Die Autoren danken Dan Firl, Chris Corbett und Jesse Denson, PhD. Die Finanzierung wurde von NIH NINDS R01 NS060765 SR vorgesehen, die P30 Cobre Pilotprogramm zur LJ und die Kindergesundheit Signature-Programm zu LJ an der Universität von New Mexico.

Institutional Care und Verwenden Ausschüsse an beiden Boston Kinderkrankenhaus und der Universität von New Mexico Health Sciences Center stimmten allen experimentellen Verfahren. HINWEIS: Vor Beginn des Verfahrens, Dichtung, Sterilisieren und Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten und OP-Abdeckungen. Darüber hinaus bereiten postoperative Medikamente in sterile Fläschchen einschließlich 0,125% bipivucaine und 0,1 mg / kg Buprenorphin. Auch bereiten das Lipopolysaccharid (LPS) Lösung steril: 0,04 mg / ml LPS (0111: B4) in steriler Kochsalzlösung mit verdünnter Evans blauen Farbstoff. 1. Anästhesie <ol><li> Induzieren Anästhesie in einem embryonalen Tag 18 (E18) schwangere Sprague Dawley Ratten mit einem Gemisch aus 3% Isofluran ausgeglichen 70% Stickstoff und 30% Sauerstoff. </li><li> Entfernen Ratte aus der Induktionskammer und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf drapiert chirurgische zirkulierende Wasser Decke bei 37 ° C eingestellt. Bringen Anästhesie Bugnase und reduzieren isoflurane Ebene, um 2%. </li><li> Augensalbe sanft gelten für jedes Auge zu Hornhaut Austrocknen zu verhindern. Während des Verfahrens kontinuierlich überwacht Temperatur, Atemfrequenz und die Herzfrequenz des Tieres. Mütterlichen Physiologie sollten während des gesamten Verfahrens stabil bleiben. </li></ol> 2. Surgical Prep und Scrub <ol><li> Mit Hilfe von kleinen Tierschermaschinen nehmen Sie das gesamte Haar in der unteren Bauchregion. Shave in einem rechteckigen Muster mit Sorgfalt zu vermeiden Nicking die Brustwarzen oder Erzeugung gestochen Hautausschlag, der irritierend sein kann für die künftige Pflege der lebend geborenen Welpen. </li><li> Bereiten Bauchhaut durch abwechselnde Anwendung von PVP-Jod und 70% Ethanol-Peeling mit sterilen Wattestäbchen. Wiederholen Sie den Peeling, dass PVP-Jod und 70% Ethanol jeweils angewendet 3x abwechselnd. Trocknen lassen. </li><li> Bestätigen Narkosetiefe über Abwesenheit von Zehen Prise Reflex. In Abwesenheit von Reflex und Reize, um Schmerzen zu reduzieren Isofluran Ebene bis 1%. </li><li> Mit einer sterilen Operationstücher,drapieren das Tier. Achten Sie darauf, die Vorhänge in einem geeigneten Winkel zu platzieren, so dass sie die Menge an Spülflüssigkeit absorbieren sie zwar nicht zu behindern den Blutfluss in die Gebärmutterhörner zu maximieren. </li></ol> 3. Bauch Laparotomie <ol><li> Mit einem Skalpell einen 3 cm Mittellinienschnitt in der vorbereiteten Bauchhaut. Stumpf sezieren die Hautschicht von der Bauchbinde mit einer Schere. Mit einer Pinzette und chirurgische Scheren, heben die Bauch Faszienschicht und einen Einschnitt der avaskulären Linea alba, um Zugriff auf die Bauchhöhle zu gewinnen. </li><li> Platzieren chirurgische Gaze an der Außenseite des Einschnittes und befeuchten mit steriler Kochsalzlösung. Verwendung stumpfen Pinzette und externe Druck auf den Bauch, entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner aus der Bauchhöhle und vereinbaren auf der befeuchteten Gaze. </li><li> Verschränkung sorgfältig zu vermeiden und mit Darm zu kontaktieren. Vereinbaren Föten mit einer Pinzette, indem Sie nur das Muskelgewebe in zwischen einzelnen Fruchtblasen.Aufzudecken und zu isolieren, die 4 Gebärmutterarterien mit stumpf. HINWEIS: Es muss darauf geachtet, um die Gebärmutterarterien sezieren werden. Umliegende Gewebe und Gefäße selbst sind sehr empfindlich. Schäden an mütterlichen Gefäßen kann zu Blutungen, und in schweren Fällen, fetalen und Müttersterblichkeit. </li></ol> 4. Platzierung von Aneurysmen Clips <ol><li> Legen Sie eine Ratte 30 G Aneurysmen-Clip auf jedem Gebärmutterarterie. Sicherzustellen Aufhören des Blutflusses, einschließlich proximaler und distaler Impulsen und Verdunkelung der Uteringefäße einschließlich einzelner Plazenten. Decken Sie die freiliegende Hörner und gesamte Operationsfeld mit Gaze und Bewässerung mit steriler Kochsalzlösung. Achten Sie darauf, um das Feld zu feucht mit Bewässerung etwa alle 10 min zu halten. </li><li> Nach 60 min, entfernen Sie die Gaze und Bewässerung das Feld. Stellen Sie sicher, dass die Gebärmutterhörner und Behälter ausreichend für eine erfolgreiche Clip Entfernung befeuchtet. Entfernen Sie vorsichtig jede Aneurysmen-Clip mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, Trauma des Schiffes und maint verursachenain Gewebeintegrität während der Entnahme. </li><li> Spülen Sie gründlich die Gebärmutterhörner und Feld, wobei darauf zu jede streunende Themen aus Gaze von den Fruchtblasen zu entfernen. </li></ol> 5. Die Injektion von Lipopolysaccharid in den Fruchtblasen <ol><li> An der Basis jedes einzelnen Fruchtblase, knapp vor die Plazentaplatte, injizieren 100 ul LPS (4 ug / EWG), verdünnt mit Evans-Blau-Farbstoff in den Fruchtwasser. Verwenden stumpfen Pinzette zu stabilisieren und zu drehen jeden Fruchtblase in einer optimalen Position für die Injektion. Verdünnter Evans blauen Farbstoff ist ein Kontrastmittel, die hilfreich bei der Bestätigung richtige Spritze Platzierung und Injektion ist. HINWEIS: Verwenden Sie nur eine ultrafeine 0,3 ml Insulinspritze mit aufgesetztem 8 mm 31 G-Nadel für die intraFrucht Injektionen. Verwendung größerer Gauge-Nadeln wird bei chronischen Fruchtwasserverlust, fetalen Tod und Wiederaufnahme von der Schwangerschaft führen. Geringe Mengen an Fruchtwasser Leckage beim Entfernen der Spritze kann mitig seinated durch direkten Druck auf die Fruchtblase. Einige Rattenföten in gewissen Maße eine Oligohydramnion tolerieren. Allerdings akuten Fruchtwasserverlust durch Punktion mit großem Gauge-Nadeln, oder versehentliche Punktion mit nachfolgender chronischer Flüssigkeitsaustritt führt zu Fehlgeburten und in schweren Fällen, Verlust des Nachbar Schwangerschaften. </li><li> Spülen Sie die Gebärmutterhörner 3x mit steriler Kochsalzlösung. </li></ol> 6. Schließen der Laparotomie <ol><li> Mit Hilfe einer Pinzette, die Gebärmutterhörner sorgfältig in die Bauchhöhle zurück. Sicherstellung einer angemessenen Raum zwischen den Fruchtblasen und der Mittellinienschnitt, Wieder annähernd den musculofascial Schicht Kanten mit Hilfe eines Lauf 3-0 Seidennaht. Achten Sie auf die Platzierung der Fruchtblasen beim Schließen des Muskel Einschnitt. Seien Sie vorsichtig, um nicht in oder durch einen Sack nähen. </li><li> Re-nähern der Hautschicht, mit einem Lauf 3-0 Seidennaht, Schließen der Hautschicht. HINWEIS: Der Bauchschnitt sollte in zwei Schichten von kontinuierlichen Fäden, damit geschlossen werdenfür Haut und Muskel-Expansion mit zunehmender Trächtigkeit. Kontinuierliche Nähte ermöglichen gleichmäßig verteilt Wunde Spannung. Nähten sind weniger erwünscht als mehrere Knoten sind irritierend und kann leicht mit der Ratte nach der Genesung von Anästhesie gekaut werden. Chirurgischen Klammern sind nicht erwünscht. Schwänze der chirurgischen Knoten sollte sehr kurz (&lt;3 mm) geschnitten werden. </li><li> Injizieren Sie 1 ml 0,125% Bupivacain subkutan rund Wundränder mit einer 26 G-Nadel. Eine Dosis von 0,1 mg / kg Buprenorphin subkutan im Nacken. </li><li> Schalten Sie Isofluran und abtrocknen Ratte nach Bedarf. Legen Sie in einem sauberen Käfig und Überwachung aus der Narkose. Stellen Sie sicher, Ratte nicht unterkühlt zu werden. </li></ol> 7. postoperative Erholung und Pflege <ol><li> Überwachen Sie die Ratten alle 8-12 h für 72 Stunden und dann täglich bis Jungtiere geboren werden (ungefähr E22 oder E23). Verabreichen zusätzlichen Dosen von Buprenorphin q8-12 h / 72 h oder prn wie vom IACUC diktiert. </li><li> Überwachen Ratten Anzeichen von Schmerzen, Beschwerden, Blutungen aus der Scheide oder Blutungen von der Operationsstelle. Untersuchen Sie die Nähte und Schnittführung und darauf achten, Ratte ist nicht kauen oder Entfernen von ihren Nähten vorzeitig. Obwohl außerordentlich selten, Ratten, die ihre Nähte Kompromiss mit einem Risiko für Wunddehiszenz. HINWEIS: Gelegentlich Ratten können übermäßige Mengen von Bettzeug oder Non-Food-Produkte einnehmen, genannt pica, als Nebenwirkung von Buprenorphin Verwaltung. Obwohl sehr selten, müssen Ratten pica und mögliche anschließende Darmverschluss überwacht werden. </li></ol> 8. Gewebeverarbeitung und Kryoschneiden <ol><li> Um Hematoxylin &amp; Eosin (H &amp; E) Färbung der postnatalen Gehirn vorzubereiten, Jungtiere von ihren eigenen Käfig zu entfernen am postnatalen Tag 2 (P2). Verwendung chirurgische Scheren enthaupten Rattenjungen und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel. </li><li> Drop fix Gehirn in einem konischen 15 ml-Röhrchen mit 7 ml 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung(PBS). Zeigen Gehirn bei 4 ° C und 72 Stunden zu beheben. </li><li> Nach 72 Stunden, Transfer Gehirn in ein steriles PBS-Lösung, die 30% Saccharose (w / v) und zum 4 ° C. HINWEIS: Sobald Gehirn fallen in der Saccharose-Lösung sie bereit sind, auf einem Kryostat geschnitten werden sollen. </li><li> Schnell einfrieren Gehirne und Montage auf Kryostaten Stampfe für Übernahme von gefrorenen Koronalschnitte. Cut 20 um gefrorene Koronalschnitte und montieren Sie auf Objektträger. Stellen Sie sicher, Abschnitte seriell gesammelt. </li><li> Die Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht trocknen. Objektträger bei 20 ° C. </li></ol> 9. Hematoxylin &amp; Eosin-Färbung <ol><li> Nehmen Schlitten montiert Gefrierschnitten und auf Raumtemperatur erwärmt. HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen frisch. </li><li> Die Objektträger auf einer Folie wärmeren Satz bis 50 ° C für 2 Stunden. </li><li> Objektträger auf eine Färbung Rack. Dip Slides 10x in doppelt destilliertem entionisiertem Wasser (ddH 2 O). </li><li> Objektträger in 100% Hämatoxylin Inkubation für 5 min. Timich in Hämatoxylin kann je nach Grad der lila Färbung optimiert werden. </li><li> Dip Slides 4x in Leitungs H 2 O, und stehen lassen in sauberem Leitungs H 2 O für 1 min. </li><li> Die Objektträger 15x in saurem Alkohol (250 ml 70% igem Ethanol + 1 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure). </li><li> Dip Slides 4x in Leitungs H 2 O, und stehen lassen in sauberem Leitungs H 2 O für 1 min. </li><li> Inkubieren in 1% Lithiumkarbonat für 2 min. </li><li> Dip Slides 4x in Leitungs H 2 O, und stehen lassen in sauberem Leitungs H 2 O für 1 min. </li><li> Inkubieren in 95% Ethanol für 1 min. </li><li> Dip Slides 7x in 100% Eosin. Anzahl der Einbrüche in Eosin kann je nach Grad der rosa Färbung geändert werden. </li><li> Dip Slides 5x in 95% Ethanol. </li><li> Dip Schiebe 5x in einem frischen Wechsel 95% Ethanol. </li><li> Objektträger in 100% Ethanol nach 1 min. </li><li> Die Objektträger in eine frische Änderung von 100% Ethanol für 1 min. </li><li> Objektträger in 100% Xylol Proben für 15 min. HINWEIS: Xylol Schritte undEindecken sollte in einem Abzug erfolgen. </li><li> Inkubieren Objektträger in frischen Veränderungen Xylol für 15 min. </li><li> Deckglas mit Permount und trocknen lassen in Abzug. </li><li> Bildträger mit einem Lichtmikroskop. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Enzephalopathie bei Frühgeborenen ist schwierig, bei Tieren aufgrund der komplexen Zusammenspiel von Ursachen, neurologische Entwicklungszeit natürlich, Kompliziertheit der menschlichen Hirnnetzwerkbildung, überlappenden Mechanismen der Schädigung zu modellieren und die diversen Phänotypen von CNS beleidigt manifest in der menschlichen Frühgeborenen. EOP mit spezifischen Zelltyp Lücken zugeordnet (dh unreifen Oligodendrozyten) 21, sowie verschiedene entwicklungsregulierte Wege (dh Unt...

Mit über 12% der Kinder in den Vereinigten Staaten vor der 37. Woche geschätzt Gestationsalter 1 geboren, ist perinatalen Hirnschädigung (PBI) von Frühgeborenen eine wesentliche Ursache für bleibende Behinderung. PBI von Frühgeburten, die auch als Enzephalopathie praematurorum (EOP), wirkt das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS). ZNS-Verletzung oft beginnt in utero und durch vorgeburtliche Verfahren einschließlich chorioamnionitis und postnatalen Komplikationen wie Hypoxie und Sepsis verstärkt. PBI von systemischen Beleidigungen ändert Entwicklung des Nervensystems und führt zu Zerebralparese, Epilepsie, kognitive Verzögerung und zahlreichen neuropsychiatrischen Störungen, die emotionale Regulation, Gedächtnis und exekutive Funktion 1,2. Obwohl große Fortschritte erzielt wurden, bleibt, wie die zellulären und molekularen Folgen der ZNS-Verletzung von Frühgeburten zu übersetzen, um die Vielzahl der neurologischen Folgen bei Kindern, die Frühgeborenen geboren werden ein begrenztes Verständnis. Dieser Mangel an Wissen HinterInnen Echtzeit-Diagnose von ZNS-Verletzungsschwere und informierte Dosierung von Schwellen Interventionen. Zusätzlich altersgerechte therapeutische Strategien für diese gefährdete Patientengruppe bleibt schwer fassbar. Intrauterine Entzündung ist sehr häufig in extremen Frühgeburt und eine komplexe fetalen-mütterlichen Plazenta-Entzündungskaskade 3. Intrauterine Infektion oft subklinisch. Spezifische Plazenta Ergebnisse stehen im Einklang mit einer akuten Entzündung oder histologische Chorioamnionitis, sind entscheidend für den fetalen Entzündungsreaktion und fallen mit Hirnverletzung mit Frühgeburt 3-5 verbunden. Tatsächlich hat die fetale Entzündungsreaktion deutliche klinische Implikationen für die langfristigen Ergebnisse von Frühgeburten. Säuglinge, die klein für das Gestationsalter (SGA), der Erfahrung oder Infektion sind besonders anfällig für neurologische Defizite 3,4. Chorioamnionitis ist eine typische pathologische Diagnose folgenden Frühgeburt <sup&gt; 6,7, und die histologische Untersuchung zeigt Anzeichen einer Entzündung in 70% der Plazenten von Säuglingen sehr frühgeborenen 4 geboren. Ferner wird Chorioamnionitis mit kognitiven Beeinträchtigungen nach zwei Jahren 8 verbunden. Der Nachweis der mütterlichen Gefäßminder in der Plazenta von Säuglingen extrem Frühgeborenen geboren wird auch mit zerebraler Lähmung in der Kindheit 9 verbunden. Die synergistische Wirkung der Chorioamnionitis und Plazenta Perfusionsdefekte ist gut mit dem bemerkenswert hohen Risiko für abnorme neurologische Ergebnisse in dieser Patientengruppe bei zwei Jahren 10,11 dargestellt. Die menschliche systemische Plazentaperfusion Mängel und Chorioamnionitis mit pathogen-induzierten Entzündung zu imitieren, entwickelten wir ein Modell der pränatalen transiente systemische Hypoxie-Ischämie (TSHI) in Kombination mit intraFrucht Lipopolysaccharid (LPS) bei Ratten. Unser Ziel war es unser Modell der TSHI allein bei Ratten 12-16 Anpassung an intrauterine Entzündung sind,In den präklinischen Modellierung von ZNS-Verletzung mit Frühgeburt assoziiert zu erleichtern. TSHI allein hat anhaltende Verlust von Oligodendrozyten Linie Zellen, kortikalen Neuronen zeigte, erhöhte Zelltod und erhöhten proinflammatorische Zytokin Ebenen, mit fortschrittlichen ischämischen Intervalle, die zu einer abgestuften Verletzungsmuster im Einklang mit der pränatalen Hirnverletzung 16. Änderungen an den ischämischen Komponenten dieses Modells haben auch gezeigt, Defizite in der Speichercodierung, Kurz- und Langzeitgedächtnis und einem milden Muskel-Skelett-Veränderungen bei Ratten, wenn sie 17-19 altern. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass die Kombination von TSHI + LPS rekapituliert die pathophysiologischen Markenzeichen EoP, einschließlich Oligodendrozyten und Neuronenverlust, axonalen Schädigung, zelluläre Entzündung und Funktionsstörungen 20.

<table><tbody><tr><td>Saline Solution, 0.9%</td><td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>LPS 011B4</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>Evan&#039;s Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>Biogel</td><td>40870</td><td></td></tr><tr><td>OR Towels</td><td>Cardinal Health</td><td>287000-008</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>PDI Alcohol Prep Pads</td><td>Fisherbrand</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Rechargeable Clippers</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Betadine surgical scrub</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>Eye Lubricant</td><td>Refresh Lacri Lube</td><td>00023-0312</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-6808</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Needle</td><td>BD</td><td>305122</td><td>25G 5/8</td></tr><tr><td>Needle</td><td>BD</td><td>305128</td><td>30G 1</td></tr><tr><td>Cotton-tipped Applicators</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-114</td><td>Small, 6 inch sterile</td></tr><tr><td>Cotton Gauze Sponge</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holders</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>INS600109</td><td>12.5 CM STR</td></tr><tr><td>Vessel Clips</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>INS600120</td><td>30G Pressure</td></tr><tr><td>3-0 Perma Hand Silk Sutures</td><td>Ethicon</td><td>1684G</td><td>Black braided, 3-0 (2 metric), 18&quot;, non-absorbable,&amp;nbsp; PS-1 24 mm needle, 3/8 circle</td></tr><tr><td>Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>328438</td><td>0.3 cc 3 mm 31G</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lithium Carbonate</td><td>Acros Chemicals</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica</td><td>3801521</td><td>Surgipath Gill II Hematoxylin</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>Surgipath Eosin</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisherbrand</td><td>X3S-4</td><td>Histological Grade</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisherbrand</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-548-5P</td><td>Fisher Finest Premium Coverglass</td></tr></tbody></table>

modeling encephalopathy of prematurity using prenatal hypoxia-ischemia with intra-amniotic lipopolysaccharide in rats

Enzephalopathie bei Frühgeborenen (EOP) ist eine Bezeichnung, die das zentrale Nervensystem (ZNS) umfasst Anomalien mit Frühgeburt assoziiert. Um beste Voraus translationale Ziele und entdecken Sie neue therapeutische Strategien für Hirnverletzung mit Frühgeburt assoziiert, müssen präklinischen Modellen EoP ähnliche Mechanismen gehören der pränatalen globalen Verletzungen bei Menschen beobachtet und beinhalten mehrere Komponenten der mütterlichen Plazenta und Fötus-System. Im Idealfall sollten Modelle ein ähnliches Spektrum von funktionellen Defiziten in der reifen Tier zu produzieren und zu rekapitulieren mehrere Aspekte der Pathophysiologie. Die menschliche systemische Plazentaperfusion Fehler, Minder Plazenta und / oder Chorioamnionitis mit pathogen-induzierten Entzündung in der frühen Frühgeburt assoziiert imitieren, entwickelten wir ein Modell der pränatalen transiente systemische Hypoxie-Ischämie (TSHI) in Kombination mit intraFrucht Lipopolysaccharid (LPS). Bei trächtigen Sprague Dawley Ratten, TSHI über Gebärmutterarterien-Okklusionsvorrichtung on embryonalen Tag 18 (E18) induziert eine abgestufte Plazentaminder Defekt mit zunehmender ZNS-Schäden in den Fötus verbunden. Wenn bei innerFrucht LPS-Injektionen kombiniert wird Plazenta Entzündungen erhöht und ZNS-Schäden ist mit assoziierten weißen Substanz, Gang- und Abbildungs ​​Anomalien verschärft. Pränatale TSHI und TSHI + LPS pränatalen Beleidigungen treffen mehrere der Kriterien eines EoP Modell einschließlich rekapituliert die intrauterine Beleidigung, was zu Verlust von Neuronen, Oligodendrozyten und Axone, Verlust der Anschlussplatte und Funktionsdefizite bei erwachsenen Tieren, die denen bei Kindern extrem geboren beobachtet imitieren Früh. Darüber hinaus ermöglicht die Präparation der Entzündung, die durch divergierende Verletzungstypen induzierten dieses Modell.

Folgende TSHI + LPS bei E18, Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigt deutliche histopathologische Anomalien sowohl in der Plazenta (Figur 1) und im Gehirn (Figur 2). Plazenten auf E19 und E21 untersucht sind grob ödematösen mit Mikro-Blutungen und Nekrose der gesamten decidua und des Labyrinths. Signifikante Entzündungsinfiltrat und erhöhte Durchblutung wird auch beobachtet. Brains auf P2 sucht offenbaren Ventrikulomegalie sowie weißen Substanz und Anschlussplatte Verlust von Nervenz...

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Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

modeling-encephalopathy-prematurity-using-prenatal-hypoxia-ischemia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K Aufrufe.  University of New Mexico. Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Serie: Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

Die hypoxische ischämischen Enzephalopathie Model of Perinatal Ischämie

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Biologie

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Ein Ferkel Modell Neonatal hypoxischischämischer Enzephalopathie

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Medizin

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Neurobehavioral Bewertungen in einem Mausmodell der Neugeborenen hypoxisch-ischämische Hirnschädigung

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Einem Rattenmodell der milden Intrauterine Hypoperfusion mit Microcoil Stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

A Ferret Model of Inflammation-sensitized Late Preterm Hypoxic-ischemic Brain Injury

There is an ongoing need for clinically relevant models of perinatal infection and hypoxia-ischemia (HI) in which to test therapeutic interventions for infants with the neurological sequela of prematurity. Ferrets are ideal candidates for modeling the preterm human brain, as they are born lissencephalic and develop gyrencephalic brains postnatally. At birth, ferret brain development is similar to a 13 week human fetus, with postnatal-day (P) 17 kits considered to be equivalent to an infant at 32&#8211;36 weeks&#39; gestation. We describe an injury model in the P17 ferret, where lipopolysaccharide administration is followed by bilateral cerebral ischemia, hypoxia, and hyperoxia. This simulates the complex interaction of prolonged inflammation, ischemia, hypoxia, and oxidative stress experienced in a number of neonates who develop brain injury. Injured animals display a range of gross injury severity, with morphological changes in the brain including narrowing of multiple cortical gyri and associated sulci. Injured animals also show slowed reflex development, slower and more variable speed of locomotion in an automated catwalk, and decreased exploration in an open field. This model provides a platform in which to test putative therapies for infants with neonatal encephalopathy associated with inflammation and HI, study mechanisms of injury that affect cortical development, and investigate pathways that provide resilience in unaffected animals.

The method describes inflammation-sensitized hypoxic-ischemic and hyperoxic brain injury in the P17 ferret to model the complex interaction between prolonged inflammation and oxidative brain injury experienced in a number of late preterm infants.

Ein Frettchenmodell einer entzündungssensibilisierten spätpräfristifernen hypoxischen-ischämischen Hirnverletzung

There is an ongoing need for clinically relevant models of perinatal infection and hypoxia-ischemia (HI) in which to test therapeutic interventions for ...

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and lifelong neurological deficits. While PHH can be treated by temporary and permanent cerebrospinal fluid (CSF) diversion procedures (ventricular reservoir and ventriculoperitoneal shunt, respectively), there are no pharmacological strategies to prevent or treat IVH-induced brain injury and hydrocephalus. Animal models are needed to better understand the pathophysiology of IVH and test pharmacological treatments. While there are existing models of neonatal IVH, those that reliably result in hydrocephalus are often limited by the necessity for large-volume injections, which may complicate modeling of the pathology or introduce variability in the clinical phenotype observed.
Recent clinical studies have implicated hemoglobin and ferritin in causing ventricular enlargement after IVH. Here, we develop a straightforward animal model that mimics the clinical phenotype of PHH utilizing small-volume intraventricular injections of the blood breakdown product hemoglobin. In addition to reliably inducing ventricular enlargement and hydrocephalus, this model results in white matter injury, inflammation, and immune cell infiltration in periventricular and white matter regions. This paper describes this clinically relevant, simple method for modeling IVH-PHH in neonatal rats using intraventricular injection and presents methods for quantifying ventricle size post injection.

We present a model of neonatal intraventricular hemorrhage using rat pups that mimics the pathology seen in humans.

Modellierung neonataler intraventrikulärer Blutungen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Early Pathological and Magnetic Resonance Detection of Cerebral Injury Using a Rat Model of Neonatal Hypoxic Ischemic Encephalopathy

Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is an acute disease that may afflict newborns, resulting in variable long- and short-term neurodevelopmental outcomes. Early diagnosis is critical to identifying infants who may benefit from intervention; however, early diagnosis relies heavily on clinical criteria. No molecular or radiological tests have shown promise in detecting early cerebral injury. Studies have shown that magnetic resonance imaging (MRI) can show changes in both blood flow/ischemia and metabolic disruption. However, they have all been used to evaluate the secondary phase of the disease (&gt;12 h) after the onset of the injury. Early diagnosis is critical to rapidly starting therapeutic hypothermia in eligible infants, which is currently recommended to be initiated within 6 h of birth. The rat model of hypoxic-ischemic injury was developed in 1981 and has been validated and used extensively to study changes in brain perfusion, cerebral injury markers, and morphology. However, it has primarily been used as a "late model", evaluating injury several days after the initial ischemic insult. The model has been known to have poor sensitivity in evaluating reliable and reproducible early cerebral changes. The objective of this study was to develop a reliable model to study early gross morphological and radiological markers of HIE using pathological staining and cerebral magnetic resonance imaging/magnetic resonance spectroscopy.

The present protocol describes a rodent model of newborn hypoxic-ischemic injury for identifying early changes in cerebral tissue by gross morphology and magnetic resonance imaging. This has benefits over existing models, which can be used to study late injury but do not allow the evaluation of reproducible early changes.

Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is an acute disease that may afflict newborns, resulting in variable long- and short-term ...

Modeling Posthemorrhagic Hydrocephalus of Prematurity in Rats

Posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity (PHHP) is a serious sequela of severe intraventricular hemorrhage (IVH) in very preterm infants less than 32 weeks gestational age (GA). PHHP is defined by the accumulation of cerebrospinal fluid (CSF) associated with clinical symptoms of elevated intracranial pressure (ICP). Infants with PHHP suffer lifelong shunt dependence, with half requiring repeat surgery in the first year of life and many requiring multiple additional surgeries throughout the lifespan. Prenatal chorioamnionitis predisposes preterm infants to severe IVH and the need for surgical treatment of PHHP trends with neonatal sepsis. These clinical features suggest that systemic inflammation is an integral component of PHHP pathophysiology. 
Here, we define an animal model that recapitulates all clinical aspects and essential features of PHHP in rats. The goal of this protocol is to illustrate how in utero chorioamnionitis and postnatal IVH using lysed red blood cells can be combined to yield PHHP. This preclinical approach yields progressive macrocephaly and domed craniums, elevated intracranial pressure, and ventriculomegaly that can be detected via magnetic resonance imaging (MRI) or via microscopy. In addition to sustained disruption in CSF dynamics, rats also have cognitive delay and functional disability into adulthood. Accordingly, this preclinical platform facilitates unique and unparalleled translational studies of PHHP that can incorporate molecular, cellular, biochemical, histologic, imaging, and functional outcome measures. It can also be used for rigorous analysis of the choroid plexus, ependymal motile cilia, and glymphatic system in parallel. Last, it can also be an invaluable preclinical tool for the investigation of novel surgical intervention strategies and non-surgical therapeutic approaches for the treatment of hydrocephalus.

Posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity (PHHP) can be modeled in neonatal rats by combining chorioamnionitis and intraventricular hemorrhage. The combination of these prenatal and postnatal events accurately recapitulates the clinical hallmarks of PHHP, including macrocephaly, ventriculomegaly, and elevated intracranial pressure, through the lifespan.

Modellierung des posthämorrhagischen Hydrozephalus der Frühgeburt bei Ratten

Posthemorrhagic hydrocephalus of prematurity (PHHP) is a serious sequela of severe intraventricular hemorrhage (IVH) in very preterm infants less than 32 ...

Induction of Cerebral Microhemorrhages in a Rat Model Using Lipopolysaccharide

Source: Li, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58423">Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of inducing blood-brain barrier (BBB) disruption and cerebral microhemorrhages in a rat model using lipopolysaccharide (LPS). It highlights the sequence of immune responses that lead to increased BBB permeability and subsequent brain tissue damage.

Induktion von zerebralen Mikroblutungen in einem Rattenmodell mit Lipopolysaccharid

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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