MA wurde durch ein Schrödinger-Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF, J3086-B11) und dankt der Max-Planck-Gesellschaft für finanzielle und administrative Unterstützung getragen. GS und JH wurden vom Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS13-030) unterstützt.

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The authors declare that they have no competing financial interest.

Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ ist sehr erwünscht können insbesondere bei geringen Affinität Wechselwirkungen wie TCR-pMHC Bindung 11. Dies, da die An-Rate als auch die Stabilität eines solchen Wechselwirkungen signifikant durch die besonderen Umstände, unter denen eine Bindung stattfindet, beeinflusst. Minimalinvasive FRET-basierten Imaging-Ansätze sind also im Prinzip perfekt für solche Aufgabenstellungen geeignet, dennoch beinhalten eine Reihe von Hürden, die überwunden werden müssen. Rauschen, das durch zelluläre Autofluoreszenz erzeugten begrenzt die Empfindlichkeit der Messungen und sollte daher auf ein Minimum beschränkt werden. TIRF-Mikroskopie dient dieses Bedürfnis sehr gut 12 erfordert aber die Funktionalisierung von Glasobjektträger, idealerweise in der Form einer ebenen Glasgestützten Lipiddoppelschicht mit Proteinen der Wahl 13-15 eingerichtet. Ein weiterer Vorteil einer teilweise rekonstitutiven Ansatzes ist, dass rekombinante Doppelschicht-Resident FRET-Partner kann sehr viel mErz leicht in quantitativer ortsspezifische und rationelle Weise mit kleineren und heller Fluorophoren markiert, als es mit der Zelloberfläche exprimierten Proteine ​​möglich. TCRs mit rekombinanten scF V s, die T-Zell-Erkennung nicht beeinflussen markiert, wie zuvor 2 getestet wurde. Darüber hinaus ist die Proteinzusammensetzung der SLB, beispielsweise die Dichte pMHCs und die Wahl des Hilfsfaktoren können an einen spezifischen Bedürfnisse angepasst werden. Wir haben zuvor durchgeführten Versuchen mit unterschiedlichen Dichten von stimulierenden pMHCs, aber noch nicht detektierten signifikanten Unterschiede in der 2D-K off und 2D-K D2. Soweit hier die Erkennung von MHC Klasse II-Moleküle mit nur behandelt, vor allem wegen der Art ihrer Peptidbindungsspalte, die an beiden Enden offen ist und somit Platz für größere Peptide einschließlich eines Linkers für Fluorophor Anlage. In einigen Fällen kann ein solcher Ansatz auch für die Kennzeichnung MHC cla arbeitenss-I-Moleküle 16, aber großer Vorsicht zu treffen, um ihre Verwendung in Experimenten zu überprüfen. Die Empfindlichkeit der T-Zellen gegen Antigene, die durch T-Zell-Proliferations-Assays, sowie die pMHC-TCR Bindungskinetik gemessen wie in vitro durch Oberflächenplasmonresonanz gemessen werden durch die Zugabe des Linkers und Fluorophors beeinflusst das Peptid. Alternativ können MHC-Klasse-I-Molekülen, sich in einer ortsspezifischen Art und Weise mit der Einführung eines ungepaarten Cystein innerhalb der Sequenz der schweren Kette (unveröffentlichte Beobachtungen) markiert werden. Mit der Verwendung von geeigneten Molekularsonden jedes synaptischen Protein-Protein-Wechselwirkung können prinzipiell in einer hierin beschriebenen Art und Weise untersucht werden. Solche Sonden, beispielsweise sollte scF V s oder Designed Ankyrin Repeat Proteine ​​(DARPins) 17, monovalente und sollte ihre Ziel stabil zu binden, ohne die Interaktion von Interesse. Natürlich Struktur information für rationales Sondendesign sehr wünschenswert, aber nicht unbedingt erforderlich. Bei der Festlegung eines neuen Paares von FRET-Partner, wird empfohlen, zu erfassen und zu analysieren, FRET in Groß ersten. Seiten der Etikettenbefestigungs kann beträchtlich variiert werden, um die FRET-Signals zu maximieren und auch zu überprüfen, ob gemessen FRET Erträge hängen von der inter-Farbstoff der Entfernung ab. Sobald das System optimiert ist, einzelne FRET-Signale können durch die Begrenzung der Markierung von hoher Häufigkeit FRET Partner auf 10-30%, und das Bleichen des niedriger Abundanz FRET Partner bis einzelne Moleküle auflösbar sind auf dem Gebiet der Beleuchtung erfasst werden. Nicht zuletzt ist darauf hinzuweisen, dass SLBs nähern einige, aber nicht alle Aspekte einer physiologischen Plasmamembran. Eigenschaften wie Membrankrümmung und Flexibilität Domäne Kompartimentierung Umordnung des Cytoskeletts und der Zellbeweglichkeit sowie eine hohe Vielzahl von Oberflächen-exprimierten Membranproteine ​​werden von SLBs dargestellt aber beeinflussen könnten ter untersuchte verarbeiten. Große Anstrengungen müssen investiert, um die bildgebenden Verfahren, die Überwachung der Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Einzelmolekülauflösung in physiologischer Synapsen, die unzugänglich für TIRF Bildgebung ermöglichen festzulegen.

Ein grundlegendes Verständnis davon, wie T-Zellen erkennen Antigene erfordert der Suche an der richtigen Stelle, das heißt, innerhalb der immunologischen Synapse zwischen der T-Zelle und der APC gebildet. Hier Molekular Bindungskinetik werden nicht nur von den inhärenten biochemischen Eigenschaften der Interaktionspartner beteiligt, aber bestimmt ab zu einem großen Teil auf die Zellparameter, die zellulären Kräfte, Membran-Architektur und lateralen Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen sowie Synapse spezifischen geometrischen Beschränkungen beinhalten 3. Biochemische Ansätze zu Auflösungsvermögen, da sie die Zerstörung von mindestens einem der synaptischen Membranen beteiligt notwendig beschränkt. Aus diesem Grund wird ein FRET-basierten Imaging-Methode wurde entwickelt, um zu überwachen Bindung des TCR, um antigene pMHCs 2. Hier T-Zellen mit einem rekombinanten eingerichtet und ortsspezifisch TCR &amp; bgr;-reaktives Einzelketten-Antikörperfragment (SCF V) markiert und mit Plan konfrontiert<html> AR-Glas-gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs), die MHC Klasse II-Moleküle mit einem fluoreszierend markierten antigenen Peptid beladen, costimulatorischen Molekülen und Adhäsionsproteine ​​zu beherbergen. Synaptischen Bindung zwischen Farbstoff markierten TCR und farbstoffmarkierten pMHC ergibt FRET, der auf einer Masse und Einzelmolekülebene durch Total Internal Reflection Fluoreszenz (TIRF) -Mikroskopie überwacht werden können. In diesem Artikel wird im Detail erläutert, wie man SLBs zur Bestimmung von T-Zellsynapsen zu nutzen, überprüfen Sie ihre Integrität über eine funktionelle T-Zell-Calcium-Flux Assay Verhalten FRET-Messungen in der Masse und mit Einzelmolekülempfindlichkeit und die erfassten Daten zu analysieren. Empfehlungen sind auf die Herstellung einwandfrei angepaßt Proteine, die für Doppelschicht Funktionalisierung erforderlich angeboten. Für genauere Informationen bezüglich Doppelschichtbildung und Aufbau eines geeigneten TIRF-Mikroskop bitte zu einem zusätzlichen Zugang der Öffentlichkeit JoVE Publikation veröffentlicht Rücken an Rücken 4 beziehen. Zelt &quot;&gt; Natur von SLBs Funktionalisierbaren SLBs leicht von unilamellaren Vesikeln (SUVs), welche die beiden Lipide 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-phosphocholin erzeugt werden (kurz: POPC, 90-99%) und 1,2-Dioleoyl-sn - glycero-3 - {[N (5-Amino-1-carboxypentyl) Iminodiessigsäure] Succinyl} (kurz: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs auf sauberen Glasobjektträger verteilt, um eine zusammenhängende planare Doppelschicht 4 zu bilden. DGS-NTA-Ni dazu dient, Polyhistidin-tag-Proteine ​​über Polyhistidin-vermittelte Komplexbildung mit dem synthetischen NTA-Ni-enthaltenden Kopfgruppe (1A) zu verankern. Für stabile Assoziation einer Regel ersetzt die nativen Transmembran-Domäne und den cytoplasmatischen Schwanz des Adhäsionsprotein ICAM-1 und der co-stimulierenden Molekül B7-1 mit einem Tag mit zwölf Histidine (ICAM-1-12h, B7-1 -12H) (1B) . Das Peptid-beladenen Klasse II-Molekül IE k enthält zwei Membran-Embedded (α und β) Polypeptidkettes. Die Trans / zytoplasmatischen Domänen beider Ketten müssen mit einem Tag mit sechs Histidinen jeweils (IE k α 6H β 6H oder IE k -2x6H) ersetzt werden. Als Alternative zur Verlängerung der α-Kette mit zwölf Histidinen und dem Verlassen der extrazellulären Domäne des β-Kette ohne Tags (was zu IE k α 12H β 0H oder IE k -12H) führt zu zufriedenstellenden Ergebnissen (Abbildung 1B). Standortspezifische Kennzeichnung pMHCs Es ist wichtig, um die pMHC stöchiometrisch und ortsspezifisch, um zu kennzeichnen, um in der Lage zu mess FRET Renditen in sinnvolle Gleichgewichtsbindungskonstanten zu konvertieren. Dies kann durch chemische Markierung eines synthetischen Peptids, das in die Peptidbindungsspalte von rekombinanten Histidin-markierten MHC Klasse II-Moleküle geladen 2,5 erreicht wird. Das Peptid umfaßt alle Rückstände des T-Zell-Epitop wie well als eine kurze C-terminale Linker (GGS), gefolgt von Cystein (zB in der Motten Cytochrom c (MCC) Peptid ANERADLIAYLKQATK- GGSC, der Linker ist fett markiert). Dieses Cystein wird verwendet, um das Peptid stöchiometrisch unter Verwendung von Maleimid-Farbstoff-Derivate zu bezeichnen. An dieser Stelle sei besonders vorsichtig, um die Überprüfung quantitative Farbstoff Kopplung an die Cystein-enthaltenden Peptid gewidmet sein. HPLC-Reinigung des Peptids Farbstoff Addukt wird empfohlen und ist vom Elektrospray-Ionisations-Massenspektroskopie verfolgt werden. Etwaige zeichneten Massen entsprechend der Peptid Edukt (ohne Farbstoff) zu reflektieren unvollständige Etikettierung. Wenn dies wahr ist, sollte der HPLC-gereinigte Peptid an aufeinander folgenden Runden von Farbstoff-Markierung unterzogen werden, bis die Kennzeichnung gilt quantitativ. Beachten Sie, dass der MALDI-TOF-Massenspektroskopie sollte vermieden werden, da diese Methode beinhaltet Laserstrahlung für die Proben Ionisation werden. Diese Behandlung löst die beigefügten empfindliche Fluorophore vor Peptidmasse wird ausgelesen und damit underrepre<html> SENTS Grade Farbstoff-Konjugation. Indirekte noch ortsspezifische Markierung von zellgebundenem TCRs mit der Verwendung von monovalenten Einzelketten-Fv-Fragmente Es ist immer noch eine Herausforderung, Farbstoffe oberflächenassoziierten Proteine ​​lebender Zellen in einer ortsspezifischen Weise Zelle zu befestigen. Diese Hürde für oberflächenexponierten TCRs zu überwinden, wurde eine monovalente einkettige Version (SCF V) aus den Genen des TCR &amp; bgr -reaktive monoklonalen Antikörper H57-197 2 errichtet. Die Kristallstruktur dieses Antikörpers im Komplex mit dem TCR ermöglicht, rational zu entwerfen eine Version, bei der ein Serinrest in der Nähe des C-Terminus der MHC-assoziiertes Peptid (wobei die entsprechenden FRET Partner Farbstoff angebracht ist) ist für eine substituierte Cysteinrest. Diese Mutante Cystein dient dann als Akzeptor für Farbstoff-Konjugation (Abbildung 2). Methoden zur FRET aufnehmen nt &quot;&gt; Groß FRET-Werte sind am besten geeignet, um die Beziehung zwischen gewählten Inter-Farbstoff Entfernungen Akkreditierung und FRET-Effizienzen in diesem TCR-pMHC gemessenen Bindungssystem 2. Darüber hinaus Groß FRET-Messungen zeigen, qualitative und quantitative Unterschiede in der synaptischen TCR-pMHC Affinitäten ( siehe unten und Protokoll Abschnitt 3.2). Verschiedene Ansätze zur Quantifizierung der FRET-Effizienzen wurden in der Literatur 6 eingeführt. In über dieser Artikel FRET erfasst (a) Spender Erholung nach Akzeptor Bleichen, und über (b) sensibilisiert FRET-Akzeptor-Emission. Das erste Verfahren (a) erfordert die Verwendung eines FRET-Akzeptor, die leicht gebleicht werden können, und einem Spender, der eher photo ist. Zusätzlich ist es wichtig, sicherzustellen, dass die fotogebleicht Akzeptor ist nicht mehr in der Lage ist das Abschrecken der Donor-Fluoreszenz. Da die gleichen Detektionskanal (Donor) ist für die Quantifizierung verwendet, keine Korrekturfaktoren eind keine chromatischen Aberrationen berücksichtigt werden müssen, was dieses Verfahren einfach und zuverlässig macht. Jedoch können quantitative Messungen nicht auf dem gleichen Punkt der Probe wiederholt werden und Veränderungen in der FRET nicht über die Zeit aufgezeichnet werden. Um Effekte durch molekulare Diffusion oder zellulärer Motilität eine schnelle Bleichstufe angestrebt werden, die die Zeit, die zwischen dem ersten FRET-Donor (vor Akzeptor-Bleichen) und dem zweiten FRET-Donor Bildaufnahme (nach FRET-Akzeptor Bleichen) minimiert zu vermeiden. Es ist zu empfehlen, um eine leistungsfähige Laser-Lichtquelle des FRET-Akzeptor Anregungswellenlänge, um die Beleuchtung und Bleichzeiten zu minimieren beschäftigen. Im Gegensatz dazu in dem Ansatz der sensibilisierten FRET Emissionsmessung (b) der FRET-Donor ist, angeregt und die Emission der FRET-Akzeptor in dem FRET-Akzeptor-Kanal beobachtet. Änderungen im FRET-Akzeptor-Signal kann im Laufe der Zeit aber Emission der FRET-Donor in den roten Bereich verschobenen Akzeptor-Kanal aufgezeichnet werden (termed Durchscheinen) und FRET-Akzeptor Quererregung über Donoranregung müssen genau bestimmt und aus dem aufgezeichneten FRET-Akzeptor-Kanal subtrahiert werden. Hierzu werden die entsprechenden FRET-Donor und FRET-Akzeptor-Bilder sind räumlich ausgerichtet werden. Detektion von Einzelmolekül (sm) FRET-Ereignissen Bei der Verwendung von Lasern als Anregungsquelle, einer empfindlichen Kamera und geräusch gedämpft TIRF-Mikroskopie die Fluoreszenz der einzelnen Fluorophore können leicht über die Zeit verfolgt werden. Ähnliches gilt für den Nachweis der intermolekularen smFRET Ereignisse. Jedoch können Komplikationen durch FRET-Donor Durchbluten und Queranregung des FRET-Akzeptor verursacht werden, und daher mit großer Sorgfalt bei der Einstellung der Fluorophor Dichten im smFRET Versuch genommen werden. In dem Protokoll unten angegeben (Protokoll Abschnitt 4) wurde das TCR als FRET-Donor in hoher Fülle und pMHC als FRET-Akzeptor in geringer Menge ausgewählt. Um FR dämpfenET Spenderdurchscheinen ausreichend, dekorieren 10-30% der TCRs mit fluoreszierenden scF V und 90-70% der TCRs mit nicht-fluoreszierenden scF V. Hier wurde das FRET-Akzeptor-Kanal als Einzelmolekül-Kanal gewählt, weil es mit der konfokalen Einzelmolekül-FRET-Kanal. Dies hilft, smFRET Veranstaltungen mit Einzelmolekül-FRET-Akzeptoren, die die Grundlage der smFRET Validierung auszurichten. Extrahieren von synaptischen off-Raten durch smFRET Messungen Photobleaching beider FRET-Donor-Akzeptor und FRET müssen für beim Extrahieren der Halbwertszeit von Wechselwirkungen von Einzelmolekül-FRET-Spuren berücksichtigt werden. Die Anzahl der beobachtbaren FRET-Signale zu Beginn ihres Auftretens als Einzel Donor-Akzeptor-Paar N (0) wird über die Zeit sowohl unverbindlich des Rezeptor-Ligand-Komplex und Photobleich reduziert. Die Zahl der überlebenden Komplexe zu einem bestimmten Zeitpunkt N (t) kann mathematisch wie folgt ausgedrückt werden: In der Photoblei Ausdruck exp (-t / τ Bleichmittel) ist die Zeit t durch das Produkt aus der Anzahl der Beobachtungen n und der Beleuchtungszeit t schlecht aufgrund der nicht-kontinuierlichen, diskreten Betrachtungsmodus (dh Bleichen während der Beleuchtung tritt nur beschrieben ). Innerhalb der kinetischen Term exp (t / τ off) die Zeitdauer t ist das Produkt aus der Anzahl der Beobachtungen n und dem Zeitpunkt t lag für einen einzelnen FRET Beobachtung (dh kontinuierlich geschieht kinetische freibleibend). Gleichung 1 kann wie folgt ausgedrückt werden: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Der Begriff τ Bleichmittel / τ krank describes die Anzahl der Beobachtungen bis Bleich auftritt und ist definiert als der Erwartungswert &lt;n bleichen&gt; der Exponentialfunktion. Gleichung 2 kann wie folgt vereinfacht werden: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> Der Erwartungswert &lt;n (t lag)&gt; der Anzahl von Rahmen N (t) mit beobachtbaren FRET-Ereignissen nach der Zeit t wird direkt aus dem Experiment bestimmt. Es hängt von der einstellbaren Zeit zwischen Beobachtungen (t lag) in das Experiment ausgewählt und die unbekannten Werte für τ off (das Inverse der off-Rate k off) und &lt;n bleichen&gt;, den Erwartungswert der Anzahl der Beobachtungen vor dem Bleichen auftritt . So Berechnung des Erwartungswertes &lt;n (t lag)&gt; für mindestens zwei Werte von t <sub&gt; Verzögerung ermöglicht die experimentelle Bestimmung der &lt;n bleichen&gt; und &amp; tgr; aus. Extrahieren von synaptischen 2D-K D Werte durch FRET-Messungen Messen TCR Belegung ein, dh das Verhältnis zwischen gebundenen TCRs und insgesamt TCRs ist von zentraler Bedeutung für die Bestimmung der synaptischen 2D-K D -Werte. Nach der Formel 4 dieser Begriff ist direkt proportional zu der gemessenen FRET Ausbeute solange TCRs dient als FRET-Donoren und pMHCs als FRET-Akzeptoren. <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> mit a = TCR Belegung, C = Umrechnungsfaktor C eine Konstante ist, die auf dem FRET-System abhängt, und die verwendeten Fluorophore. Es kann experimentell wie folgt bestimmt werden. ein in eine 2D-K D nach Gleichung 5 umgewandelt, wenn derAnfangsdichte von TCR-Liganden vor der Zugabe von T-Zellen, um die Doppelschicht bekannt ist. Dies ist wegen der hohen Mobilität der SLB-Proteine ​​gebunden und auch, weil SLBs bieten ein nahezu unerschöpfliches Reservoir an Liganden 2. <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> mit [pMHC Anfangs] = Anfangsdichte von pMHC vor der Zugabe von T-Zellen Mit den Gleichungen 4 und 5 kann man nun leicht die synaptische 2D-K D zwischen TCR und pMHC. Dies wird am zuverlässigsten mit FRET-Messungen basierend auf Spender Erholung nach Akzeptor Bleichen (siehe Protokoll Abschnitt 3.1) durchgeführt. Jedoch zur Messung C die Beziehung zwischen der Intensität I FRET FRET (Hintergrund korrigiert, FRET-Donor Durchbluten und FRET-Akzeptor Queranregung) und TCR Belegung a bestimmt werden muss. Dazu werden einbenötigt, um das Verhältnis R zwischen der mittleren Fluoreszenzintensität von einzelnen TCR-assoziierten FRET Donorfluorophore (zB Cy3 oder AF555) sm weiß ich FRET-Donor und die mittlere Intensität des einzelnen Moleküls FRET Ereignisse sm I FRET. R hängt von der FRET-System in Frage, Emissionsfilter und Kamera für die Fluoreszenzdetektion eingesetzt. Der TCR Belegungsbeginn a kann dann nach Gleichung 6 direkt bestimmt werden. <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> mit R = sm I FRET-Donor / sm I FRET R wurde als 1,45 für den H57 scFv- Cy3 / Cy5 pMHC-Systems bestimmt zu: a = Groß Ich FRET / Groß I TCR-cy3 • 1,45 Die Beziehung zwischen dem TCR Belegung a und der FRET-Ausbeute kann durch FRET-Donor bestimmen erholeny nach dem Akzeptor-Bleichen. Hierzu werden beide Parameter gegeneinander für eine Reihe TCR Mikrocluster aufgetragen, wie in 4A .Die Steigung der linearen Anpassung gezeigt gibt die Umwandlungsfaktor C (aus Gleichung 4). Wie in 4A gezeigt, C Beträge für (a) die H57 scF V - Cy3 / Cy5 pMHC-FRET-System und (b) der aufgebrachten Mikroskop Systemkonfiguration auf 1.995. Der TCR Belegungsbeginn ein leicht wie folgt abgeleitet werden: TCR Belegung a = FRET-Ausbeute • 1.995

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Die Aufzeichnung der intrazellulären Calcium über den Fura-2 Calciumfarbstoff sowie die anschließende Zellanalyse die stimulierende Wirkung und damit Funktionalität der SLBs sind in Abbildung 4 gezeigt, um zu verifizieren. Wie deutlich wird, steigen die Calciumspiegel in T-Zellen (wie die ausgedrückt normalisierten Fura-2 340 nm / 380 nm Verhältnis zum Ausgangswert gleich 1) sofort, sobald sie auf die stimulierende SLBs begleichen. Calcium-Spiegel wieder auf das Ausgangsniveau kurz nach der Zugabe eines Antikörpers, der Blöcke pMHCs von TCR Engagement und welcher endet T-Zell-Aktivierung. Figur 6 zeigt einen typischen Versuch mit FRET-Donor-Akzeptor Erholung nach Bleichen, das verwendet wird, um FRET Ausbeuten messen und die 2D-K D -Werte berechnet dient (in 4 gezeigt). Bitte beachten Sie die Zunahme der FRET-Donor Intensität, die TCR stellt über AF555 markiert, nachdem eine schnelle und vollständige Ablation des FRET eincceptor Arten (hier: AF647 mit pMHCs zugeordnet). Außerdem erkennt man die starke Verringerung des FRET-Kanal, dh dem FRET-Akzeptor-Kanal unter FRET Donoranregung nach FRET-Akzeptor Bleichen. Die kaum sichtbaren Restsignal entspricht Spenderdurchscheinen FRET. FRET Renditen innerhalb einzelner TCR Mikrocluster oder ganze Synapsen werden berechnet auf der Grundlage der angegebenen gemessenen Intensitätswerten (6B). Figur 7 zeigt eine Bahn und Zeitablauf eines einzelnen Moleküls FRET Ereignis in zwei Zeitrahmen sichtbar. Wie oben in der Einleitung dargelegt solches Verhalten wird sowohl durch Zerfall von synaptischen TCR-pMHC-Bindung und Photobleich verursacht. Um zwischen diesen beiden Beiträge zu unterscheiden, haben die Versuchserfassungszeitrahmen zu der Dauer variiert werden, während eine konstante Lichtbleichung verbleibt, werden Änderungen in FRET Ereignis Trajektorienlänge nur durch die Bindungskinetik verursacht. Eine Quantifizierung der tracelengths, w<html> hich die Grundlage für die Berechnung der in 7 gezeigt ist off-Raten und Bleich bildet, sind in den Tabellen 1 bis 3 zur Verfügung gestellt. Bestimmung der 2D-K D s erfordert Aufzeichnung von Groß FRET Renditen für FRET-Donor markierten TCRs. Mit der Verwendung des experimentell abgeleitete Konstante C (Abbildung 4) kann ein FRET-Ausbeute für eine TCR Microcluster oder eine ganze Synapse, gemessen in die TCR umgewandelt bezugs ein, dh das Verhältnis von pMHC-Eingriff und die Gesamt TCRs (4C) . Mit bekannten pMHC Dichten in der SLB vor der Zugabe der T-Zelle vorhanden ist, können a -Werte aufgetragen, um synaptische 2D-K D -Werte (4D) zu bestimmen. On-Raten können mit dem Massenwirkungsgesetz berechnet werden (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) von der fest synaptischen off-Rate und 2D-KD-Werte. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1 Schematische Darstellung der Lipiddoppelschicht-System planare Glasgestützten (SLB). (A) SLBs aus POPC (90-99%) und dem synthetischen Lipid DGS Ni-NTA (1-10%) zusammengesetzt und bilden sich spontan, wenn saubere Glasoberflächen mit kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) berechnet, die aus den entsprechenden Lipiden. (B) Einmal gebildet, können solche SLBs mit löslichen Polyhistidin-markierten extrazellulären Anteile von pMHCs abgeleiteten kostimulatorischen B7-1-Proteine ​​und ICAM-1-Adhäsionsproteine, funktionalisiert werden, um als APCs für T-Zellen dienen. Für weitere Informationen über die Vorbereitung SLBs siehe Axmann et al. 4. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> zu 2. Förster Resonance Energy Transfer basierten Assay zu quantifizieren TCR-pMHC Bindung in situ. (A) eine Verbundstruktur aus einem TCR mit einer H57 einkettiges Fragment Eingriff eines pMHC komplexiert stellt die hierin beschriebene FRET-basierten Ansatz. Beachten Sie die kurze Entfernung von ca. 41A zwischen den beiden entsprechenden Fluorophore unterziehen FRET. Akzeptor-Stellen für die Fluorophor-Maleimide sind in grün und rot angezeigt. (B) Das Prinzip der Erfassung TCR-pMHC Wechselwirkungen in situ dargestellt. Nur scF V -Dekoriert TCRs und pMHCs (hier IE k), die spezifische Komplexe zu bilden, führen zu einer messbaren FRET-Signals. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Chromatogramme der endgültigen Gelfiltrationsschritt was zu monomeren scF V s und Peptid-beladenen IE k -2x6H Moleküle. X-Achsen stellen Rückhaltevolumen in ml, Y-Achsen geben Absorption bei 280 nm in willkürlichen Einheiten (AU) . (A) H57 scF V ortspezifisch mit Alexa Fluor 555 maleimid bis S75 unterzogen, wobei nicht umgesetzte Farbstoff von dem Protein (Schritt 1.2.5) getrennt markiert. Fraktionen, die Retentionsintervall 14 bis 15 ml (gestrichelte Linien) darstellen monomeren H57 scF V markiert. (B), dh k -2x6H Moleküle mit der UV-spaltbare ANP-Abstandshalter-Peptid komplexiert war UV-bestrahlt wurden, mit ortsspezifisch Alex inkubiert 647 Maleinimid-markierten Peptids und schließlich zu S200 unterzogen, wobei das Protein aus freien Peptids (Schritt 1.1.2.4) zu trennen. Der Abstand zwischen den gestrichelten Linien enthält und richtig gefalteten monomeren pMHCs. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml Probe wurde auf die Säule mit Beginn der rum (0 ml Punkt) aufgebracht. Gesammelten Fraktionen wurden eingeengt. Das Protein-zu-Farbstoff-Verhältnis wurde photospektrometrisch vor der Dialyse gegen PBS / 50% Glycerin bestimmt (für die Lagerung bei -20 °). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bestimmung 2D-K D s und 2D-k auf s. (A) Die Korrelation zwischen der FRET-Ausbeute von Geberrückgewinnung bestimmt, nachdem Akzeptor Bleichen und TCR Belegung wurde experimentell gemessen. TCR Belegung kann für einzelne TCR Mikrocluster bestimmt werden, wie in Abschnitt 4.2 erläutert. Eine lineare Anpassung der Daten wird durch die Linie angezeigt wird, gleich dem Verhältnis zwischen C TCR ist deren NeigungBelegung und die FRET-Ausbeute. C ist eine Konstante, spezifisch für den FRET-System und den Fluorophoren (hier Cy3 und Cy5) eingesetzt. In diesem Beispiel ergab 1.988. (B) FRET-Ertragsdaten wurden für die einzelnen TCR Mikrocluster ermittelt (N = 187, Temperatur = 24 ° C) durch Spenderrückgewinnung von Akzeptor-Bleichen. Zahlen unter Histogramm-Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (C) Die Umwandlung der in (B) gezeigten Daten durch Multiplizieren gemessenen FRET-Renditen mit der Konstante C bestimmt in (A). Zahlen unter Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (D) Histogramm (halblogarithmischen, base = 4), welches die Verteilung von 2D-K D s für einzelne TCR Mikrocluster gemessen. Die mediane 2D-K D wird blau angezeigt. Zahlen unter Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (E) Die in (D) gezeigt, Histogramm wurde int umgewandeltoa 2D-k auf -histogram (halblogarithmischen, Base = 4) unter Verwendung der synaptischen k off für 24 ° C (0,41 s -1). Der ermittelte Median 2D-k auf Wert wird blau angezeigt. Die Daten wurden ursprünglich in Huppa et al. 2 veröffentlicht und sind hier in einem neuen Format visualisiert. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Abbildung 5. Funktionelle Validierung SLBs für T-Zellstimulation und Imaging beschäftigt. (A) TCR-transgene T-Zellblasten mit Fura-2 beladen waren mit stimulierenden SLB konfrontiert beherbergen gene pMHCs, ICAM-1 und B-7. Cellular Fura-2-Emission bei 340 nm und 380 nm angeregt sowie DIC Bilder wurden aufgezeichnet. Wie angegeben, Verhältniswerte der Emissionsintensitäten bei 34 erregt0 und 380 nm sind auf der rechten Seite angezeigt. Zugabe pMHC blockierende Antikörper 14 min in die Versuchsreihe führte zu einer Abnahme der intrazellulären Calciumspiegel vergleichbar mit derjenigen von ruhenden T-Zellen. (B) eine typische zeitliche Verlauf des durchschnittlichen Fura-2-Verhältnisse in T-Zellen in Kontakt stimulatorischen SLBs gekennzeichnet durch eine einem anfänglichen Anstieg des intrazellulären Calciums, die 2 bis 4 mal höher ist im Vergleich zu der nicht-aktivierten T-Zellen oder T-Zellen-Antigen nach der Antikörper-vermittelten Blockade beraubt. Grüne Kreise zeigen in (A) veranschaulicht den Zeitpunkten. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Abbildung 6. Bulk-FRET-Ausbeuten durch FRET-Donor Erholung nach FRET-Akzeptor Bleichen gemessen. <strOng&gt; (a) ist ein Beispiel eines typischen synaptischen FRET-Messung. Wie auf der linken und auf der Oberseite angedeutet eine Reihe von Bildern mit der Verwendung eines Emissionsstrahlteiler, die zu einem FRET-Donor und ein FRET-Akzeptor-Kanal erworben (für nähere Informationen zu Strahlteiler siehe Axmann et al 4). Der in der linken Bild DIC gezeigte Linie zeigt die Begrenzung der T-Zell-Synapse. Beachten Sie den Intensitätsverlust in der FRET-Akzeptor-Kanal als auch der Anstieg der Intensität in der FRET-Donor Kanals nach FRET Akzeptorbleichen (Schritt 4). (B) FRET-Effizienz quantifiziert für einzelne synaptischen Regionen oder für ganze Synapsen bezeichnet werden. Zur Inspektion werden die Bilder vor und nach der FRET-Akzeptor Bleichen mit dem Einsatz von zwei Suchtabellen (LUTs, grün und Physik) angezeigt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt; <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Abbildung 7. Einzelmolekül-FRET-Ereignissen erscheinen und verschwinden insingle Schritte und sind perfekt mit einem einzigen FRET Akzeptor-Fluorophor ausgerichtet ist. Der Zeitablauf der Einzelmolekül-FRET-Event gezeigt. Bilder wurden mit einem rückseitig belichteten EMCCD Kamera erworben. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Abbildung 8. Die Bestimmung τ off = 1 / k off aus gemessenen smFRET Trajektorien. (A) Die normierten kumulativen Summen beobachtbaren FRET-Signale (von H57 scF V -AF555 abgeleitet dekoriert 5c.c7 TCR transgene T-Zell-Blasten erkennen IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 bei 24 ° C) für vier verschiedene Zeitverzögerungen (42 msec, 490 msec, 1,007 ms 1,989 ms) wurden als Funktion der Gesamtzahl von Beobachtungen aufgetragen. Mono-exponentielle Anpassung Funktionen führen zu entsprechend den negativen Umkehrung der Erwartungswerte &lt;n (t lag)&gt;. (B) Prognose-Werte wurden gegen die Verzögerungen t lag aufgetragen und ausgestattet mit Hilfe der Gleichung &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(&amp; tgr; off / &lt;n bleichen&gt;) + t lag}, um τ ergeben aus und &lt;n bleichen&gt;. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.3K Aufrufe.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

Serie: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

Quantitativen Messung In situ Flows mit einem Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

Forschung

Biotechnik

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Mess TCR-pMHC Binding

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