zu schätzen hinzugefügt werden &lt;./ li&gt; <li> Speicher Biolumineszenz Bilder in dem Computer mit dem GFP assoziiert Fluoreszenzbild vor der Photonenzählung Bildgebung erfasst. </li></ol></li><li> Analyse der Biolumineszenz Bilder reflektieren mitochondriale [Ca 2+]. <ol><li> Quantifizierung photonischen Emissionen unter Verwendung spezifischer Software. Photonic-Emissionen zu mitochondrialen freien Ca unter Verwendung des von Brini et al. 15 beschriebenen Algorithmus umgewandelt werden 2+ -Konzentration ([Ca 2+] mit). </li><li> Öffnen Sie das Experiment und die GFP-Fluoreszenz Bild. Ausgewählte Bereiche von Interesse (ROIs) mit Hilfe spezifischer Software, indem die Form der transfizierten Zellen nach den Fluoreszenzbildern zu Beginn des Experiments eingefangen. </li><li> Fügen Sie die gleichen ROIs für jedes Bild. Gesamtphotonenemissionen in jedem ROI mit spezifischer Software, die Lumineszenzemission Wert (L) für jede Zelle in jedem Zeitpunkt zu erhalten, berechnet. </li><li> Alle photonischen EMISS hinzufügenIonen in der Biolumineszenz-Bilder, einschließlich der nach der Digitonin Permeabilisierung, mit der spezifische Software, um eine Biolumineszenz-Bild alle photonischen Emissionen zu erhalten, die erhalten diejenigen. </li><li> Exportwerte von Photonenemissionen für jeden Bereich von Interesse zu einer spezifischen Software für die Berechnungen. Um dies zu tun, klicken Sie auf &quot;Grafik&quot;, um die Biolumineszenz-Werte für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Wählen Sie &#39;Gesamtwert&#39; und &#39;verwenden aktuelle ROI für alle Bilder. Drücken Sie &#39;berechnen&#39;. Speichern Sie die &#39;txt.file&#39; und Export von Daten auf ein Arbeitsblatt. Für jede ROI, [Ca 2+] mit berechnet wird unter Verwendung des folgenden Algorithmus: [Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; woher, R = [L / (L Gesamt λ)] 1 / n L die Lumineszenz zu dem Zeitpunkt der Messung in jedem interessierenden Bereich emittiert. L Gesamt istdas nach Zugabe der in dem Gewebe zu diesem Zeitpunkt zu dem Zeitpunkt der Messung für jeden interessierenden Bereich vorhanden Zählungen verbleibende Gesamt Lumineszenz. λ, K TR, K R und n Konstanten, dessen Werte auf Kombination von Aequorin (Wildtyp oder mutierte) und coelenterazin verwendet (Wildtyp oder n-Typ) als auch die Aufzeichnungstemperatur 16. Für die hier verwendete Kombination (mutiert AEQ und coelenterzine n), bei 37 ° C, haben wir die folgenden Werte: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 × 10 3, n = 1204 und λ = 0138. </li></ol></li><li> Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Biolumineszenz als Antwort auf jeden Stimulus unter Verwendung eines geeigneten Datenanalyse und grafische Software. </li></ol>

<ol>
	<li>Sattler, R., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glutamate+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+cell+death.">Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death.</a> Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).</li><li>MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA-receptor+activation+increases+cytoplasmic+calcium+concentration+in+cultured+spinal+cord+neurones.">NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones.</a> Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).</li><li>Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity+in+cortical+cell+culture.">Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).</li><li>Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+triggers+internucleosomal+DNA+cleavage+in+neuronal+cells.">Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).</li><li>Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+to+excitotoxicity+in+aged+hippocampal+cultures+and+neuroprotection+by+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs:+role+of+mitochondrial+calcium.">Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium.</a> Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunits+have+differential+roles+in+mediating+excitotoxic+neuronal+death+both+in+vitro+and+in+vivo.">NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).</li><li>Zhou, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+NMDA+neurotoxicity+reflect+developmental+changes+in+subunit+composition+of+NMDA+receptors.">Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).</li><li>Brewer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vulnerability+of+hippocampal+neurons+with+age+in+culture:+temporal+association+with+increases+in+NMDA+receptor+current,+NR2A+subunit+expression+and+recruitment+of+L-type+calcium+channels.">Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels.</a> Brain Research. 1151, 20-31 (2007).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).</li><li>Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-induced+neuron+death+requires+mitochondrial+calcium+uptake.">Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake.</a> Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).</li><li>Pivovarova, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).</li><li>Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+markers+of+age-related+memory+dysfunction:+behavioral,+electrophysiological+and+morphological+perspectives.">Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives.</a> Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).</li><li>Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+stress+from+excitatory+neurotransmission+contributes+to+cholesterol+loss+in+hippocampal+neurons+aging+in+vitro.">Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro.</a> Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).</li><li>Brini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfected+aequorin+in+the+measurement+of+cytosolic+Ca2++concentration+([Ca2+]c).+A+critical+evaluation.">Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).</li><li>Villalobos, C., Alonso, M. T., Garc&#236;a-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+calcium+oscillations+inside+intracellular+organelles.">Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).</li><li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+of+Ca2++among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells.">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

Der Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase im alternden Gehirn an kognitiven Verluste in Zusammenhang gebracht, erhöhte Anfälligkeit für ischämische Schädigung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. Um diese Hypothese in vitro zu untersuchen, sind Ca 2+ bildgebenden Verfahren zur Verfügung. Leider lebensfähige Kulturen von Hippocampusneuronen alt sind nicht zuverlässig. Vor kurzem wurde beobachtet, dass die Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampusneuronen vorliegenden viele ...

Exzitotoxizität ist einer der wichtigsten Mechanismen, der einen Beitrag zur Neuronenschädigung und Zelltod in neurologischen Beleidigungen wie Ischämie und in einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit ein. Diese Art von Neurotoxizität wird hauptsächlich durch Glutamat wirkend auf Ca 2+ vermittelte -durchlässigen, ionotropen NMDA-Rezeptoren (NMDAR) 2. Exposition von kultivierten Neuronen Glutamat kann Exzitotoxizität 3, die neuronale Apoptose 4 verursacht führen. Wir und andere haben bereits berichtet, dass die neuronale Anfälligkeit für NMDA-induzierte Apoptose bei der Entwicklung in vitro und Alterungs 5-8 ändern. Es ist weithin anerkannt, daß eine Erhöhung der cytosolischen freies Ca 2+ -Konzentration ([Ca 2+] cyt) führt zu Zellen-Aktivierung. Allerdings, wenn dieser Anstieg zu hoch ist und / oder genug aufrechterhalten, kann Zelltod 9 auszulösen. Außerdem wurde vorgeschlagen,daß Exzitotoxizität erfordert mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme 10, da die Behandlung von Neuronen mit einem mitochondrialen Entkoppler geschützt Neuronen gegen Glutamat-induzierte Zelltod 11. Wenn Mitochondrien zu viel Ca 2+ kann die Öffnung der mitochondrialen Permeability Transition Pore auftreten, was zu von Cytochrom c und andere pro-apoptotischen Faktoren und Induktion von Apoptose zu lösen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme ist direkt mit der altersabhängigen Anfälligkeit Exzitotoxizität verwandte, durch direktes Messen NMDA-induzierten mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme in einzelnen Neuronen des Hippocampus 5, ein Verfahren, das in diesem Artikel berichtet wird. Der Hippocampus, in physiologischen Prozessen, wie Lernen, Gedächtnis und kognitiven Prozessen 12 beteiligt ist, sehr anfällig für Alterung und neurodegenerativen Störungen 13. Hat, die vorgeschlagen, nach mehreren Wochen in vitro kultiviertHippokampus-Neuronen zeigen eine Reihe von typischen Merkmale Alter von 14 Neuronen. Dementsprechend kann langfristige kultivierten Hippokampus-Neuronen bieten ein umfassendes Modell zur Ca 2+ vermittelte Mechanismen der verstärkten Exzitotoxizität in Alterung zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel des vorgestellten Verfahrens ist daher die wesentliche Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Ca 2+ Umbau im alternden Gehirn untersuchen, einschließlich der Differential Ca 2+ Reaktionen, die durch NMDA-Rezeptor-Agonisten in einer langfristigen kultivierten Hippokampus-Neuronen ausgelöst . Das Verfahren enthält eine detaillierte Beschreibung der Kultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen und die Überwachung der cytosolischen und mitochondriale Ca 2+ Konzentrationen von Fluoreszenz und Biolumineszenz-Bildgebung in einzelnen Neuronen auf. Fluoreszenz-Imaging der cytosolischen Ca 2+ in kultivierten Neuronen ist ein Standardverfahren. Jedoch ist dieses Verfahren zum Unter unzuverlässigerzelluläre Ca 2+ Messungen einschließlich mitochondrialen Ca 2+. Gründe dafür sind mangelhafte Ausrichtung der synthetischen Sonden und unangemessen Affinität für Ca 2+ Konzentrationen, die in den Mitochondrien von dem niedrigen Niveau uM sogar zum mM Ebene ändern können. Die Verwendung von Ca 2+ Sonden der Basis von Proteinen, wie zum Beispiel Aequorin, gestattete es dem Targeting subzellulären Organellen und die Verwendung von Derivaten unterschiedlichen Ca 2+ mit unterschiedlichen Affinitäten Coelenterazine oder mutierte Sonden fehlt spezifischen Ca 2+ Bindungsstellen 15. Auf diese Weise können Biolumineszenz-Bildgebung von Zellen Mitochondrien ziel Aequorin Expression der Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentrationen in einzelnen Neuronen zu ermöglichen. Doch kann dieses Verfahren erfordern die Verwendung von Photonenzählung Kameras oder CCD-Kameras für ultra Biolumineszenz-Bildgebung 16-18. Diese Methode kann neue Ergebnisse, die in mehr establ bestätigt werden sollteIshed Gehirnaltern Modelle wie zum Beispiel Gehirnschnitten von alten Tieren.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Culture Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS medium</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12 medium</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass coverslips</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4-well multidish plaques</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Petry dishes</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite ilumination system</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER fluorescence camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM photon counting CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 valve controller</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B heating system&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Anfälligkeit für Neuronen Zelltod zu Neurodegeneration und Ischämie verbunden sind außerordentlich im Alter von Gehirn erhöht, sondern Mechanismen verantwortlich sind schlecht bekannt. Exzitotoxizität, ein Verfahren angenommen, um Neuronenschaden durch beide Beleidigungen induzierte beizutragen, wird durch Aktivierung der Glutamat-Rezeptoren, Ca2 + -Einstrom und mitochondriale Ca 2+ Last fördert vermittelt. Eine wesentliche Änderung der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase kann Neuronenschäden in alten Nervenzellen begünstigen. Zur Untersuchung von Ca 2+ Umbau im Altern haben wir Live Cell Imaging in Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen, die in einigen Aspekten im Alter von Neuronen in vivo ähnlich verwendet. Zu diesem Zweck Hippocampus-Zellen sind, in erster Linie frisch aus neugeborenen Ratten-Hippocampus dispergiert und auf poli-D-Lysin beschichteten Deckgläser plattiert. Dann Kulturen werden in kontrollierten Medien für mehrere Tage aufbewahrt oder mehrere wochen zur Untersuchung von jung und alt Neuronen auf. Zweitens werden kultivierten Neuronen mit Fura2 verladen und nach Messungen des cytosolischen Ca 2+ -Konzentration mit digitalen Fluoreszenzverhältnis Bildgebung unterzogen. Drittens werden kultivierten Neuronen mit Plasmiden ein Tandem von geringer Affinität Aequorin und GFP zu Mitochondrien ziel transfiziert. Nach 24 Stunden wird Aequorin in Zellen mit Coelenterazin rekonstituiert und Neuronen zu Biolumineszenz-Bildgebung für die Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentration ausgesetzt. Dieses Drei-Schritt-Verfahren erlaubt die Überwachung der cytosolischen Ca 2+ und mitochondriale antwortet relevante Stimuli wie zum Beispiel die Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA und Vergleichen, ob diese und andere Ergebnisse werden durch Alterung beeinflußt. Dieses Verfahren kann neue Erkenntnisse darüber, wie Alterungs Einfluss zytosolischen und mitochondrialen Ca 2+ Antworten auf ausgewählte Stimuli sowie die Prüfung der ausgewählten Medikamente zur Verhinderung von Neuronenzelle gerichtet ergebenTod im altersbedingten Krankheiten.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Ca 2+ Umbau und die Effekte von NMDA auf cytosolische und mitochondriale beurteilen [Ca 2+] in gealterten Neuronen. 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens zum Isolieren und Kultivieren von hippocampalen Neuronen aus neugeborenen Ratten. Bevor Sie beginnen, müssen wir sterile, Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläser vorbereiten und suchen Sie sie in einem 4-Well-Platte. Dann werden neonatalen Ratten getötet und das Gehirn ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons at JoVE.com

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K Aufrufe.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

Serie: Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Biochemie

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Verhalten

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Entwicklungsbiologie

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video