Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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Die Autoren danken dem INRA MIMA2 Imaging Core Facility (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) und an die Mitarbeiter des IERP Einheit (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) für die Tierpflege und Einrichtungen. Wir möchten auch IH Mather, MC Neville und S. Tooze für die Bereitstellung sehr nützlich antibodie danken.

CD1-Mäusen wurden bei INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Frankreich) gezüchtet. Alle ethischen Aspekte der Tierpflege mit den einschlägigen Richtlinien und Zulassungsanforderungen, die von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft gelegt eingehalten werden. Die verwendeten Verfahren wurden von der Ethikkommission (Vereinbarung 12/097 vom Comethea Jouy-en-Josas / Agroparistech) zugelassen. 1. Milchdrüse Probenvorbereitung <ol><li> Maus-Brustdrüse Dissektion <ol><li> Euthanize Mäusen am Tag 10 der Laktation durch Genickbruch und stecken Sie das Tier zu mit seinen Unterleib nach oben zeigt. </li><li> Befeuchten Sie die Bauchbereich mit Ethanol und trocknen Sie es mit einem Papiertuch. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut zwischen den beiden Hinterbeinen und einen Einschnitt (nur durch die Haut) von etwa 1 cm mit einer scharfen Schere. Ausgehend von diesem ersten Schnitt, dann mit einer Schere, um die Haut bis zum Hals auf der Maus zu schneiden. Ziehen Sie die Haut von dem Bauchfell und pin auf der einen Seite der Haut zu einer Zeit, Stretching gelehrt. </li><li> Sammeln Sie die Bauch- und Leistenbrustdrüsen, indem Sie sie von der Haut mit einem Tupfer und schließlich Ziehen oder Schneiden sie weg von dem Bauchfell. Anmerkung: In diesem Schritt Carmine Färbung kann, um das Brustepithel innerhalb der gesamten Drüse 43 visualisieren geführt werden. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die globale Morphologie der Brustdrüse unter verschiedenen Bedingungen (physiologische Entwicklungsstadien, Krankheiten in vivo Behandlungen) analysieren. </li><li> Entfernen der Lymphknoten an der Verbindungsstelle der Bauch- und Inguinaldrüsen 44 angeordnet. </li></ol></li><li> Brustgewebefixierung <ol><li> Schneiden das Brustgewebe in 3 mm 3 Fragmente mit einem Skalpell und unmittelbar spülen diese Fragmente in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), pH 7,4, um so viel Milch wie möglich zu entfernen. </li><li> Schnell trocknen die Fragmente auf einem PapierHandtuch und legte sie in einem kalten PBS-Lösung, die 4% Paraformaldehyd (PFA, HCHO, 32% Formaldehydlösung, VORSICHT) für 10 bis 15 Minuten auf Eis. Hinweis: Dies ist genug Zeit, um die nachfolgende Analyse auf Brustgewebeschnitt durch IIF36 und / oder in situ Hybridisierung 45 zu ermöglichen. Jedoch, wie Aldehyd-Fixierungsmittel eindringen eher langsam in Gewebestücke (~ 1-3 mm pro Stunde), kann diese Zeit verlängert werden, um eine optimale Fixierung der Gewebeprobe zu gewährleisten. Alternativ zu beheben Geweben in vivo durch Perfusion eines betäubten Tier mit einem Fixierungslösung (nicht in der vorliegenden Studie beschrieben). </li></ol></li><li> Saccharose Infusions <ol><li> Schnell Spülen der Milch Fragmente in kaltem PBS und tauche sie in kalte PBS-Lösung, enthaltend 40% Sucrose (D-Saccharose, C12H22O11, Mr 342,3 g / mol) für 16 bis 48 h bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li></ol></li><li> Gewebeeinbettung Hinweis: Bei diesem Schritt Brust Fragmente können, um kleinere Fragmente (2-3 mm 3 zu machen erneut geschnitten werden) Oder ihre Form ändern. <ol><li> Richtig beschriften Sie die Kunststoffformen und füllen ein Drittel des Volumens der Form mit OCT-Verbindung, bei RT gehalten. Legen Sie ein Fragment (2-3 mm 3) von Brustgewebe pro Form und decken Sie es mit OCT-Verbindung. </li><li> Platzieren der Formen an der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs (auf einer Platte aus Aluminium oder mit einem metallischen Sieb) und damit das Produkt einfriert. Hinweis: Es muss fest und weiß vor dem Eintauchen der Form in flüssigem Stickstoff zu werden. </li></ol></li><li> Bewahren Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C, bis Gewebeschnitten durchgeführt. </li></ol> 2. Gefrorene Gewebe Sectioning Anmerkung: einen Kryostaten, der im wesentlichen ein Mikrotom in einer Kühltruhe, ist erforderlich, um gefrorene Gewebesektionen vorzunehmen. Eine niedrigere Temperatur wird oft für Fett oder lipidreiche Gewebe wie natives Brustdrüse erforderlich. <ol><li> Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -26 ° C und warten, bis es hat Stabisiert. Pflegen Sie die gefrorenen Gewebeblock bei -26 ° C über den gesamten Schneideverfahren. Absolut zu vermeiden Auftauen des Gewebes zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens. </li><li> Kühlen Sie die Rasierklinge, die Schneidunterlage, die Wankstützeinrichtung und die Bürste bis -26 ° C, indem sie in den Kryostaten für mindestens 10 min. Außerdem legen Sie eine Dia-Box im Inneren des Kryostaten, um in der Lage, Glasobjektträger zu speichern, wie die Schnitte gemacht werden können. </li><li> Richtig beschriften Sie die Glasobjektträger, die verwendet werden, um die Gewebeschnitte bei RT sammeln und diese beibehalten werden; sonst Gewebeschnitte werden nicht an sie halten. Entfernen Sie die Probe aus der Form im Inneren des Kryostaten. Hinweis: Die Verwendung positiv geladenen Objektträgern wird die Haftung der frische Gefrierschnitte stark begünstigt durch höhere elektrostatische Anziehung. </li><li> Decken Sie die Oberfläche eines Metallgewebescheibe mit OCT-Verbindung (bei RT gehalten) und drücken Sie die gefrorene Probe darauf. Platzieren Sie das nasse Halterung im Inneren des Kryostaten und lassen Sie es cool mindestens 15 min. </li><li> Setzen Sie den nassen Halterung in den Plattenhalter des Kryostaten. Stellen Sie die Schnittdicke von 5-6 &amp; mgr; m und, wenn möglich, verwenden Sie eine neue scharfe Klinge oder zumindest ändern Sie den Bereich auf der Klinge verwendet, um jede Probe, da einige Gewebe werden schnell langweilig schneiden. </li><li> Einstellen der Position der Wankstützeinrichtung über den Rasierklingen indem Schnitte der Befestigungsmedium, bis die Scheiben gleichmßig und korrekt gebildet wird. Idealerweise wird die Wankstützeinrichtung über der Rasierklinge um etwa 1 mm treten. </li><li> Wenn die Einstellungen korrekt sind, führen Gewebeschnitte durch Drehen des Rades in einem kontinuierlichen gleichförmigen Bewegung. Es sei denn, die Temperatur ist ideal, ein Gewebeschnitt wird, von der Natur, versuchen Sie, machen Sie es sich. <ol><li> Verwenden Sie eine Bürste, um zu packen und zu manövrieren im Abschnitt über die Bühne, um sie zu legen, wie auf dem Objektträger gewünscht. Verwenden Sie den Pinsel zu bereinigen die Reste gegebenenfalls auf der gefrorenen Gewebeblock und / oder der Rasierklinge vorhanden. </li></ol></li><li> ziehender Gewebeschnitt in Richtung des Benutzers und zur Vermeidung von Eindrücken auf den Kryostaten Bühne. Nicht auf die Gewebeabschnitt auf den Kryostaten Stadium, da es zu der Adhäsion der Gewebescheibe auf der Bühne und damit die Unfähigkeit, mit dem Glasträger wiederherzustellen führen. </li><li> Abrufen Gewebeschnitte einzeln durch abholen an der Oberfläche eines Glasobjektträger, indem Sie sie über dem Bereich und Angel es nach unten, um den Gewebeschnitt zu berühren. Hinweis: Die Gewebeschnitte schnell auf die warme Glas haften durch statische Anziehungskraft. Wenn mehrere Gewebeschnitte werden auf demselben Objektträger gelegt, darauf achten, sie nicht zu überlappen und um Platz zu ihnen genug, um einzeln schließen Sie sie in einem hydrophoben Kreis sein (siehe Abschnitt 3.1.1.). </li></ol> 3. Die indirekte Immunfluoreszenz <ol><li> Lokalisierung Abschnitten <ol><li> Verwenden Sie eine hydrophobe Sperrstift, um eine hydrophobe Kreis um Objektträger angebrachten Gewebe ziehen. Lassen Sie den Kreis trocken für ca. 1 min bei RT. Zeichnen Sie eine Linie um die tThema Abschnitte mit einem feinen schwarzen Filzstift als gut, aber auf der Seite der Glasobjektträger gegenüber der einen, wo die Gewebeschnitte sind. Hinweis: Dieser Kreis ist wasserabweisend und Aceton und Alkohol unlöslich. Es ist daher ein Hindernis für die während der IHC Verfahren verwendeten wässrigen Lösungen und verringert das Volumen der erforderlichen Reagenzien. </li><li> Rehydrieren Gewebeschnitte von ihnen bedeckt mit einem Tropfen von ~ 250 &amp; mgr; l PBS für ein paar Minuten bei RT. Fix Gewebeschnitte von ihnen Abdecken mit ~ 250 &amp; mgr; l einer frisch hergestellten 3% PFA-Lösung in PBS für 10 bis 15 min. Hinweis: Wahlweise in diesem Fall verwenden Sie einen Aldehyd Abschrecken Lösung (50 mM Ammoniumchlorid (NH 4 Cl, Herr 53,5 g / mol) in PBS oder 0,1 M Glycin (C 2 H 5 NO 2, Mr 75,07 g / mol) in PBS ), um die Fixierungsreaktion zu stoppen. Einfache und reichlich PBS waschen ist in der Regel ausreichend, um nicht umgesetzte Aldehyd zu entfernen. </li></ol></li><li> Antigen-Retrieval (optional) <br/&gt; Anmerkung: Während die meisten Antigene können ohne Antigen Retrieval (AR) nachgewiesen werden, andere werden nur dann beobachtet, wenn dieser Schritt durchgeführt werden. In einigen Fällen ermöglicht AR auch die Verbesserung des beobachteten Signals. <ol><li> Legen Sie das AR-Lösung (100 mM Tris (C 4 H 11 NO 3, Herr 121,14) 5% Harnstoff (NH 2 CONH 2, Mr 60,06) pH 9,6) in einem Becherglas. Das Volumen der AR-Lösung muss ausreichen, um die Glasobjektträger in einem Glashalter platziert vollständig zu decken. </li><li> Heizen Sie den AR-Lösung auf 95 ° C durch die Überwachung der Temperatur mit einem Thermometer und dann die Glasobjektträger auf einem geeigneten Gestell, tauchen Sie das Rack in der heißen Puffer, Abdeckung, um Verdunstung zu begrenzen und Inkubation für 10 min bei 95 ° C. </li><li> Das Becherglas aus dem Wasserbad und lassen Sie die Glasobjektträger weitere 10 Minuten im Puffer. </li></ol></li><li> Immundetektion <ol><li> Spülen Gewebeschnitte mit PBS (~ 250 &amp; mgr; l / Schnitt) und sättigen sie mit einer Lösungvon 3% Rinderserumalbumin (BSA, ~ 250 &amp; mgr; l / Schnitt) in PBS für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Gesetzt 30-50 ul des primären Antikörpers in PBS mit 2% BSA für jedes Gewebeschnitt verdünnt. Anmerkung: Dieser Band ist genug, um einen Tropfen, der den Gewebeschnitt vollständig bedeckt. </li><li> Stellen das gleiche Volumen des Verdünnungsmittels (2% BSA in PBS) alleine auf einem Gewebeschnitt, eine negative Kontrolle ohne primären Antikörper durchzuführen. <ol><li> Systematisch, um diesen Negativkontrolle in jedem IHC Experiment und führen für jeden sekundären Antikörper verwendet, um den Hintergrund des Experiments abzuschätzen (nicht-spezifische Markierung aufgrund des sekundären Antikörpers und / oder der Gewebeautofluoreszenz). Andere Arten von positiven oder negativen Kontrollen kann auch durchgeführt werden, um die Spezifität der Markierung zu gewährleisten (siehe Diskussion). </li></ol></li><li> Legen Sie die Glasobjektträger in einer feuchten Box O / N bei 4 ° C. Hinweis: Primäre Antikörper waren monoklonale Maus-Anti-Cytokeratin8 (CK8, Verdünnung 1:50), monoklonalen Maus-anti-Cytokeratin 14 (CK14, Verdünnung 1:50), polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Casein (# 7781, Verdünnung 1:50, großzügig von MC Neville, University of Colorado Health bereitgestellt Sciences Center, CO, USA), polyklonalen Kaninchen-anti-btn1 (1: 300 Verdünnung, großzügig von IH Mather, Abteilung Tier und Avian Sciences, University of Maryland, College Park, MD, USA), polyklonalen Kaninchen-anti-Stx6 (bereitgestellt Verdünnung 1:50, großzügig von S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, London, Großbritannien) und polyklonalen Kaninchen-anti-VAMP4 (1:50 Verdünnung) zur Verfügung gestellt. </li><li> Gründlich Gewebeschnitte mit PBS mindestens viermal für 10 min bei RT. </li><li> Verdünne den geeigneten sekundären Antikörper (Rhodamin-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), 1: 300 Verdünnung) in PBS, enthaltend 2% BSA, legen 30-50 ul dieser Lösung auf allen Gewebeschnitten, und Inkubation für 1,5 h bei RT. <ol><li> Seit Fluorochrome sind lichtempfindliche Moleküle, nichtaussetzen Gewebeschnitte, um Licht bis zu ihrer Analyse. Für IIF an Gewebeschnitten, begünstigen Sekundärantikörper auf einem roten Fluorophor gekoppelt seit Zellmembranen sind in der Regel eine grüne Autofluoreszenz, die mit geringer Kennzeichnungs stören können generieren. Außerdem die Wahl eines roten Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte sekundäre Antikörper ermöglicht die gleichzeitige Markierung von neutralen Lipiden (siehe unten). </li></ol></li><li> Gründlich die Gewebeschnitte mit PBS mindestens viermal waschen für 10 min bei RT. </li></ol></li><li> Postfixierung (optional) <ol><li> Für einige Experimente durchzuführen Postfixierung durch Inkubation der Proben mit 2% PFA in PBS für 10 min bei RT, verdünnt, um die Antigen / Antikörper-Gerüste zu stabilisieren. Allerdings kann dieser Schritt in den meisten Fällen verzichtet werden. </li></ol></li><li> Neutralen Lipiden und DNA-Gegenfärbung <ol><li> Um CLDs und MFG, Farbe neutralen Lipiden durch Inkubation von Gewebeschnitten in 30-50 ul einer PBS-Lösung, enthaltend 3 ug / ml des Bodipy 493 visualisieren/ 503 10 min bei RT. Schnell Gewebeschnitte zweimal mit PBS spülen. </li><li> Gegenfärbemittel nuklearen DNA mit 30-50 ul einer PBS-Lösung, die 3 uM DAPI (4-6-Diamidino-2-phenylindol, 5 mg / ml Stammlösung) 10 min bei RT. Die Gewebeschnitte vor der Montage der Folien für die Beobachtung zweimal mit PBS waschen. </li></ol></li><li> Abschnitt Montage <ol><li> Entfernen PBS und setzen Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf jedem Gewebeschnitt. </li><li> Legen Sie eine Seite des Deckglases in einem Winkel gegen den Schieber, den Kontakt mit der Außenkante der Flüssigkeitstropfen und senken Sie dann langsam den Deckel, Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Flüssigkeit zwischen dem Objektträger und Deckglas für ein paar Minuten zu verbreiten und dann entfernen Sie das überschüssige Eindeckmedium mit einem Papiertuch. </li><li> Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack und speichern Gewebeschnitte bei 4 ° C auf ihre Belichtung bis Beobachtungs verhindern. </li></ol></li></ol>4. Fluoreszenzbeobachtung und Image Acquisition Hinweis: Ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Kamera durch eine Bildaufnahme-Software gesteuert wird, erforderlich, um die Ergebnisse zu beobachten IHC ausgestattet. <ol><li> Vor der Erfassung von Bildern, überprüfen Sie die Intensität der Kennzeichnung und Bewertung der Hintergrund des Experiments, indem man die negativen Kontrollen. Erwerben Sie Bilder von jedem Fluoreszenzmarkierung (Farbkanal) einzeln. </li><li> Erwerben Sie alle Bilder, auch die der entsprechenden Kontrollen bei den gleichen Bedingungen (Belichtung und allgemeine Einstellungen) für jeden Farbkanal. </li><li> Konventionelle Mikroskopie <ol><li> Führen Epifluoreszenzmikroskopie mit einem Mikroskop mit Standard-Filter für Fluoresceinisothiocyanat (FITC, grün), Rhodamin (rot) und DAPI (blau) Emissionen ausgestattet, × 20-63 (Öl-Immersion, NA 1.3) Ziele und eine DP50 Bildkamera ×. </li></ol></li><li> Konfokale Mikroskopie </li><li> Führen konfokale Mikroskopie mit microsBewältigung der ZEN-Software ausgestattet, mit × 20-63 (Öl-Immersion, NA 1.4) Ziele und die 488- und 568-nm-Anregungswellenlängen des Laser ×. </li></ol> 5. Bild Behandlung Hinweis: Alle Bild Nachbehandlungen werden mit dem ImageJ freie Software (http://imagej.nih.gov/ij/) durchgeführt. <ol><li> Bild überlagern (Merge) <ol><li> Öffnen Sie die in jedem Kanal, die kombiniert werden (Datei / Öffnen) erfassten Bilder. Wenn die Arbeit mit 8-Bit-Graustufenbilder, Attribut künstliche Farbe, die jedem Kanal unter Verwendung der Nachschlagtabelle (Bild / Lookup Tables). </li><li> Generieren Sie das zusammengesetzte Bild von Graustufen- oder Farbbilder mit dem Befehl &quot;Zusammenführen Kanäle&quot; (Bild / Farbe / Merge-Kanäle) und dann Zuordnung einer Farbe zu jedem Kanal. </li><li> Führen Sie Bildstapeln Überlagerung auf die gleiche Weise durch Öffnen Stapel in jedem Kanal, die kombiniert werden sollen (Datei / Öffnen) erworben und mit dem Befehl &quot;Zusammenführen Kanäle &amp;# 8221; (Foto / Farbe / Merge-Kanäle), um eine Farbe für jeden Kanal zuzuordnen. Speichern Sie die Verbundstapel als Bildsequenz oder als Film (siehe Abschnitt 5.4). </li></ol></li><li> Bildstapel Z Projektions <ol><li> Verwenden Sie die Z-Projektionsfunktion (Bild / Stapeln / Zproject, Max Intensity), um eine zweidimensionale Darstellung aller Bilder eines Bildstapels durch Projektion entlang der Achse senkrecht zur Bildebene (z-Achse) zu liefern. Die Option &quot;Maximum Intensity&quot; erstellt ein Bild, in dem jedes Pixel den Maximalwert über alle Bilder im Stapel enthält. Dies erzeugt ein Einzelbild ermöglicht die Visualisierung des gesamten durch den ganzen Stapel für einen bestimmten Kanal oder nach der Überlagerung von mehreren Kanälen beobachtet Färbung. </li></ol></li><li> Bildstapel 3D-Projektion <ol><li> Verwenden Sie die 3D-Projektion-Befehl (Bild / Stapeln / 3D-Projekt, hellste Punkt, y-Achse), eine Folge von Projektionen eines rotierenden Volumen auf eine Ebene zu erzeugen. Die visuelle Darstellung der surfaces und internen Strukturen hängt sowohl von der Projektionsverfahren (nächste Punkt, hellste Punkt (verwendet) oder Mittelwert) und die Visualisierungsparameter ausgewählt. Jeder Rahmen des Animationssequenz ist das Ergebnis von einem anderen Betrachtungswinkel vorsteht. </li><li> Drehen Sie das erstellte 3D-Bild um jede der drei orthogonalen Achsen (hier wurde die y-Achse gewählt). Speichern Sie das als ein einzelnes Bild oder eine Filmsequenz hergestellt. </li></ol></li><li> Bildstapel, um Film Umwandlung <ol><li> Öffnen Sie ein Bild Stapel (Datei / Öffnen) und speichern Sie es als Film im AVI-Format mit dem Befehl &quot;AVI&quot; (Datei / Speichern unter / AVI). </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

IHC ist eine relativ einfache und direkte experimentelle Methode an Antigen in Gewebeschnitten, die in erster Linie auf spezifische Epitop-Antikörper-Wechselwirkungen abhängt lokalisieren. Obwohl eine große Anzahl von Protokollen verwendet werden, um ein Protein von IIF zu lokalisieren, ist der Kern dieser Verfahren fast immer gleich. Es gibt jedoch einige wichtige Aspekte, die einen starken Einfluss auf das Ergebnis und müssen daher für jede einzelne IHC Studie optimiert werden. Der schwierigste Aspekt dieses Ansa...

Die Brustdrüse ist ein atypisches Säugetier exokrinen Organ, dessen Hauptfunktion ist die Milch für Neugeborene zu ernähren. Die Entwicklung der Brustgewebe tritt vor allem nach der Geburt und wird durch ein einzigartiges Verfahren, in dem das Epithel dringt in die umgebenden Stroma ist. Dieses Gewebe viele Veränderungen (Wachstum, Differenzierung und Regression), insbesondere während des Erwachsenenlebens gleichzeitig mit Variationen in der Fortpflanzungszustand (Figur 1). Zusätzlich zu der Gesamtmorphologie des Gewebes, wobei die Anteile der verschiedenen Zelltypen sowie deren Anordnung innerhalb des Brustdrüsen dramatisch während der Entwicklung 1-5 ändern. Während des embryonalen Lebens leitet das Brustepithel von Brustmilchleitungen, die durch eine geringfügige Verdickung und Schichtung des Ektoderms definiert ist, zwischen den Vorder- und Hinterbeinen an jeder Seite der Mittellinie herum Embryonaltag 10,5 (E10,5) (1A ).Auf E11.5 bricht der Milchleitung in einzelne Plakoden, die symmetrisch entlang der Brustmilchleitung an reproduzierbaren Stellen positioniert werden, und die umgebende Mesenchym beginnt zu kondensieren. Die Plakoden beginnen, tiefer in die Dermis Waschbecken und die Brust Mesenchym organisiert in konzentrischen Schichten rund um die Brustknospe (E12.5-E14.5). Ab E15.5 die Brustepithel, beginnt sich zu vermehren und zu verlängern, um die primäre sprießen, die durch den Brust Mesenchym gegen die Fettpolster drückt bilden. Der primäre Spross entwickelt ein hohles Lumen mit einer Öffnung an der Haut, durch die Ausbildung des Nippels Hülle gekennzeichnet. Auf E18.5 hat die Verlängerung Kanal in die Fettpolster gewachsen und hat sich zu einem kleinen arborized Gangsystem in das Fettpolster umgeben verzweigt. Im Wesentlichen wird festgenommen und die rudimentäre Brustdrüsen bleibt morphogenetisch Ruhe bis zur Pubertät. Beim männlichen Embryo, die Aktivierung des Androgen-Rezeptoren führt zur Degeneration der Knospen, die verschwindenvon E15.5. Ab E18, hört bis zur Pubertät 6-9 Brustentwicklung. Bei der Geburt birgt die Brustdrüse ein rudimentäres Gangsystem, der und verlängert Niederlassungen langsam (isometrische Wachstum). Am Beginn der Pubertät, kugelförmige Gebilde an den Spitzen der Leitungen namens die terminalen Ende Knospen (TEBs), sind aus einer äußeren Schicht der Kappe Zellen und einer mehrschichtigen inneren Kern von Zellen (Körperzellen) gebildet. Diese Strukturen sind hoch proliferative und infiltrieren das umliegende Stroma-Gewebe als Reaktion auf hormonelle Signale. Proliferation innerhalb der TEBS Ergebnisse in duktalen Dehnung, mit Verzweigung Morphogenese gekoppelt. Dieser Prozess führt zur Einrichtung eines Grund epithelialen arborized Netzwerk von dem Nippel (1B Pubertät) ausgeht. Bei ~ 10-12 Wochen nach der Geburt, wenn das Epithel hat die ganze Fettpolster eingefallen, Haltestellen und die Expansion der TEBS verschwinden. Duktale Entwicklung durchläuft dann dynamischen Veränderungen, dh successive Proliferation und Regression von Epithelzellen nach Ovarialzyklen 10 (1B, Erwachsenen). Vom Beginn der Schwangerschaft durchläuft das Brustgewebe wichtigen Wachstums und morphologische Änderungen für die Stillzeit vorzubereiten. Das Brustepithel ausgiebig proliferieren und differenzieren, was zu einem hochverzweigten tubulo-alveolären Netzwerk. Begleitend Brustepithelzellen (MEC) polarisiert und in der Lage, synthetisieren und sezernieren Milchprodukte. MEC organisieren in zahlreiche alveolären Strukturen (Acini), die von kontraktilen Myoepithelzellen umgeben sind und in einem Stroma der Binde- und Fettgewebe, Blutgefäße und Nervenenden (1B, Schwangerschaft) zusammengesetzt eingebaut. Weiterhin wird die basale Seite des MEC in engem Kontakt mit der Basalmembran (extrazelluläre Matrix) und Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Einheiten eng regulieren sowohl die Morphogenese und sekretorische Funktion der Mammary Epithel 11-13. Alle diese Verfahren beruhen auf der Wirkung verschiedener Umweltsignale, von denen die wichtigsten sind hormones14, parakrine Faktoren und der extrazellulären Matrix. Zum Beispiel, Progesteron induziert umfangreiche Seitenverzweigung 15 und alveologenesis, dass in Kombination mit Prolaktin (PRL) 16,17 fördert und pflegt die Differenzierung der Lungenbläschen. Zusätzlich zu Steroiden und PRL18, Zytokine und Signalwege mit Entwicklung verbunden (Wnt und Notch Signalwege) sind ebenfalls in Brustlinie Engagement und Entwicklung 19-21 beteiligt. Am Ende der Schwangerschaft, beginnen die luminale MEC um eine proteinreiche Milch Kolostrum im Lumen der Alveolen bekannt herzustellen. Außerdem fungiert Progesteron auf den epithelialen Permeabilität und da die Tight Junctions sind noch offen ist Kolostrum auch in den mütterlichen Blutstrom gefunden. Nach der Geburt, die Mammary Epithel nimmt fast die gesamte Brustdrüsenvolumens und ist hoch organisierten (Abbildung 2, Brustepithel). Milch erzeugenden Einheiten, nämlich Alveolen (Abbildung 2, Alveole) werden von einer Monoschicht von polarisiertem Brustepithelzellen sekretorischen Zellen (MESCs) gebildet ist, mit ihren apikalen Plasmamembran, die das Lumen begrenzende. Alveolen ordnen sich in die Läppchen, die in Lappen, um Kanäle, die Milch an die Außenmilieu (Abbildung 2, Lappen) Drain gruppiert sind. Laktation auftritt, dh., MESCs beginnen reichliche Mengen von Milch, vor allem durch den Rückgang der Plazentahormone (hauptsächlich Progesteron) (1B, Laktation) ausgelöst absondern. Milchprotein-Gene sind in einer definierten zeitlichen zeitlichen Verlauf von Schwangerschaft Laktation 9,22,23 hauptsächlich in Reaktion auf Hypophysen PRL bei der Säugezeit Freigabe aktiviert. Begleitend Kontakte zwischen MESCs und der extrazellulären Matrix sowohl stimulieren Milchprotein synthesis durch Signale, die über die Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrinen und Laminin 24,25 vermittelt werden, und die Apoptose in MESCs 26,27 zu unterdrücken. Diese Signalwege führen zu der Aktivierung von Milchprotein-Genpromotoren 28 durch die Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren 29. Zell-Zell-Kontakte sind ebenfalls wichtig für einige Aspekte der Differenzierung einschließlich der Einrichtung apikalen Polarität und vektoriellen Sekretion von Milchprodukten. Tight Junctions stark nahe nach dem Beginn der Laktation und MESCs fein orchestriert die Aufnahme von Molekülen aus dem Blut sowie die Synthese, den Transport und die Sekretion von Milchbestandteilen, in Reaktion auf die Ernährungsbedürfnisse von Neugeborenen. Zum Zeitpunkt der Säugezeit erfolgt die Kontraktion der Myoepithelzellen umgibt die Alveolen als Reaktion auf Oxytocin und führt zu Milchejektion durch die Kanäle und in die Nippel. Milch ist ein komplexes Fluid, das Proteine ​​enthält (hauptsächlichCaseine), Zucker (hauptsächlich Lactose), Lipiden und Mineralien sowie bioaktiven Molekülen, wie Immunglobulinen A (IgA), Wachstumsfaktoren und Hormone. Caseine synthetisiert, in supramolekularen Strukturen zusammengesetzt, nämlich Caseinmicellen entlang des sekretorischen Wegs transportiert werden und dann durch Exozytose frei, also die Verschmelzung von caseinhaltigen sekretorischen Vesikel (SV) mit der apikalen Plasmamembran der MESC (Abbildung 2). Intrazelluläre Verkehr stützt sich auf Material des Austauschs zwischen membranFächern und beinhaltet Lösliche N-Ethylmaleimid-Sensitive Fusion (NSF) Befestigung Protein (SNAP) Rezeptor (SNARE) 30,31. Die SNARE-Proteine ​​der Familie ist in vesikulären SNAREs (v-SNAREs), in der Vesikelmembran Gegenwart und Ziel SNAREs (t-SNAREs), auf die Zielmembranen lokalisiert unterteilt. Durch Komprimieren durch ihre Coiled-Coil-Domänen, V- und T-SNARE versammeln, um eine hochstabile Vierhelixbündel-Komplex zu bilden, bezeichnet als the SNARE-Komplex. Dieser Komplex fördert die Fusion von zwei gegenüberliegenden Lipiddoppelschichten durch die schrittweise bringen sie in die Nähe 30,32. Danach werden SNARE-Komplexen durch die NSF Adenosintriphosphatase dissoziiert und seine Adapter Protein SNAP und SNARE-Proteine ​​sind zurück in ihre Herkunftsfach 33 zurückgeführt. Interessanterweise liegt überwiegend jeweils SNARE-Protein in verschiedenen zellulären Kompartimenten und SNARE Paarung kann die Spezifität der intrazellulären Fusionsereignisse 34 beizutragen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass zumindest Synaptosomale-Associated Protein 23 (SNAP23) und Vesikel-assoziiertes Membranprotein 8 (VAMP8) und Syntaxinen (STX) -7 und -12 eine Rolle bei Casein Exozytose 35,36. Diese Proteine ​​wurden ebenfalls in Verbindung mit der Lipidfraktion von Milch, das heißt Milchfettkügelchen (MFG) 37 gefunden. Die aktuelle vorherrschende Modell postuliert, dass zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (CLDs) sind durch die Akkumulation von neutralen l gebildetipids (hauptsächlich Triglyceride und Sterolester) und Cholesterin aus der Ernährung der Mutter zwischen den beiden Blättchen des endoplasmatischen Retikulums (ER) -Membran 38-41 abgeleitet ist. Große CLDs ausgebildet sind, zumindest teilweise durch die Fusion von kleineren CLDs während es an die apikalen Seite MESCs wo sie als MFG freigegeben werden (1-10 &amp; mgr; m im Durchmesser) durch Knospung transportiert, wobei durch den MESC apikalen Plasmamembran umhüllt 40-42. Stillzeit aufhört, nachdem Welpen entwöhnt und die MESCs schrittweise sterben durch Apoptose, was zur Rückbildung des Brustgewebe wieder zu einem pubertären Zustand (1B, Rückbildung). Immunfluoreszenz (IF) ist ein in fast allen Bereichen der Biologie verwendet gemeinsamen analytischen Labormethode, sowohl in der Forschung und in der klinischen Diagnostik. IF-Techniken können auf Gewebeschnitten durchgeführt werden (Immunhistochemie, IHC) oder Zelle (Immunzytochemie, ICC) Proben. Diese leistungsstarke Ansatz beruht auf der Verwendung von Leuchtstoff-markierte Antikörper, die spezifisch an die (direkt oder indirekt) mit dem Antigen von Interesse, wodurch die Visualisierung der Verteilung im Gewebe durch Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenzsignale meist hängen von der Qualität und der Konzentration der Antikörper und sachgemäße Handhabung der Probe. Eine einfache indirekte Immunfluoreszenz (IIF) -Protokoll wird präsentiert, um Milcherzeugnisse (Kaseine und MFG) und Proteinen in Milchprodukt Sekretion beteiligt erkennen (butyrophilin (btn1), SNARE-Proteine) an Gefrierschnitten von Mausbrustgewebe (Abbildung 3). Während dieses Protokoll bietet eine komplette Übersicht IHC reichen von Gewebesammlung für Bild Nachbehandlung, kritische und optionale Schritte sowie einige technische Empfehlungen werden ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

<table><tbody><tr><td>Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel and adapted blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Towel paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue sample preparation</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td></tr><tr><td>OCT compound/Tissue Tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (D-saccharose)</td><td>VWR</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Plastic molds</td><td>Dominique Dutscher</td><td>39910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/sample support</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades (SEC35)</td><td>Thermo Scientific</td><td>152200</td><td></td></tr><tr><td>Slide box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143560W90/1014356190</td><td></td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IHC</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Permanent marker (black)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl in PBS</td><td>Sigma</td><td>A-0171</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M glycine in PBS</td><td>VWR</td><td>24403.367</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (up to 100&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000/H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td><td>VWR</td><td>CORN2980-225</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td><td>generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences&lt;br/&gt; Center, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td><td>Biolegend (Covance)</td><td>MMS-162P</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-115-P0/P1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td><td>generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td><td>generously gifted S. Tooze&lt;br/&gt; (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td><td>Abcam</td><td>ab3348</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-025-003</td><td></td></tr><tr><td>Counterstains</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Observation/Image capture</td><td>&lt;span style=&quot;line-height: 20.8px;&quot;&gt;Company&lt;/span&gt;</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>conventional fluorescence microscope</td><td>Leica Leitz DMRB&lt;br/&gt; microscope</td><td></td><td>Standard filters for FITC, Rhodamine&lt;br/&gt; and DAPI emissions,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&amp;circ;F software (Olympus)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td><td>Zeiss LSM&lt;br/&gt; 510 microscope</td><td></td><td>Plan-Apochromat &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CLSM 510 software,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td></tr><tr><td>Image treatment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>ImageJ 1.49k software</td><td></td><td></td><td>Free software</td></tr></tbody></table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

Indirekte Immunfluoreszenz dient zum Erfassen und Lokalisieren von interessierenden Proteinen in einem Gewebe. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein vollständiges und einfaches Verfahren für die Immunerkennung von Proteinen, wobei die Maus laktierenden Milchdrüse als ein Beispiel genommen. Ein Protokoll für die Herstellung von Gewebeproben, insbesondere in Bezug auf die Präparation von Maus-Brustdrüsen, Gewebefixierung und gefrorenem Gewebe Schnitte, sind detailliert. Ein Standardprotokoll, um die indirekte Immunfluoreszenz durchführen, einschließlich eines optionalen Antigen-Retrieval-Schritt wird ebenfalls vorgestellt. Die Beobachtung der markierten Gewebeschnitte als auch die Bildaufnahme und Nachbehandlungen sind ebenfalls angegeben. Dieses Verfahren ergibt eine vollständige Übersicht, aus der Sammlung von Tiergewebe auf die zelluläre Lokalisation eines Proteins. Obwohl diese allgemeine Methode kann auf andere Gewebeproben angewendet werden, sollte es zu jedem Gewebe / primären Antikörper paar studierte angepasst werden.

Die Brustdrüse ist eine subkutane Drüse entlang der ventralen Struktur sowohl des Thorax und des Abdomens bei Nagern entfernt. Die Lage der fünf Paare von Drüsen der Maus während der Schwangerschaft ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Morphologie der Brustdrüse drastisch ändert sich während seiner Entwicklung, was auf funktionelle Änderungen erforderlich, um für die vollständige Stillzeit (Abbildung 1B) vorzubereiten. In Jungfrau oder nulliparous Tieren, die Brus...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Aufrufe.  INRA.  Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren. 

Serie: Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Forschung

Krebsforschung

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Biologie

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Co-Lokalisierung zwischen Komponenten von Gap, Tight und Adherens Junctions in Murine Mamma Drüsen

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Entwicklungsbiologie

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play a major role in mammary gland function and are the origin of most mammary tumors. Introducing genes of interest into mouse mammary epithelial cells is a critical step in evaluating gene function in epithelial cells and generating mouse mammary tumor models. This goal can be accomplished through the intraductal injection of a viral vector carrying the genes of interest into the mouse mammary ductal tree. The injected virus subsequently infects mammary epithelial cells, bringing in the genes of interest. The viral vector can be lentiviral, retroviral, adenoviral, or adenovirus-associated viral (AAV). This study demonstrates how a gene of interest is delivered into mammary epithelial cells through mouse mammary intraductal injection of a viral vector. A lentivirus carrying GFP is used to show stable expression of a delivered gene, and a retrovirus carrying Erbb2 (HER2/Neu) is used to demonstrate oncogene-induced atypical hyperplastic lesions and mammary tumors.

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

The present protocol describes intraductal injection of viral vectors via the teat to deliver genes of interest into the mammary epithelial cells.

Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunologie und Infektion

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Co-Lokalisierung zwischen Komponenten von Gap, Tight und Adherens Junctions in Murine Mamma Drüsen

Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse