We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Dieses Protokoll und Video werden soll als Ergänzung zum ursprünglichen Papier beschreibt das Software-Paket im Detail 4, sowie der Technische Bericht, der mit dem Software-Download auf der Website Danuser Lab kommt zu dienen. Die Leser werden aufgefordert, diese Unterlagen sorgfältig prüfen, ob es weitere Fragen zur Verwendung der Software. 1. Vor der Bildanalyse <ol><li> Jedes Zeitraffer-Film zu konvertieren in eine Folge von TIFF (Tagged Image File Format)-Image-Dateien. Wenn es mehrere Wachstumskegel /-Zellen in einem gegebenen Film, um erste Ernte jeder Wachstumskegel / Zelle ihre eigene Bildsequenz zu erstellen. Hinweis: Dies ist nicht notwendig, da die einzelnen Regionen-of-Interest (ROI) innerhalb plusTipTracker ausgewählt werden. Jedoch mit kleineren Bildabmessungen erhöht die Geschwindigkeit der Rechenverarbeitung, so dass dieser Schritt wird empfohlen, wenn eine signifikante Leerstelle in dem Bild. </li><li> Speichern Sie jede TIFF-Serie im eigenenOrdner &quot;Bilder&quot; in einem Pfad, MATLAB, um den Zugang gesetzt (beachten Sie, dass &quot;Bilder&quot; ist case-sensitive). Um einen neuen Pfad im Fenster &quot;Aktueller Ordner&quot; hinzufügen, auf die entsprechende Datei-Verzeichnis zu navigieren, der rechten Maustaste auf das Verzeichnis-Symbol, und wählen Sie &quot;In den Pfad - Ausgewählte Ordner und Unterordner&quot;. Es ist wichtig, dass die Software plusTipTracker Ordner auf den Weg gegeben werden, wie gut. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Hinweis: Der erste Schritt in der Bildanalyse ist es, die EB1-GFP Kometen erkennen, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und bestimmen Sie die Parameter der Dynamik der Mikrotubuli. Dies wird mit dem Befehl &quot;plusTipGetTracks&quot; 4 erhalten. <ol><li> Um die Analyse, offene MATLAB-Anwendung beginnen und geben Sie &quot;plusTipGetTracks&quot; in das Befehlsfenster. Dies führt dazu, dass ein neues Dialogfeld angezeigt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Neues Projekte&quot; und wählen Sie einen (oder more) der vorigen TIFF-Bild-Serie durch eine entsprechende &quot;Bilder&quot;-Ordner (oder Verzeichnisse mit &quot;Bilder&quot;-Ordner). Nach Abschluss dieser Schritt ein Dateiverzeichnis (roi_1) wird (im selben Ordner, die &quot;Bilder&quot; hält) geschaffen werden, die die zukünftigen Datendateien enthält. Hinweis: Die &quot;Set Up New Projects&quot; Schritt kann vor der Zeit abgeschlossen werden kann, während einer separaten Sitzung. </li><li> Ein neues Fenster wird angezeigt: &quot;Wählen Sie ein Polygon, rechtsklicken Sie auf letzten Punkt, und klicken Sie auf &#39;Erstellen Maske&#39;&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Das erste Bild der ausgewählten Bildserie werden dann angezeigt. Mit der Maus zu klicken, und erstellen Sie ein Polygon, das die Gesamtheit der Wachstumskegel umfasst. Doppelklicken Sie auf die Maus, um das Polygon zu schließen. </li><li> Sobald das Polygon geschlossen wurde, wird ein Dialogfeld angezeigt: &quot;Möchten Sie eine andere ROI auswählen?&quot; Wenn das Bild hat einen weiteren Wachstumskegel zu analysieren, wählen Sie &quot;Ja&quot;; sonst sAuserwählten &quot;Nein&quot;. </li><li> Wählen Sie die Projekte, die sofort analysiert werden. Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Projekte&quot; und wählen Sie den Ordner (roi_X) zu analysieren. </li><li> Ein listSelectGUI Bildschirm erscheint. Wählen Sie das Projekt (e) von der linken Seite des Bildschirms, und verschieben Sie sie auf die rechte Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste zu speichern und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Erkennung&quot;, &quot;Verfolgung&quot; und &quot;Post-Processing&quot;. Sobald diese Einstellungen vorgenommen wurden, wird die rechte Seite des Dialogfelds werden konfigurierbar. Konfigurieren Sie jede Option. <ol><li> Diese Parameter werden verwendet, um erkannt Kometen in MT-Tracks zu verbinden. Details für die Wahl dieser Steuerparameter für die Verfolgung sind auf den Seiten 9-10 des technischen Berichts, der die PDF-Software-Paket herunterladen beiliegt; Lesen Sie diesen Bericht sorgfältig, wenn Probleme auftreten. Für die Zwecke des Tracking-EB1-GFP Kometen in xenopuns laevis Wachstumskegel, verwenden Sie die folgenden Einstellungen Verfolgung: Suche Radiusbereich (Pixel) 5-12, Mindestteilstreckenlänge (Frames) 3; Max Gap Länge (Frames) 8; Max Schrumpffaktor 0,8, Max Winkel vorne 50, Max Winkel rückwärts 10, Fluktuation Radius 2.5. Diese Einstellungen werden in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol> Hinweis: Max Schrumpffaktor ist auf die Anzahl der &quot;rückwärts Lücken&quot; erkannt zu reduzieren, als &quot;rückständig Lücken&quot; sind nicht sinnvoll, im Rahmen der Wachstumskegel zu analysieren, da die überfüllten Bedingungen und wahrscheinlich Fehler in der Spurgestänge. Zusätzlich sowohl Max Vorwärtswinkel sowie Fluktuation Radius relativ hoch eingestellt ist, als Wachstumskegel MTs zeigen häufige kleine Translokationen zusätzlich zu Wucherungen und Schrumpfungen, und die Erhöhung dieser Steuer Einstellungen ermöglicht dieser erhöhten Bewegung während der Verknüpfungsschritt. <ol><li> Füllen Sie die Post-Processing-Einstellungen abhängig von den gewünschten spezifischen Bildaufnahme-Einstellungen. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Sobald die Einstellungen konfiguriert wurden, klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Die Software läuft je nachdem, welche Einstellungen gewählt wurden. Das kann Minuten bis Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der ausgewählten Projekte und ihre Größen. Das Befehlsfenster zeigt die voraussichtliche Rest für jede Funktion. Wenn die plusTipGetTracks Schritt abgeschlossen ist, das Befehlsfenster zeigt &quot;Fertig!&quot; Hinweis: Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik haben nun von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter zu untersuchen, MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumsspurdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Hinweis: Nachdem die Mikrotubuli-Tracks definiert wurden, ist die Funktion &quot;plustipSeeTracks&quot; für Spur 4 Visualisierung eingesetzt. Diese Funktionkönnen mehrere Ausgänge für die Visualisierung, einschließlich räumliche Dynamik MT Karten und Geschwindigkeit Filme bieten, aber hier liegt der Fokus ausschließlich auf mit &quot;Track Filme&quot;, ​​um MT Spuren auf den Wachstumskegel Bilder überlagert anzuzeigen. Während plusTipGetTracks können mehrere Filme auf einmal zu analysieren, können plusTipSeeTracks nur einen Film analysieren zu einer Zeit. <ol><li> Geben Sie &quot;plusTipSeeTracks&quot; in das Befehlsfenster. </li><li> Nachdem das Dialogfeld lädt, klicken Sie auf &quot;Select Project&quot;. Wählen Sie das übergeordnete Verzeichnis, das Projekt zu visualisieren und klicken Sie auf &quot;Ordner auswählen&quot;. Ein neues Fenster wird angezeigt: &quot;Wählen Sie das Projekt, das Sie visualisieren möchten&quot;. Wählen Sie die Datei, um zu visualisieren und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Als nächstes klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Gespeicherte ROI&quot;. Navigieren Sie zu dem gleichen Ordner wie die roi_X im vorherigen Schritt ausgewählt und wählen Sie die Datei mit dem Namen &quot;roiYX&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Output Directory&quot; auf w bezeichnenMATLAB hier wird die Track-Visualisierungsdateien zu speichern. Hinweis: Wir empfehlen mit den gleichen Ordner, die den Rest der Daten enthält. </li><li> &quot;Make Track-Film&quot; und ein Fenster angezeigt, die Anzeige alle Titel aus den plusTipGetTracks + TIP Kometen berechnet. Dieser Schritt sichert die verfolgten Zeitreihen in einem Film-Format, in der Datei &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Es gibt eine Option für das Speichern der Film als AVI, sonst das Standardformat ist als Quicktime.mov Datei. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Hinweis: Diese letzte Funktion wird verwendet, um Gruppen von Filmen für die Analyse und den Vergleich ihrer MT Spurparameter. <ol><li> Geben Sie &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; in das Befehlsfenster. Manuell wählen Sie die Gruppen zu vergleichen, zuerst de-wählen Sie &quot;Auto-Gruppe aus Hierarchie&quot;. Dann klicken Sie auf &quot;Select-Projekte&quot;. Navigieren Sie zu den übergeordneten Verzeichnissen alle roi_X Ordner mitzu analysieren. </li><li> Ein listSelectGUI Bildschirm erscheint. Wählen Sie alle Projekte, die in den Gruppen, von der linken Seite des Bildschirms umfassen und verschieben Sie sie auf die rechte Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste zu speichern und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Ein Fenster wird angezeigt: &quot;Bitte wählen Sie zuerst Gruppe aus der Liste&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Das Fenster listSelectGUI wird erneut angezeigt. Dieses Mal, wählen Sie nur die Dateien, die zu der ersten Gruppe, die zusammengeführt werden sollten übereinstimmen. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Geben Sie dann den Namen der Gruppe, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Entsprechend &quot;Wählen Sie eine andere Gruppe?&quot; Antwort und weiter Gruppen auswählen: Ein Fenster wird angezeigt. Es erscheint ein Fenster: &quot;Wählen Sie einen Speicherort für die Gruppenliste speichern&quot;. Navigieren Sie zum Speicherort und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Select Output Directory&quot; zu wählen, wo die Ausgangsordner werdengespeichert. </li><li> Wählen Sie, welche Art von Gruppenanalyse durchzuführen, um - ob die MT-Tracks sollten für jede Gruppe oder pro Zellanalyse durchgeführt werden soll gebündelt werden. Die empfohlenen statistischen Tests sind bereits bezeichnet. Um alle Titel in der Analyse, sind de-select &quot;-Tracks am Anfang / Ende des Film Entfernen&quot;. Ansonsten hat dieses Feld gewählt entfernt alle Spuren, die MT Wachstum in der Prozess sind wie der Film beginnt oder endet. </li><li> Nachdem die Gruppenanalyse Auswahl getroffen wird, wählen Sie &quot;Gruppen vergleichen&quot;. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker bietet eine einfache, grafische Benutzerschnittstelle für nahezu alle sichtbar EB1-GFP Kometen schnell und automatisch erkennen in einer Zelle oder Wachstumskegel, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und berechnen MT-Parameter. Andere Veröffentlichungen haben die Gestaltung ähnliche Arten von Software (zum Beispiel Marx et al ebenfalls verwendet quantitative Analyse von markierten EB1 Dynamik in Wachstumskegel 18.) Berichtet. Aber wird dieses Software in seiner einfachen Zugang, ...

Das Ziel dieser Methode ist, um quantitative Informationen über Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Protein (+ TIP) Dynamik in lebenden Wachstumskegel zu erhalten. MT + Tipps sind eine Gruppe von Proteinen, die an den Enden der plus-MT 9,10 lokalisieren. Sie führen eine Reihe von Funktionen, um die Parameter der MT dynamische Instabilität 11, einschließlich der Sätze der Polymerisation Katastrophe und Rettung zu regulieren. Ein allgemein verwendetes Verfahren zum Analysieren MT Dynamik ist, um das Verhalten des TIP + EB1, die spezifisch an wachsenden MT bindet plus-Enden 1,12 verfolgen. EB1 ist bekannt, dass mehrere andere Proteine ​​zu rekrutieren wachsenden MT plus-Enden 13,14, und wurde kürzlich als ein MT Reifung Faktor 15 festgestellt, die Förderung sowohl MT Wachstum und Katastrophe Frequenz 15,16. Viele Studien der MT Dynamik in Wachstumskegeln haben Hand-Tracking-Methoden, um Veränderungen in der EB1-GFP Dynamik über die Zeit zu messen 1-3 genutzt, wie EB1 localizatian MT plus-Enden können als Marker für MT-Polymerisation verwendet werden. Ein wesentlicher Vorteil für die Prüfung EB1-GFP Kometen als Proxy für MT Wachstum ist, dass MT Dynamik kann auch in Regionen mit signifikanter MT Überlappung gemessen werden. Während das Verfahren von Hand Verfolgung EB1-GFP Kometen hat nützliche Einblicke in MT vorgesehen Verhaltensweisen 1-3, es ist zeitaufwendig und kann vorgespannt werden. Zusätzlich wird, wie abweichende Wachstumskegel Verhaltensweisen sind wahrscheinlich das Ergebnis von winzigen Verschiebungen im Zytoskelett-Dynamik, die Analyse nur eine kleine Teilmenge von MT (in der Regel notwendig, wenn die Hand-Tracking) kann wichtige Informationen zu verpassen. So messen wir globale Dynamik MT Parameter mit dem Software-Paket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb der hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5. Diese Software, die im Labor entwickelt Danusers, wurde in mehreren Studien Charakterisierung MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 verwendet. Es ist ein Open-Source, unser-freundlich, MATLAB-basierte Paket, automatische Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Tips enthält. Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik werden von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumskurs Lebensdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern). Die Software kann direkt von der Website Danuser Lab (unter &quot;Software&quot;) heruntergeladen werden. Während der Danuser Lab unterstützt derzeit eine neuere Schnittstelle für TIP + Tracking-Analyse, die in einem Software-Paket namens u-Track 2.0, das Original, Stand-alone-Software zur Verfügung stehen aufgenommen wird. Die zugrundeliegenden Algorithmen zwischen den beiden Programmen gleich sind (zumindest 2014), wobei nur ein Unterschied von Schnittstelle und Analyse Ausgänge. Für den Anfänger mit wenig MATLAB und / oder Computeranalyse Erfahrenz hat plusTipTracker benutzerfreundlichen Funktionen, einschließlich automatisierter statistischer Parameter Ausgänge. Hier beschreiben wir die Schritte zum Analysieren von Bildern von EB1-GFP Dynamik in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Dieses Protokoll wurde in einer aktuellen Arbeit untersucht die Dynamik MT 17 genutzt. Siehe auch Lowery et al. 2012 5 für ausführliche Anweisungen für die Kultivierung Wachstumskegel ausdrücken EB1-GFP. Während dieses Papier in erster Linie auf die Untersuchung EB1-GFP Dynamik in Wachstumskegel konzentriert, kann das gleiche Protokoll für andere Zelltypen, 17 verwendet werden. Für alle Zelltypen, sollte das Zeitintervall zwischen den Rahmen zwischen 0,5-2 sec für optimale + TIP Verfolgungs sein. Ein Zeitintervall von bis zu 4 Sekunden zwischen den Rahmen möglich ist, aber dies erhöht Intervallzeit zu zusätzlichen Spurfehler.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker software</td><td>Danuser Lab</td><td>&lt;a href=&quot;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&quot;&gt;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&lt;/a&gt;</td><td>This software may be hosted by another website in the future.&amp;nbsp; If the listed site does not exist, search &quot;Danuser Lab Software&quot; on a web search engine to find the site.</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>Mathworks</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.com/products/matlab/&quot;&gt;http://www.mathworks.com/products/matlab/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Proteine ​​(+ Tips) zu lokalisieren, um den wachsenden Plus-Enden der MTS und regulieren MT Dynamik 1,2. Eine der bekanntesten und weithin genutzte + Tipps für die Analyse MT Dynamik ist die End-bindendes Protein, EB1, die alle wachsenden MT plus-Enden bindet, und somit ist ein Marker für die MT-Polymerisation 1. Viele Studien von EB1 Verhalten innerhalb Wachstumskegel haben zeitaufwendig und voreingenommen computergestützte, Hand-Tracking-Methoden zur Analyse einzelner MTs 1-3. Unser Ansatz ist es, globale Parameter des MT Dynamik mit dem Softwarepaket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb von hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5 quantifizieren. Diese Software ist eine MATLAB-basierte Open-Source-, benutzerfreundlichen Paket, das automatisierte Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Filtern kombiniert. Hier präsentieren wir das Protokoll für die Verwendung plusTipTAufsteller für die Analyse von fluoreszenzmarkierten + TIP Kometen in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Jedoch kann diese Software auch zum MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 charakterisieren.

Mit dieser Software, wie hier beschrieben wird mehrere Dateien mit Informationen, + TIP Dynamik in lebenden Zellen zu quantifizieren ist. Die Funktion plusTipGetTracks identifiziert die Tracks (mit Beispiel in Abbildung 1 gezeigten Einstellungen), und stellt Parameter in Bezug auf die + TIP Tracks dann. Um die Informationen, dass die Software erhalten sehen, gehen Sie in das Verzeichnis, in roi_X Schritt 2.2 erstellt wurde. Die &quot;feat&quot; Ordner enthält &quot;overlayI...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Die MATLAB-basierte Open-Source-Software-Paket, plusTipTracker, können verwendet werden, um Bild-Serie von fluoreszenzmarkierten + Tricks zu analysieren, um die Dynamik der Mikrotubuli zu quantifizieren.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Aufrufe.  Boston College.  Die MATLAB-basierte Open-Source-Software-Paket, plusTipTracker, können verwendet werden, um Bild-Serie von fluoreszenzmarkierten + Tricks zu analysieren, um die Dynamik der Mikrotubuli zu quantifizieren. 

Serie: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Forschung

Biochemie

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

Mikrotubuli Plus-End Dynamics Visualisierung im Huntington-Modell basierend auf humanen primären Hautfibroblasten

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Biotechnik

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neurowissenschaften

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Biologie

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli

Zusammenfassung

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