Wir danken Dr. William Cashdollar, und der Northwestern Mutual Foundation Imaging Center an der Blut-Research Institute of Wisconsin für die Hilfe bei den bildgebenden Untersuchungen. Wir danken auch Dr. Daria Ilatovskaya für die kritische Durchsicht des Manuskripts und hilfreiche Diskussionen. Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Grants HL108880 (AS) und DP2-OD008396 (AMG) unterstützt.

Die im folgenden beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Medical College of Wisconsin genehmigt und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Isolierung von Rattenaorta, <ol><li> Betäuben Ratten mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) oder einem anderen IACUC genehmigten Methode. </li><li> Legen Sie die Ratte in Rückenlage. Um die Bauchorgane aussetzen, einen kleinen ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Unterhautgewebe Bauch. Verwendung Gazekompressen leicht abzulenken den Darm, die Aorta und die Vena cava freizulegen, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Kurz, stumpf sezieren die Aorta vom Bindegewebe und aus der Vena cava. Verwendung Naht, binden Sie die Aorta so nah wie möglich an die Nieren. Sezieren etwa 1-2 cm von Aorta und legen Sie sie in einem 15 ml konischen tusein enthält normale physiologische Kochsalzlösung (PSS; in mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl 2, 2 CaCl 2, KCl 4,5, 6 Glucose, 10 HEPES) auf Eis. </li><li> Sobald der Aorta wird isoliert, das Tier einschläfern nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Beendigung aller nicht-Überlebens Verfahren einschläfern tief narkotisierten Tiere durch Thorakotomie induzieren Pneumothorax, um die humane Ableben des Tieres zu gewährleisten. 3 </li><li> Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskop, spitzen Pinzette und Mikroschere sezieren das Fett und Bindegewebe aus der Aorta. Sobald der Aorta ist sauber, schneiden Sie die Aorta in Längsrichtung und legen Sie sie in PSS auf Eis für später. </li></ol> 2. Dye Loading und Incubation <ol><li> Pipette 7 ul 1 mM Fluo-4.00 Farbstoff, der in DMSO basierenden Lösung zugeführt wird, in einzelne 500 ul Röhrchen, die mit Aluminiumfolie bedeckt worden. Lagern Sie im Gefrierschrank bei -20 ° C, um die Farbstoffeigenschaften mit der Zeit zu bewahren. Hinweis: Diese aliquotiert sosungen sollte für mindestens sechs Monate stabil sein. </li><li> Vor dem Einsatz, damit die Farbstofflösungen zum Aufwärmen auf RT vor dem Öffnen. Bereiten Sie Arbeitslösungen unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die verdünnte Reagenz für die spätere Verwendung. </li><li> In 7 ul fertiger 1 mM Fluo-04.00 Farbstoff in DMSO-Lösung zu 450 ul der PSS, die kein Calcium aufgelöst. Dann werden 40 &amp; mgr; l DMSO nicht anhand 10% Pluronic Säurelösung zu der Lade Cocktail um die Dispersion der Acetoxymethyl- (AM) Ester und verbessern Beladung des Calcium-Farbstoff. </li><li> Legen Sie die seziert Aorten in die 500 ul Röhrchen, die das Laden Cocktail (wie in 2.3) für 1 h. Decken Sie alle Rohre mit Folie und Platz auf einem rotierenden Schüttler bei RT. </li><li> Um die NO-Produktion in das Gefäßsystem zu überwachen, verwenden Sie DAF-FM-diacetat Farbstoff. Inkubieren der Aorta in einer Lösung, die 450 ul PSS 40 ul Pluronsäure und 5 ul 10 mM DAF-FM-diacetat. Ähnlich wie bei der Kalzium Inkubationsprotokoll (in 2.3), legen Sie die Aortain einem 500 ul Röhrchen mit dem in der Folie und auf einem rotierenden Schüttler für 30 min bei 4 ° C, gefolgt von nächsten 30 min bei RT, abgedeckt NO-Farbstofflösung. </li><li> Wenn die NO-Produktion gemessen wird, verwenden Sie die endotheliale NO-Synthase-Blocker, L-NAME, um die NO-Produktion als ein Steuerungsblock, wie in 4B gezeigt. Für dieses Verfahrens in den Cocktail (Stand 2.5 beschrieben), 100 nM L-NAME für die letzten 30 Minuten Inkubation (bei RT). </li></ol> 3. Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie Protocol <ol><li> Nach 1 h Inkubation, Waschen der Aorta 2 - 3 mal in saubere PSS an extrazelluläre Farbstoff zu entfernen. </li><li> Übertragen die Aorta in eine silikonbeschichtete Schale, die entweder normal PSS oder Ca 2+ -freiem Puffer (abhängig von der experimentellen Protokoll). Pin die Aorta nach unten auf die Silikonbeschichtung mit der Adventitia in Kontakt mit dem Silicon (dh endothelial Lumen zu der Schale Öffnung freigelegt) mit μ-förmigen Stiften. Alternativ können Sie einen Slice-AnchorGitter oder Klebstoff, um das Gewebe zu reparieren. Anmerkung: Um Stress und mögliche mechanische Artefakte, Übertragung zu reduzieren und zu beheben Aorta in Ca 2+ -freien Lösung und warten Sie 5 - 10 min vor dem Start des Experiments. </li><li> Verbinden eine peristaltische Pumpe oder eine Spritze zu der silikonbeschichteten Platte für die automatische oder manuelle Anwendung von Arzneimitteln oder zur Veränderung der extrazellulären Lösung. </li><li> Die Schale unter dem Mundstück des aufrechten Zwei-Photonen-Mikroskop, und installieren Sie und positionieren Sie eine 25 × (NA 1,05 und Arbeitsabstand 2 mm) Wasser-Immersions Objektivlinse über der Probe. Hinweis: Wenn diese spezifische Linse nicht verfügbar ist, verwenden Sie ein Objektiv speziell für Zwei-Photonen-Imaging hergestellt, weil es Signalauflösung drastisch im Vergleich zu einem regulären Ziel zu erhöhen. </li><li> Aktivieren Sie die Zwei-Photonen-Laser mit Hilfe der Software (der Laser beginnt zu pumpen und schalten Sie). Tune die Laseranregung zu 820 nm. </li><li> Verwendung Epifluoreszenz, suchen Sie die Aorta und konzentrieren sich auf das Ziel,die endotheliale Oberfläche mit Grobeinstellung. </li><li> Schaltet das Mikroskop in zwei Photonen-Laser-Scanning-Modus, so dass die Anregungslaser-Modus gesperrt ist, die nichtdescannten Detektoren aktiviert, und die entsprechenden mit dem erwarteten Emissionsspektren Emissionsfilter installiert sind. Hinweis: Hier wird die FV10-MRL / R (495-540 nM) wurden verwendet. </li><li> Starten Sie Live-Scannen mit ca. 5% der Laserleistung und fein fokussieren das Ziel, um die Endothelzellen zu visualisieren. Hinweis: Die Endothelzellen ein starkes Fluoreszenzsignal aufweisen, wenn sie in normalen PSS inkubiert. Dies wird deutlich schwächer sein, wenn die Schiffe in calciumfreien Puffer inkubiert. Die Endothelzellen auf der Oberseite der geöffneten Aorta und die glatten Muskelzellen unterhalb der Endothelzellen (siehe Figur 2) zu sehen ist anwesend sein wird. Da die Blutgefäße sind weder glatt noch einmal, wird es Orte, an denen sowohl glatten Muskelzellen und Endothelzellen vorhanden sind. &lt;/ Li&gt; <li> Sobald die Zellen im Fokus sind, programmieren Sie die Mikroskop-Software aufeinanderfolgenden Bildern in Fast-Scan-Modus (Raster-Scan, 512 x 512 Pixel-Fenster mit einem Rahmen Sammlung Frequenz von 1,1 s) zu sammeln. Parallel Fluo-04.00 Fluoreszenz, sammeln, um Veränderungen in der Gefäßkontraktion zu erfassen und die Versuchsbedingungen besser sichtbar zu Durchlichtbilder. </li><li> Nach der Erfassung der grundlegenden Signalbilder, ändern Sie die Ca 2+ Ionen-Konzentration in der Außenlösung oder langsam gelten pharmakologischen Reiz Agenten mit Hilfe der Schlauchpumpe, während Bildgebung. Beobachten Sie das Fluoreszenzsignal Anstieg innerhalb der beladenen Zellen. Hinweis: Die Endothelzellen reagieren auf Änderungen der Strömungs, empfiehlt es sich daher, um laminare Nieder Anwendungen und Fahrzeugtests vor der Anwendung von pharmakologischen Aktivatoren von Ca 2+ oder keine Signalisierung zu verwenden. Um intrazellulären Calcium zu nM Konzentrationswerte in Gefäße mit Fluo-4 (Dissoziationskonstante für Fluo-4 i geladen wird neu berechnets 345 nm) konnten Fluoreszenzintensität bei der Grundlinie und nach der Zugabe von Ionomycin und MnCl 2 aufgezeichnet. 4 </li></ol> 4. Bildverarbeitung und Berechnungen <ol><li> Downloaden und installieren Sie Fiji Bildverarbeitungspaket. </li><li> Öffnen Sie die Bilddatei in Fidschi. Nach dem Importieren der Datei, teilen Sie die Kanäle (Durchlicht und Fluoreszenzsignal), wenn Sie dazu aufgefordert. Verwenden Sie nur das Fluoreszenzsignal für die Datenanalyse. </li><li> Innerhalb der Fiji-Programm, klicken Sie auf der Registerkarte Analyse und unten scrollen, um die Option Tools. Unter der Option Tools, finden Sie auf die Registerkarte, die ROI-Manager sagt, und klicken Sie darauf; Ein neues Fenster wird angezeigt. </li><li> Danach klicken Sie auf Set-Messungen auf der Registerkarte Analyse. Wählen Sie die spezifischen Messungen von Interesse. Für die Kalzium transienten Messungen, verwenden Sie den mittleren Grauwert-Option. </li><li> Mit der Kreis Trace-Tool, damit beginnen, die Regionen von Interesse (ROI) zu verfolgen und klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot; auf der ROI-Manager-Bildschirm für jeden ROI. Sobald alle Zellen von Interesse verfolgt worden, in der Manager-Fenster ROI, wählen Sie Multi Measure unter der Registerkarte &quot;Mehr&quot;. Denken Sie daran, entweder speichern Sie die Messungen direkt oder Kopieren und Einfügen alle diese Messungen in eine Tabellenkalkulation. </li><li> Öffnen * .txt-Datei oder Excel-Tabelle aus Fidschi und übertragen Sie die Zahlen auf ein neues Origin-Arbeitsblatt. Hinweis: Alternativ können Sie ein beliebiges Programm wie Sigma Plot oder Prism für die weitere Analyse. </li><li> Innerhalb der Origin-Programm verwenden Plot → Line + Symbol-Menü, um einen Überblick über alle vorübergehenden Reaktionen zu beobachten. Deaktivieren Sie die nicht reagierenden Zellen. </li><li> Neu berechnen Spurennummer Zeitskala (X-Achse), verwenden Spalte → Spaltenwerte errechnen und multiplizieren Sie die Spur-Nummer Spalte, um die Fotosammlung Frequenz (in unserem Fall 1,1 s). </li><li> Verwenden Sie Analysis → Zeilenstatistik für alle ausgewählten Aufnahmen auf Mittelwert (Y-Achse) und Standardfehler Spur zu berechnen. Plot endgültige Graph zur aktuellen Gruppe von Zellen Plot → Line + Symbol. </li><li> Die MEAn Calciumtransienten Berechnung wird beschrieben, wie gefolgt. <ol><li> Für Gesamtcalciumfreisetzung innerhalb des Origin-Programm, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Sie Menü → Analysis Infinitesimalrechnung → integrieren. Gesamtintegral der Fläche unter der Kurve erscheint im Ergebnisprotokoll. </li><li> Für transiente Kinetik, klicken Sie auf Graph, dann verwenden Menü: Analyse → Nichtlineare Kurvenanpassung → Wählen Sie Data Set (wählen X-Achse reichen von maximal bis zum Ende der Übergangsfunktion). Starten Fitting → Select Function → Exponential Decay 1 → Done. Hinweis: Exponential Einbau in Grafikfenster angezeigt und Ergebnisprotokoll. Erhaltenen Daten (Werte), die den Gesamtcalciummenge freigegeben wird, und die Kinetik der Kanäle vermittelt das Einschwingverhalten. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Experimental Übersicht. Um besser zu verstehen, vaskuläre Physiologie des Beitrags von Kalzium und NO wurde eine neuartige Methode zur Messung entwickelt [Ca 2+] i und NO in glatten Muskelzellen und Endothelzellen isolierter intakter Aorta. Zusammen, dieses Protokoll besteht aus diesen kritischen Schritte: 1) Mechanische Isolierung und Herstellung (nicht enzymatische Verdauung) des Schiffes. Es ist wichtig, das Gewebe gesund und intakt, so viel wie möglich, um eine optimale physiologisc...

Calcium ist ein Grund second messenger in vaskulären Zellen wie Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Es ist der primäre Stimulus für die vaskuläre Kontraktion und spielt eine wichtige Rolle bei der Gefäßerweiterung, einschließlich der Auswirkungen unverErzeugung innerhalb des Endothels. Aufgrund der Beschränkungen von Imaging-Technologien, hat es praktisch unmöglich gewesen, Kalzium Handhabung innerhalb des intakten Schiffes zu beobachten. Die Entwicklung der Zwei-Photonen-Imaging-Systeme und die Schaffung neuer Calcium oder keine Kennzeichnung Farbstoffe, macht bei einer ausreichenden Tiefe und Auflösung es möglich, Bild zu beginnen, um Kalziumdynamik und NO-Produktion innerhalb des Gefäßsystems zu verstehen. Zwei-Photonen-Mikroskopie hat vor kurzem in Gewebe, Organe und sogar ganze Tierstudien wegen seiner überlegenen Fähigkeit, tief Gewebe mit geringer Hintergrundfluoreszenz und hohe Signalempfindlichkeit eindringen angewendet. 1,2 Der schmale Spektrum des Zwei-Photonen-Anregung bei der illuminatIonen Brennpunkt und die Verwendung nichtdescannten Detektoren sind die Gründe, warum zwei Photonen-Mikroskopie ist den herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Konfokale Mikroskopie kann qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen an der notwendigen Gewebetiefe aufgrund der Autofluoreszenz und die Streuung von out-of-focus Licht in die konfokale Lochblende. Folglich haben wir ein Verfahren unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskop zur Messung von [Ca 2+] i-Signalisierung und die NO-Produktion in intakten, einzelnen Zellen von Blutgefäßen mit hoher Auflösung und niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis entwickelt.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Olympus upright microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&amp;nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti:sapphire laser 690nm &amp;mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>Filters</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&amp;nbsp;</td><td>495 to 540 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25&amp;times; water-immersion objective lens</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&amp;nbsp;</td><td>Warner Instrument&amp;nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

Calcium ist ein wichtiger Regulator von vielen physiologischen Prozessen in vaskulären Geweben. Esten Endothel- und glatten Muskelfunktionen hängen stark von Änderungen der intrazellulären Calcium ([Ca 2+] i) und Stickstoffmonoxid (NO). Um zu verstehen, wie [Ca 2+] i, NO und Downstream-Moleküle werden durch ein Blutgefäß in Reaktion auf Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren behandelt, eine neue Technik, die Kalzium-Kennzeichnung gilt (oder No-Kennzeichnung) entwickelten wir Farbstoffe mit zwei Photonen-Mikroskopie Kalzium Handhabung (oder NO-Produktion) in isolierten Blutgefäße zu messen. Hier beschrieben ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die, wie man eine Aorta einer Ratte, Etikett Calcium oder NO in den Endothelzellen oder glatten Muskelzellen zu isolieren und Bild Calciumtransienten (oder NO-Produktion) mit Hilfe eines Zwei-Photonen-Mikroskop folgenden physiologischen demonstriert oder pharmakologische Reize. Die Vorteile der Verwendung des Verfahrens sind mehrfach: 1) es ist möglich, gleichzeitigely messen Calciumtransienten sowohl in Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur als Antwort auf verschiedene Stimuli; 2) es erlaubt, Bild Endothelzellen und glatten Muskelzellen in ihrer Muttereinstellung; 3) Diese Methode ist sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calcium oder keine Änderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen; und 4) beschriebene Vorgehensweise kann auf die Messung von anderen Molekülen, beispielsweise reaktive Sauerstoff-Spezies angewandt werden. Zusammenfassend Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie Laseremission zu Calciumtransienten und NO-Produktion in den Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Blutgefäß hochwertige quantitative Daten zur Verfügung gestellt und förderte unser Verständnis der Mechanismen, die Gefäßfunktion zu überwachen.

Um genau zu beurteilen, den Beitrag von Calcium zu vaskulären Physiologie (Vasodilatation und Vasokonstriktion) wurde ein Protokoll entwickelt, um Calcium-Farbstoffe in beiden Endothelzellen und glatten Muskelzellen in isolierten intakten aortae laden. Die allgemeine Versuchsanordnung in 1 dargestellt ist, zeigt die grundlegende Strategie für die Isolierung und Herstellung des Schiffes vor der Bildgebung. Kurz gesagt, nach der Isolierung der Aorta der Ratte, sollte es von Fett und Bin...

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Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

11.2K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta. 

Serie: Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Forschung

Medizin

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Biologie

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Neurowissenschaften

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Die Anwendung von genetisch kodierter Fluorescent Stickstoffmonoxid (NO) • Sonden, die geNOps, für Echtzeit-Imaging von NO • Signale in Einzelzellen

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in laboratory animals and small arteries isolated from human tissue. The technique allows researchers to maintain isolated blood vessels in a tightly controlled and standardized (near-physiological) setting, with the option of adjusting to various environmental factors, while challenging the isolated vessels with different pharmacological agents that can induce vasoconstriction or vasodilation. The myograph chamber also provides a platform to measure vascular reactivity in response to various hormones, inhibitors, and agonists that may impact the function of smooth muscle and endothelial layers separately or simultaneously. The blood vessel wall is a complex structure consisting of three different layers: the intima (endothelial layer), media (smooth muscle and elastin fibers), and adventitia (collagen and other connective tissue). To gain a clear understanding of the functional properties of each layer, it is critical to have access to an experimental platform and system that would allow for a combinational approach to study all three layers simultaneously. Such an approach demands access to a semi-physiological condition that would mimic the in vivo environment in an ex vivo setting. Small volume chamber tensometric myography has provided an ideal environment to evaluate the impact of environmental cues, experimental variables, or pharmacological agonists and antagonists on vascular properties. For many years, scientists have used the tensometric myograph technique to measure endothelial function and smooth muscle contractility in response to different agents. In this report, a small volume chamber tensometric myograph system is used to measure endothelial function in the isolated mouse aorta. This report focuses on how small volume chamber tensometric myography can be used to evaluate the functional integrity of the endothelium in small segments of a large artery such as the thoracic aorta.

The present protocol describes the concepts and technical application of the tensometric myograph technique using a multi-chamber myograph system in the experimental ex vivo assessment of mouse aortic endothelial function.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca

Zusammenfassung

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