Name: dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

Wir danken Amy Chen für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Videodreh und zur Demonstration der Technik. Diese Arbeit von ENIGMA durchgeführt: Ökosysteme und Netzwerke integriert mit Gene und molekulare Baugruppen (http://enigma.lbl.gov), ein Scientific Focus Area Programm am Lawrence Berkeley National Laboratory, wurde durch das Amt für Wissenschaft, Amt für Biologische und unterstützt Umweltforschung, des US Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH11231.

Hinweis: Die unten Protokoll wird für die Bestimmung von Gen-Ziele der RR DVU3023 aus dem Bakterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough zugeschnitten. Es können zu jedem anderen Transkriptionsregulator von Interesse angepasst werden. 1. Clone und Entschlacken RR <ol><li> Klonen Sie die RR-Gen, insbesondere DVU3023, aus D. vulgaris Hilden in einem Escherichia coli-Expressionsvektor, so dass das Gen C-terminal His-markiert und Expression unter der Kontrolle eines T7-Promotors. Hinweis: Mehrere Klonierungsverfahren kann verwendet werden und wird durch den Forscher bestimmt. Alternative Affinitäts-Tags können auch verwendet werden. </li><li> Den Ausdruck in E. konstruieren coli BL21 (DE3) Expressionsstamm. </li><li> Aufwachsen 1 L des Expressionsstamm BL21 bei 37 ° C. In der Mitte der log-Phase, fügen IPTG 0,5 mM bis Proteinexpression induzieren. Weiterhin Wachstum bei Raumtemperatur für 24 Stunden. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 5000 × g für 10 Meilenn bei 4 ° C Die Zellen in Lysepuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM Imidazol, 1 mg / ml Lysozym, 1x Nuklease Benzonase). Lysieren Zellen unter Verwendung eines Französisch-Presse bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge Lysats bei 15.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Filter mit einem 0,45 um Spritzenfilter. </li><li> Auf einem FPLC-Gerät unter Verwendung von 10 ml Waschpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM Imidazol) waschen ein 1-ml-Ni-Sepharose-Säule. </li><li> Laden Lysat auf die Säule. Mit 20 ml Waschpuffer waschen Spalte. </li><li> Eluat DVU3023 Verwendung eines Gradienten von 0-100% Elutionspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol). </li><li> Laden eluierten Fraktionen auf eine Entsalzungssäule und Waschen mit einem Entsalzungspuffer (20 mM Natriumphosphat pH 7,4, 100 mM NaCl). </li><li> Zentrifuge Proteinprobe in einem Hochmolekulargewichts-Cutoff-Filter-Zentrifuge, um das Protein zu konzentrieren. Hinzufügen DTT und 0,1 mM und Glycerin 50% Protein und Speicher bei -20 ° C. Hinweis: Reinigungsverfahren müssen individuell für jede untersuchte Protein optimiert werden. </li></ol> 2. Bestimmen Gene Ziel für RR Mit elektrophoretische Mobilität Shift-Assay (EMSA) <ol><li> PCR amplifizieren 400 bp-Region stromaufwärts von der Kandidatenzielgens DVU3025 mit D. vulgaris Hilden genomischer DNA als Matrize und einen vorderen unmarkierten Primer und ein Rückwärts 5&#39;-Biotin-markiertem Primer. Hinweis: Tipps, um einen Kandidaten Zielgens wählen: Oft RRs binden die vorgelagerten Bereiche des eigenen Gen / Operon, oder sie können proximal codierten Gene regulieren. Wenn der RR hat Orthologe in anderen Spezies, suchen nach Genen, die in der Nachbarschaft konserviert sind. Alternative Methoden gehören die Auswahl von Kandidatengenen auf Basis Regulon Vorhersagen (zB RegPrecise 5) oder die Vorhersage sigma54-abhängigen Promotoren 6 für RRs, die sich sigma54 abhängig sind. </li><li> Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 1% Agarose-Gel, schneiden Sie die 400 bp große Produkt und reinigen die DNA mit einem Gel Extraktion Kit bereinigen. </li><li> Mischen DVU3023 Protein (0,5 pmol) mit 100 fmol der biotinylierten DNA-Substrat in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25% Glycerin und 1 &amp;mgr; g / ml Poly dI.dC (Nicht spezifischen Kompetitor-DNA) in einem Gesamtvolumen von 20 pl. Auch eine Reaktion ohne Protein als Kontrolle gesetzt. Inkubiere die Reaktion bei Raumtemperatur auf der Bank 20 min. </li><li> Anmerkung: Dies sind aufgelistet und in Abhängigkeit von der RR von Interesse können auch andere Reaktionskomponenten zugesetzt werden Standardbedingungen. Wenn die Aktivierung gewünscht, 50 mM Acetyl-Phosphat zu der Reaktion (oft RRs wird DNA in vitro zu binden, ohne Aktivierung). </li><li> Vorlauf eine Fertig mini 6% Polyacrylamid-Gel in 0,5 x TBE 0,5 x TBE-Puffer bei 100 V für 30 min. In 5 ul 5x Ladepuffer (0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylencyanol, 30% Glycerin in 1x TBE) auf die Bindungsreaktionen und Last 18 ul der Reaktionen auf die gel. Führen Sie bei 100 V für 2 Stunden. Hinweis: Um eine Überhitzung, die Dissoziation des Protein-DNA-Komplexe führen kann, füllen die äußere Pufferkammer in der Elektrophorese-System mit Laufpuffer, so dass die Mehrheit des Gels wird durch Puffer isoliert vermeiden. Alternativ kann das Gel bei 4 ° C ausgeführt werden, </li><li> Schnitt eine geladene Nylonmembran für die Größe des Gels und genießen sie in 0,5 x TBE für mindestens zehn Minuten. Entfernen Sie das Gel der Kassette. Schneiden Sie keine Kämme aus dem Gel und Sandwich-Gel und die Membran zwischen zwei in 0,5 x TBE getränkt dicke Filterpapiere und legen in einem Halbtrocken Blotapparatur und laufen bei 20 V für 30 min. </li><li> Legen Sie die Membran in einem kommerziellen UV-Licht Vernetzungsinstrument und die Zeit auf 3 min. Hinweis: Die Membran kann nun trocken bei Raumtemperatur für mehrere Tage, bevor zum nächsten Schritt gespeichert werden. </li><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen Chemilumineszenznachweis-Kit, das eine Streptavidin-Meerrettich peroxida beschäftigtse-Konjugat, das Blot nach Herstellerangaben zu entwickeln. </li><li> Bild der Blot unter Verwendung eines Computers angeschlossen an eine CCD-Kamera ausgestattet ist und nach einer Verschiebung in der Mobilität des DNA-Substrats in Gegenwart des RR, die anzeigt, dass der RR bindet die DNA getestet. Hinweis: Die Spezifität der DNA-Protein-Verschiebung kann, indem in die Reaktions einen Überschuss an unmarkiertem Kompetitor-DNA, die Beseitigung oder Verringerung der Verschiebung gesehen sollte getestet werden. </li></ol> 3. Überprüfen Target Enrichment nach Genomic DNA-Protein-Bindung <ol><li> Genomic DNA-Protein-Bindungsreaktion <ol><li> Scher genomischen DNA auf eine durchschnittliche Größe von 500 bp durch Beschallen 100 &amp;mgr; l genomische DNA (bei Konzentrationen von 100-200 ng / &amp;mgr; l) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Mikrospitze mit 9 Impulsen niedriger Amplitude von 1 Sekunde, 2 Sekunden Lücke zwischen jeden. Hinweis: Wenn die DNA spritzt an den Seiten der Röhre, Spin-Down der Inhalt nach jeweils 3 Impulse. Die genauen Bedingungen verwendetwird mit dem Ultraschallgerät Instrument variieren. Die gescherten DNA-Fragmente können von 100-1000 bp liegen, aber die mittlere Größe innerhalb von 400-600 bp. Zu viel Scher kann in weniger intakte Bindungsstellen führen und entweder zu viel oder zu wenig Scher Bibliothek wird während der Herstellung nachgelagerten Amplifikation des gesamten Genoms Schritte beeinflussen. </li><li> Mischen 2-3 ug genomische DNA geschert mit RR-Protein (0,5 pmol DVU3023) in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 25% Glycerin und 50 mM Acetyl-Phosphat. Reaktionen Inkubieren bei 25 ° C für 30 min. Übertragungs 10 ul dieser Reaktion auf eine 1,5-ml-Röhrchen und Etikett als Eingangs DNA. Hinweis: Acetyl-Phosphat zugesetzt wird, um das Protein durch in vitro-Phosphorylierung zu aktivieren. Die Phosphorylierung stimuliert die DNA-Bindung, aber viele RRs binden auch DNA in vitro 7 ohne Aktivierung. Die Proteinmenge der Reaktion zugegeben wird auf die Aktivität des Proteins prep abhängen. Die EMSA kann verwendet werden, um zu entscheiden seinimize Betrag. </li></ol></li><li> Affinity reinigen die Protein-gebundener DNA <ol><li> Hinzufügen von 30 &amp;mgr; l Ni-NTA-Agarose-Harz zu einem 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 100 g für 1 min, um das Harz am Boden zu sammeln, und den Überstand entfernen. 100 ul Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 25% Glycerin), Flick das Rohr zu mischen und Zentrifuge bei 100 × g für 2 min. Überstand entfernen. </li><li> Die restlichen 90 &amp;mgr; l der Bindungsreaktion zu der gewaschenen Ni-NTA-Harz und Inkubieren in einem Rundschüttler für 30 min. </li><li> Zentrifugieren bei 100 g für 2 min, und entfernen Sie den Überstand (ungebundene DNA). 100 l Waschpuffer, Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen und Zentrifuge bei 100 g für 2 min. Überstand entfernen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal. </li><li> Mit 35 &amp;mgr; l Elutionspuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol) zum Harz und vortexen. Inkubieren auf der Bank bei RT für 5 min. Zentrifugieren bei 100 g für 2 min. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und Etikett wie das Protein-gebundenen DNA-Fraktion. </li><li> Fügen auch 35 ul des Elutionspuffers mit dem Eingang DNA. </li><li> Reinige den Eingangs-und die Protein-gebundenen DNA-Fraktionen unter Verwendung eines PCR-Reinigungskits. </li></ol></li><li> Gesamte Genom verstärken die Ein-und Protein-gebundener DNA-Proben. <ol><li> Werden 10 ul der Eingangs-und Protein-gebundenen DNA-PCR-Röhrchen zu trennen. 1 ul 10x Fragmentation-Puffer, 2 ul Bibliothek Präparationspuffer und 1 ul Bibliothek Stabilisierungslösung zu jeder Probe. Durch Vortexen mischen. Hitze in einem Thermocycler bei 95 ° C für 2 min, und Chill auf Eis. Hinweis: Der Ausgangsbetrag der DNA sollte mindestens 10 ng um zu vermeiden, die Einführung Verstärkung Bias sein. </li><li> 1 ul der Bibliothek Vorbereitung Enzyme, mischen durch Pipettieren, und Inkubation im Thermocycler bei 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C für 20 min, 75 ° C / 5 min, Und halten bei 4 ° C </li><li> Zu jedem Röhrchen hinzugefügt 47,5 &amp;mgr; l Wasser, 7,5 ul 10x-Amplifikation Master-Mix und 5 ul Polymerase. Gut mischen und Wärme bei 95 ° C / 3 min, gefolgt von 20 Zyklen von 94 ° C/15 sec, 65 ° C / 5 min. Halten Reaktionen bei 4 ° C </li><li> Reinige die amplifizierte DNA-Proben unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kit und DNA-Konzentration spektrophotometrisch messen. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, Zielanreicherung in der Protein-gebundener DNA mit Hilfe der qPCR <ol><li> Design-qPCR-Primer 200 bp der stromaufwärts gelegenen Bereich der EMSA-prüft Zielgens (DVU3025) mit jedem frei zur Verfügung Primer-Design-Software zu verstärken. </li><li> Bis dreifach qPCR Reaktionen für jede DNA-Vorlage mit jedem Primer-Set ein. Bereiten Sie ein Master-Mix für jedes Primer-Set. 1x Master-Mix enthält 10 ul 2x SYBR Green qPCR-Mix, 0,5 uM von jedem Primer und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 18 ul. Aliquot 18 ul des Master-Mix pro Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. </li><li> DILUTe das verstärkte und gereinigt Eingangs-und Protein-gebundener DNA-Proben zu 5 ng / ul mit Wasser und verwenden als DNA-Vorlage. In 2 ul DNA-Vorlage in die Vertiefungen. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem extrem klare qPCR Siegelfolie, Spin-down-Platte in einer Zentrifuge bei 200 xg / 1 min. Zeigen Platte in Echtzeit qPCR Maschine. Zyklus wie folgt unter Verwendung der zugehörigen Software qPCR: 95 ° C / 1 min, 40 Zyklen von 95 º C/10 sec, 59 º C/15 sec, 70 º C/35 sec. </li><li> Auch bis dreifacher Ausfertigung qPCR-Reaktionen mit Primern gesetzt zu den vorgelagerten Regionen eines nicht verwandten Gen (Negativkontrolle) zu verstärken. </li><li> Berechnen &amp;Dgr; T durch Subtrahieren C T-Wert von proteingebundenen DNA von dem der Ausgangs-DNA. Berechnen fache Anreicherung des Zielgens in der DNA-Protein-gebundenen als 2 &amp;Dgr; C T. Hinweis: Wenn der Ziel upstream-Region wurde in der Protein-gebundener DNA gegen den Eingang DNA angereichert ist, zeigt dies, dass die Bindungsreaktionen und Affinitätsreinigung waren successful. Fahren Sie mit Schritt 4 fort. Wenn Anreicherung der Ziel-Region stromaufwärts wurde nicht beobachtet, wiederholen Sie die Bindungsreaktionen (Schritt 3.1) mit verschiedenen Proteinmenge. </li></ol></li></ol> 4. DNA Labeling-und Array-Hybridisierung <ol><li> Label-Eingabe-DNA mit Cy3 und Cy5-DNA mit Enriched Anmerkung: Cy3-und Cy5-Farbstoffe sind lichtempfindlich und sollte darauf geachtet werden Lichtexposition auf ein Minimum zu halten. <ol><li> Mischen Sie 1 ug DNA mit 40 ul Cy3/Cy5-labeled 9-mers und die Lautstärke anpassen, um 80 ul mit Wasser. </li><li> Hitze denaturiert bei 98 ° C für 10 min im Dunkeln (in einem Thermocycler). Schnellkühl auf Eis für 2 min. </li><li> Add 2 ul Klenow-Polymerase (3&#39;-5&#39;-exo - 50000 U / ml), 5 mM dNTPs und 8 &amp;mgr; l Wasser zu jedem Reaktions, gut mischen, und bei 37 ° C für 2 h im Dunkeln (in ein Thermocycler). </li><li> In EDTA bis 50 mM, um die Reaktion und NaCl-Lösung auf 0,5 M. stoppen </li><li> Über Proben zu 1,5 ml Röhrchen containing 0,9 Volumen Isopropanol, Inkubation im Dunkeln für 10 min und Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min. Das Pellet sollte rosa für Cy3-markierte DNA und blau für Cy5-markierte DNA sein. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 80% Ethanol (500 ul) und Zentrifugation bei 12.000 × g für 2 min. Klima trockenen Pellets für 5-10 min im Dunkeln. Hinweis: Die Pellets können bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Pellet in 25 ul Wasser. Messen Sie die DNA-Konzentration spektrophotometrisch. </li><li> Pool zusammen 6 ug jeder der Cy3-und Cy5-markierte DNA in einem 1,5-ml-Röhrchen und Vakuumtrocken in einer Zentrifuge bei schwacher Hitze in der Dunkelheit (decken den Zentrifugendeckel, wenn es transparent ist). Hinweis: Pellets kann bei -20 ° C bis bereit für die Hybridisierung gespeichert werden. </li></ol></li><li> Microarray-Hybridisierung <ol><li> Drehen Sie den Hybridisierungssystem auf 3-4 Stunden vor der Verwendung und die Temperatur auf 42 ° C </li><li> Bereiten Sie eine Hybridisierungslösung Master-Mix, so dass 1x Lösung enthält 11,8 ul 2x Hybridirung Puffer, 4,7 ul Hybridisierung Komponente A und 0,5 ul Ausrichtung Oligo. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 5 ul Wasser. Add 13 ul dieser Mischung auf die Probe. Vortex für 15 Sekunden, Inkubation bei 95 ° C in einem Trocken Bad für 5 min. Halten Proben bei 42 ° C in der Hybridisierungssystem bis zum Laden bereit. </li><li> Vorbereitung der Mikroarray-Objektträger-Mischeranordnung gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Setzen Sie den Mixer-Schlittenanordnung innerhalb des Hybridisierungssystems. Last 16 ul Probe in die Einfüllöffnung abdichten Ports mit einer Klebefolie, drehen Mischen auf in dem System, und hybridisieren für 16-20 h bei 42 ° C. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer I (250 ml), II (50 ml) und III (50 ml) durch Verdünnen der 10x kommerziell verfügbaren Puffer in Wasser, und jeweils 1 mM DTT hinzufügen. Warme Puffer I auf 42 ° C </li><li> Schieben Sie die Mixer-Folie in einem Demontagewerkzeug, Ort und in einer Schale mit warmem Puffer I. Peel der Mischer aus, während kräftig shnter den Demontagewerkzeug von Hand. </li><li> Zeigen Sie die Folie in einen Behälter mit 50 ml Waschpuffer I und kräftig schütteln für 2 min mit der Hand. </li><li> Transferschlitten in einen zweiten Behälter mit 50 ml Waschpuffer II und kräftig schütteln für 1 min mit der Hand. </li><li> Transferschlitten in einen dritten Behälter mit 50 ml Waschpuffer III und kräftig schütteln für 15 Sekunden von Hand. </li><li> Blot schnell die Ränder der Folie auf ein Papiertuch und legen in einer Dia-Rack. Zentrifugieren bei 200 g für 2 min, um die Diashow zu trocknen. Legen Sie innerhalb Dia Fall, wickeln Sie es mit Folie, und speichern Sie in einem Exsikkator. </li></ol></li><li> Scannen des Array <ol><li> Den Objektträger in der Microarray-Scanner nach den Anweisungen des Instruments. </li><li> Verwenden Sie eine Scanner-Software, um die Wellenlängen 532 nm = Cy3 und Cy5 = 635 nm eingestellt, und die ersten Photomultiplier Gewinne zwischen 350 und 400. </li><li> Vorschau auf die Folie, um das Array auf der Folie zu finden. Wählen Sie das Array-Bereich für das Scannen. </li&gt; <li> Scannen Sie den Array und stellen die Photomultiplier-Einstellungen, so dass die Array-Funktionen sind meist gelb. Das Histogramm sollte die rote und grüne Kurven überlagert oder so nah wie möglich beieinander zu zeigen. Die Kurven sollten über den 10 -5 normalisierte zählt bei Sättigung beenden. </li><li> Sparen Sie separat beide 532 und 635 nm Bilder. </li></ol></li><li> Array-Datenanalyse <ol><li> Importieren Sie die Bilder in ein Array-Analyse-Software. Mit der Software erstellen Sie zwei Paar Berichte (. Paar) für jedes Array (für Cy3 und Cy5-Bilder). Neues skalierte Protokoll 2-Verhältnis Dateien mit den Paar-Dateien. Verwenden Sie log 2 Verhältnis Dateien für Spitzen mit einem Schiebefenster von 500 bp suchen. Karte des Spitzen Loci zu den vorgelagerten Bereiche des Gen-Targets. </li><li> Prüfen Sie, ob der positive Ziel (bestimmt mit EMSA und qPCR, DVU3025 in diesem Beispiel bestätigt) innerhalb der oberen Spitzen erscheint. Hinweis: Wenn das positive Ziel ist nicht unter den Top-Hits, ist es möglich, dass die RR unter consideration mehrere Gen-Targets und replizieren DAP-Chips durchgeführt werden kann und die Spitzen, die für alle Wiederholungen verwendet werden, um eine Zielliste erzeugt. </li></ol></li></ol> 5. Binding Site Motiv Vorhersage und Validierung <ol><li> Rufen Sie Sequenzen für Upstream-Regionen (400 bp) für die Top-Gen-Targets wie DAP-Chip-Analyse erzeugt. Bewerben MEME dieser Sequenzen durch Mikroben Online (meme.nbcr.net), um Motive vorherzusagen. Hinweis: Enhancer-Bindungsproteine ​​wie sigma54 abhängigen Regler können mehrere hundert Basenpaare stromaufwärts von der Startstelle zu binden. Für andere Transkriptionsregulatoren eine kürzere Region wie 200 bp stromaufwärts ausreichen. </li><li> Design-Ober-und Unter DNA-Oligomere, die die vorhergesagte Bindungsstelle Motiv von 10 Basen an beiden Enden flankiert enthalten. Bestellen Sie den oberen Strang 5 &#39;biotinyliert. </li><li> Mischen der oberen und unteren Strang Oligos Verhältnis 1:1,5 in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 50 mM NaCl inein Gesamtreaktionsvolumen von 20 ul in PCR-Röhrchen. Hitze auf 95 ° C für 5 min in einem thermischen Cycler, gefolgt von langsamem Abkühlen auf 25 ° C. Verdünnen Sie das Zehnfache und die Verwendung als Wildtyp-dsDNA-Substrat für die EMSA. </li><li> Vorbereitung modifizierten Substraten unter Verwendung der gleichen Schritte wie oben, aber Design Oligomere 4-6 Substitutionen in der konservierten Basen der Bindungsmotiv tragen. </li><li> Richten Sie Bindungsreaktionen mit dem RR und dem Wildtyp-oder modifizierte Substrate und untersuchen mittels EMSA, wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Hinweis: Die vorhergesagte Motiv wird validiert, wenn die RR bindet den Wildtyp-Substrat, aber nicht die modifizierte ein. </li></ol> 6. Erhaltung der Motif in anderen verwandten Bakterienarten <ol><li> Wählen Genome von Interesse, dass Orthologe DVU3023 enthalten. Erhalten Folge und Anmerkungsdateien für den Genomen von der NCBI-Website. </li><li> Verwenden Sie eine Programmiersprache wie Perl-Skripte, die die Motiv-Sequenzen aus der DAP-Chip-Ziele verwenden, um eine pos bauen schreibenition gewichteten Matrix und verwenden Sie die Matrix, in anderen sequenzierten Genomen vorhanden ähnliche Motive punkten. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offen zu legen.

Die hier beschriebene DAP-Chip-Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Gen-Targets für mehrere RRS in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7, von denen eine hier als repräsentatives Ergebnis gezeigt zu bestimmen. Für RR DVU3023, die Wahl eines Kandidaten-Gen Ziel war einfach. DVU3025 ist unmittelbar stromabwärts von der RR-Gen und die RR-und Zielgene werden in mehreren Desulfovibrio-Arten konserviert sind, und zusätzlich eine vorhergesagte DVU3025 sigma54-abhängigen Promotor. Die ...

Die Fähigkeit der Bakterien zu überleben und zu gedeihen ist kritisch davon abhängig, wie gut sie in der Lage zu erkennen und zu reagieren, um Störungen in ihrer Umgebung sind, und diese wiederum ist abhängig von der Signalübertragungssysteme. Die Anzahl der Signalanlagen ein Bakterium kodiert wurde seine &quot;mikrobielle IQ&quot; bezeichnet und kann ein Hinweis sowohl Variabilität der seine Umwelt und seine Fähigkeit, mehrere Signale zu erfassen und eine Feinabstimmung seiner Antwort 1 sein. Zwei-Komponenten-Signalübertragungssystemen (ASR) sind die am weitesten verbreiteten Signalsysteme von Bakterien verwendet werden, und sie bestehen aus einem Histidin-Kinase (HK), der das externe Signal erfasst und überträgt über die Phosphorylierung an ein Effektor-Antwortregulator (RR) 2 bestehen. RR kann eine Vielzahl von Ausgangsdomänen und damit unterschiedliche Effektor-Modi, aber die häufigste Antwort Transkriptionsregulation über eine DNA-bindende Domäne 1. Die erfassten Signale und die entsprechenden Funktionen des Vast Mehrheit der FKS vor unbekannt. Obwohl in vivo-Methoden wie Chip-Chip werden routinemäßig für die Bestimmung von genomischen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren 3 verwendet wird, kann sie nur für bakterielle Zweikomponentensystem-Ressourceneinträge verwendet, wenn die Aktivierungsbedingungen oder Signale bekannt sind. Oft sind die Umweltreize, die einen TCS aktivieren sind härter als ihre Gen-Targets zu bestimmen. Die in vitro-Mikroarray-basierten hier beschriebene Assay kann verwendet werden, um die Gen-Targets wirksam und schnell zu bestimmen und vorherzusagen Funktionen FKS werden. Dieser Assay nutzt die Tatsache, dass RRS phosphoryliert und somit mit kleinen Molekülen wie Acetyl Geber Phosphat 4 in vitro aktiviert. Bei diesem Verfahren, genannt DAP-DNA-Chip für affinitätsgereinigtem-Chip (1), das RR-Gen von Interesse mit einem His-Tag kloniert, in E. coli, und eine anschließend gereinigt markierte Protein wird bi erlaubtnd genomische DNA geschert. Die an Protein gebundene DNA wird dann durch Affinitätschromatographie-Aufreinigung angereichert werden die angereicherten und Input-DNA amplifiziert, fluoreszenzmarkierten, gepoolt und auf ein Array, das individuelle Fliesen auf den Organismus von Interesse (1) hergestellt wird, hybridisiert. Mikroarray-Experimenten unterliegen Artefakte und daher zusätzliche Schritte verwendet werden, um den Assay zu optimieren. Ein solcher Schritt ist, zu versuchen, ein Ziel zu bestimmen, unter der RR-Studie unter Verwendung von elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) (siehe Arbeitsablauf in Fig. 2). Dann, nach der Bindung an genomische DNA und die DAP Schritte, die proteingebundene und die Input-DNA durch qPCR untersucht, ob die positive Ziel in der proteingebundenen Fraktion gegenüber dem Eingangsfraktion angereichert, wodurch bestätigt optimaler Bindungsbedingungen für die RR (Fig. 2). Anordnung nach Hybridisierung werden die Daten analysiert, um Peaks höherer Intensität anzeigendes Signal genomischen Loci zu finden, wo das Protein had gebunden. Funktionen für die RR auf der Grundlage der vorhergesagten Gen-Targets erhalten werden. Die Ziel-Loci verwendet werden, um Bindungsstelle Motive, die dann experimentell mit EMSA (Abbildung 2) bestätigt werden vorherzusagen. Die Funktionsvorhersagen und Gen-Targets für die RR kann dann verlängert werden, um eng verwandte Arten, die orthologen RRs kodieren durch das Scannen dieser Genome für ähnliche Bindungsmotive (Abbildung 2). Der DAP-Chip-Verfahren kann eine Fülle von Informationen für ein TCS wo vorher da war keiner zu liefern. Das Verfahren kann auch für jede Transkriptionsregulator verwendet werden, wenn das Protein gereinigt und DNA-Bindungsbedingungen bestimmt werden können, und für jeden Organismus von Interesse mit einer Genomsequenz vorhanden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Die DNA-Affinitäts-gereinigten-Chip-(DAP-Chip)-Strategie 7. Die RR-Gens aus dem Organismus von Interesse ist mit einem Carboxy-terminalen His-Tag in einen E. kloniert coli Expressionsstamm. Gereinigte His-markierte Protein durch Phosphorylierung mit Acetylphosphat aktiviert und mit geschnittenen genomischen DNA gemischt. Ein Aliquot der Bindungsreaktion als Eingangs DNA gespeichert, während der Rest der Affinitätsreinigung unter Verwendung von Ni-NTA-Harz unterzogen. Der Eingang und der RR-gebundene DNA sind ganze Genom amplifiziert und mit Cy3 bzw. Cy5 markiert. Die markierte DNA wird zusammen gebündelt und zu einem Kachelanordnung, die dann analysiert wird, um die Gen-Targets zu bestimmen, hybridisiert. Abbildung modifiziert und neu aufgelegt mit der Creative-Commons-Lizenz von 7. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Zusammenfassung der Workflow. Für gereinigt getaggt protein, beginnen mit der Bestimmung eines Ziel mittels EMSA. Lassen Protein, um genomische DNA und DNA-Affinität-Entschlackung (DAP) und des gesamten Genoms binden verstärken (WGA) angereichert und die Input-DNA. Wenn ein Ziel-Gen bekannt ist, verwenden qPCR um sicherzustellen, daß der bekannte Target in der proteingebundenen Fraktion angereichert. Wenn kein Ziel ermittelt werden konnte, gehen Sie direkt zur DNA-Markierung und Array-Hybridisierung. Wenn Anreicherung durch qPCR konnte nicht beobachtet werden, wiederholen Sie den Protein-gDNA-Bindung und DAP-WGA Schritte mit unterschiedlichen Proteinmengen. Verwenden Array-Analyse Spitzen finden und sie den Zielgene. Verwenden Sie die vorgelagerten Bereiche des Zielgene zu Bindungsstelle Motive vorherzusagen. Bestätigen Sie die Motive experimentell unter Verwendung EMSAs. Verwenden Sie das Motiv, die Genome verwandter Arten Orthologe des RR-Studie unter Codierung zu scannen, und vorherzusagen, Gene in diesen Zielarten als gut. Basierend auf den Gen-Targets erhalten werden, kann die physiologische Funktion des RR und ihre Orthologe vorhergesagt werden. Abbildung modifiziert und neu aufgelegt mit der kreativen commons Lizenz von 7.

<table><tbody><tr><td>HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (FPLC instrument)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting column</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel extraction kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternately, you can pour your own gel.</td></tr><tr><td>Nylon membrane</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker Model XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose resin</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td><td>For quantitation of DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td></tr><tr><td>PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-well clear low profile PCR microplate</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>Any real time PCR system may be used</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>Any PCR clean up kit may be used</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5-labeled nonamers</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3&#039;-5&#039; exo&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization system</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.</td></tr><tr><td>Custom printed microarrays and mixers</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A microarray scanner</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>This model has been replaced by superior ones</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro microarray software</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

In-vivo-Methoden wie Chip-Chip sind etablierte Techniken zur globalen Zielgene für Transkriptionsfaktoren zu bestimmen. Von begrenztem Nutzen sind sie jedoch in der Erforschung bakteriellen Zwei-Komponenten-Regulationssysteme mit charakterisierter Aktivierungsbedingungen. Solche Systeme regulieren die Transkription nur, wenn in Gegenwart von eindeutigen Signalen aktiviert. Da diese Signale oft unbekannt sind, können in diesem Video-Artikel beschriebene in vitro-Mikroarray-basierten Verfahren verwendet werden, um Gen-Targets und Bindungsstellen für Antwortregulatoren zu bestimmen. Diese DNA-Affinitäts-gereinigten-Chip-Verfahren kann für jede gereinigte Regler in jedem Organismus mit einem sequenzierten Genom verwendet werden. Das Protokoll beinhaltet wodurch die gereinigte markierte Protein zu scher genomische DNA binden und Affinitätsreinigung des proteingebundenen DNA, gefolgt von der fluoreszierenden Markierung der DNA und Hybridisierung an eine individuelle Unterteilung Array. Vorhergehenden Schritte, die verwendet werden, um den Test zu optimieren Spezifikationen werden könnenc Regler werden ebenfalls beschrieben. Die von der Array-Daten-Analyse erzeugten Peaks werden verwendet, um Bindungsstelle Motive, die dann experimentell validiert werden vorherzusagen. Die Vorhersagen Motiv kann weiter verwendet werden, um Gen-Targets orthologer Antwortregulatoren in nahe verwandten Arten zu bestimmen. Wir zeigen die Anwendbarkeit dieser Methode durch Bestimmung der Gen-Targets und-Bindungsstelle Motive und damit die Vorhersage der Funktion für ein sigma54 abhängige Antwortregulator DVU3023 in der Umwelt Bakterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Das oben genannte Verfahren wurde angewendet, um die globalen Gen-Targets der RRS in der Modellsulfatreduzierenden Bakteriums Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 zu bestimmen. Dieser Organismus besitzt eine große Anzahl von FKS über 70 RRs dargestellt, was auf die Vielzahl von möglichen Signalen, die es erfaßt und darauf reagiert. In-vivo-Analysen der Funktionen dieser Signalanlagen schwer, da ihre Signale führen und somit ihre Aktivierungsbedingungen sind unbekannt. Hier wurde die D...

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DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.7K Aufrufe.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen. 

Serie: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Forschung

Genetik

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Biotechnik

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Immunologie und Infektion

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Biologie

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays to study gene expression, but most are limited in terms of providing an overall picture of the expression of the whole transcriptome. DNA microarrays offer a fast and economic research technology, which gives a full overview of global gene expression and have a vast number of applications including identification of novel genes and transcription factor binding sites, characterization of transcriptional activity of the cells and also help in analyzing thousands of genes (in a single experiment). In the present study, the conditions for bacterial transcriptome analysis from cell harvest to DNA microarray analysis have been optimized. Taking into account the time, costs and accuracy of the experiments, this technology platform proves to be very useful and universally applicabale for studying bacterial transcriptomes. Here, we perform DNA microarray analysis with Streptococcus pneumoniae as a case-study by comparing the transcriptional responses of S. pneumoniae grown in the presence of varying L-serine concentrations in the medium. Total RNA was isolated by using a Macaloid method using an RNA isolation kit and the quality of RNA was checked by using an RNA quality check kit. cDNA was prepared using reverse transcriptase and the cDNA samples were labelled using one of two amine-reactive fluorescent dyes. Homemade DNA microarray slides were used for hybridization of the labelled cDNA samples and microarray data were analyzed by using a cDNA microarray data pre-processing framework (Microprep). Finally, Cyber-T was used to analyze the data generated using Microprep for the identification of statistically significant differentially expressed genes. Furthermore, in-house built software packages (PePPER, FIVA, DISCLOSE, PROSECUTOR, Genome2D) were used to analyze data.

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very common in biochemistry, genetics and many other disciplines. A comprehensive overview of the technique to supplement the teaching of biochemical pathways pertaining to amino acids, peptidoglycan and the bacterial stringent response is reported in this manuscript. Two cDNAs from the model plant organism Arabidopsis thaliana that are involved in the metabolism of lysine (L,L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) and tyrosine aminotransferase (tyrB) involved in the metabolism of tyrosine and phenylalanine are highlighted. In addition, the bacterial peptidoglycan anabolic pathway is highlighted through the analysis of the UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate-meso-2,6-diaminopimelate ligase (murE) gene from the bacterium Verrucomicrobium spinosum involved in the cross-linking of peptidoglycan. The bacterial stringent response is also reported through the analysis of the rsh (relA/spoT homolog) bifunctional gene responsible for a hyper-mucoid phenotype in the bacterium Novosphingobium sp. Four examples of FCA are presented. The video will focus on three of them, namely lysine, peptidoglycan and the stringent response.

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

The validation of enzymatic activities involved in biochemical pathways can be elucidated using functional complementation analysis (FCA). Described in this manuscript is the FCA assay demonstrating the enzymatic activity of enzymes involved in the metabolism of amino acids, bacterial stringent response and bacterial peptidoglycan biosynthesis.

Funktionelle Komplementierung Analyse (FCA): A Laboratory Übung konzipiert und umgesetzt, die Lehre von Biochemical Pathways zur Ergänzung

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

Zusammenfassung

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