Diese Arbeit wurde von der NSF Research Triangle MRSEC (DMR-1121107) unterstützt.

1. ELP Expression <ol><li> Impfen 3 ml steriler Terrific Broth Medien mit einer DMSO-Stamm oder Agar-Platte Kolonie von E. coli geeignet zur Proteinexpression, das den gewünschten ELP-kodierenden Plasmid unter der Kontrolle des T7-lac-Promotor enthält. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum und bei 37 ° C über Nacht (O / N) unter ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> 1 ml des O / N-Kultur auf 1 L des Terrific Broth sterile Medium in einem 4-l-Kolben. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum und bei 37 ° C für 24 h unter ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die &quot;leaky&quot; Baseline-Ausdruck mit der T7-lac-Promotor gesehen ist ausreichend für eine hohe Expression von vielen ELPs wenn die Kultur wird für 24 Stunden inkubiert. Jedoch kann eine weitere herkömmliche Ansatz verwendet werden, wobei die Proteinexpression durch die Zugabe von 0,2-1 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) induziert wird, wenn die optische Dichte der Kultur 0,6 erreicht. </li&gt; <li> Übertragung der Kultur von dem 4-l-Kolben mit einem 1-L-Zentrifugenflasche und Zentrifuge bei 4 ° C für 15 min bei 2.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen. HINWEIS: Wenn mehr als 1 l Kultur angebaut wird sie durch das Hinzufügen eines weiteren Liter Kultur zum Pellet-und Wiederholen von Schritt 1.3 kondensiert werden. Bis zu 2 l Kultur kann in einem Zellpellet kondensiert werden. </li><li> Resuspendieren des Pellets in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Wasser oder anderen gewünschten Puffer zu 45 ml der Zellsuspension und in ein konisches 50 ml-Rohr zu erreichen. </li></ol> 2 ELP Reinigung:. Vorbereitende Schritte und erste Runde der Inverse Transition Cycling <ol><li> Beschallen den Zellpellet resuspendiert für insgesamt 9 min in Zyklen von 10 s &#39;on&#39; und 20 sec &quot;Aus&quot; bei einer Ausgangsleistung von 85 W, während die Probe auf Eis. Kurz damit die Probe auf Eis abkühlen und wiederholen Sie den 9 min Zyklus noch einmal. HINWEIS: Wenn die ELP wird erwartet, dass eine sehr geringe T t haben </sub&gt; die &quot;Aus&quot;-Intervall kann bis zu 40 Sekunden erhöht werden, um die Erwärmung der Lösung auf oberhalb T t zu vermeiden. </li><li> Transfer des Lysats in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden. </li><li> 2 ml 10% (w / v) Polyethylenimin (PEI) für jeden Liter Kultur und schütteln zu mischen. HINWEIS: PEI ein positiv geladenes Polymer, das bei der Kondensation von negativ geladenen genetische Verunreinigungen hilft. Führen Sie diesen Schritt nicht, wenn der ELP negativ geladen ist, wie das PEI auch kondensieren und entfernen Sie die ELP Produkt. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 x g. </li><li> Den Überstand in ein sauberes 50 ml Rundbodenzentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Optional &quot;backen out&quot; Schritt: Inkubation der Probe bei 60 ° C für 10 min auf Proteinverunreinigungen zu denaturieren und dann übertragen auf 4 ° C oder auf Eis, bis das ESP vollständig aufgelöst. Zentrifuge die Probe bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 x g. Den Überstand in einem clean 50 ml Rundbodenzentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt nicht, wenn ein Peptid oder Protein an die ELP fusioniert und wird voraussichtlich in den Zustand der erhöhten Wärme denaturieren. Dies kann bewirken, dass der Übergang zum Wärme ELP-irreversibel werden oder können die Aktivität des fusionierten Einheit zu zerstören. </li><li> Induzieren die ELP Übergang mit der Zugabe von kristallinem NaCl (nicht mehr als 3 M). Alternativ können Natrium-Citrat (0,3 M nicht überschreitet) für ESPs, die eine höhere T t s oder niedrigen Renditen haben verwendet werden. HINWEIS: Die Lösung sollte bewölkt drehen einmal das Salz gelöst hat, das die Phasentrennung von ELP aus der Lösung. Sehr hydrophil ELPs mit hoher T t s kann einige Grad der Erwärmung in Kombination mit der Zugabe von Salz, um die Phasentrennung des ELP in dieser vorläufigen Induktion der ELP Übergang zu induzieren. </li><li> Zentrifugieren bei Raum temperatue (RT) für 10 min bei 16.000 xg (Hot Spin). HINWEIS: Eine ELP Pellet sollte be beobachtet, dessen Größe von der Expressionsausbeute des ESP. Diese ELP Pellet auf den ersten undurchsichtig erscheinen, aber nach dem Abkühlen wird es schein erscheinen und kann in der Farbe braun sein. Das ESP-Pellet wird farbloser geworden als Reinigungserlös und Verunreinigungen entfernt werden. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 1-5 ml gewünschten Puffer zum Pellet. Das Pellet durch Pipettieren und das Röhrchen bei 4 ° C drehen Hinweis: Das erforderliche Volumen an Puffer von der Größe der Pellets ab ELP und damit die Ausbeute an ELP Expression, in dem eine ausreichende Menge des Puffers sollte hinzugefügt werden, um die Wiederauflösung der ELP Pellet zu ermöglichen. ELP mit hohem Cysteingehalt profitieren Reinigung in Wasser mit 10 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP-HCl) bei pH 7 bis Disulfid-Interaktionen mit kontaminierenden Proteine ​​zu eliminieren. ELPs mit hoher Ladungsinhalt profitieren von Reinigung bei einem pH-Wert eingestellt werden, um ihre Ladung zu neutralisieren und zu reduzieren electrostatic Wechselwirkungen mit verunreinigenden Proteinen. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten ELP-Lösung in 1 ml Aliquots in sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 × g (Kaltrotations). Eine kleine Pellet von unlöslichen Verunreinigungen sind zu beachten. </li><li> Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol> . 3 ELP Reinigung: Nachfolgende Runden von Inverse Transition Cycling <ol><li> Induzieren die ELP-Übergang mit Wärme und / oder der Zugabe von NaCl. Proben können auf einem Heizblock oder in einem Wasserbad für 15 min bei einer Temperatur oberhalb der T T inkubiert werden. Wenn jedoch die ELP an ein Protein fusioniert ist (was die Verwendung von Wärme) oder wenn die ELP eine hohe T t, die nicht mit Wärme allein erreicht werden kann, einer 5 M NaCl-Lösung zugegeben werden tropfenweise zu induzieren ELP Übergang. HINWEIS: Die Lösung sollte trüb, was auf die Phasentrennung des ELP aus der Lösung. </li><li&gt; Zentrifuge für 10 min bei 16.000 xg (Hot Spin). Wenn Wärme in Schritt 3.1 verwendet, führen diese Zentrifugationsschritt bei einer Temperatur oberhalb derjenigen, die benötigt wurde, um die ELP Übergang zu induzieren. Wenn allein NaCl wurde in Schritt 3.1 verwendet, führen Sie diesen Schritt Zentrifugation bei RT. HINWEIS: Eine ELP Pellet zu beachten. </li><li> Überstand verwerfen, fügen 500-750 ul gewünschten Puffer und das Pellet durch Pipettieren und das Röhrchen bei 4 ° C drehen </li><li> Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 × g (Kaltrotations). Eine kleine Pellet von unlöslichen Verunreinigungen sind zu beachten. </li><li> Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Die Schritte 3.1 bis 3.5, bis keine Verunreinigung Pellet wird in Schritt 3.4 festgestellt. </li></ol> 4. Post-Reinigung Verarbeitung (optional) <ol><li> Wenn gewünscht, dialysiert die Probe gegen einen geeigneten Puffer, um überschüssiges Salz aus dem gereinigten ELP Lösung zu entfernen. HINWEIS: ELPs die lyophilisiert werden sollgegen ddH 2 OO / N bei 4 ° C dialysiert </li><li> Falls gewünscht, lyophilisieren die ELP für Langzeitlagerung durch Einfrieren der Lösung bei -80 ° C für 30 min vor der Lyophilisierung O / N. HINWEIS: Die Lyophilisierung sollte nicht für ELP mit anhängenden Proteine ​​verwendet werden. </li><li> Wenn gewünscht, wieder frei Peptid oder Protein aus einem Peptid oder Protein ELP-Fusion durch Entfernen der ELP tag: <ol><li> Verdauen das Peptid oder Fusionsprotein ELP mit biotinyliertem Protease (wie durch den Hersteller empfohlen Protease) oder mit einer Protease ELP Fusions entsprechend der Proteasestelle gentechnisch zwischen dem Peptid oder Protein und ELP gestalten. </li><li> Entfernen Sie gegebenenfalls die biotinylierten Protease unter Verwendung von Streptavidin-modifizierten Perlen (wie von der Protease-Anbieter empfohlen). </li><li> Induziert den Übergang des ELP abgespalten und / oder Protease-ELP-Fusions durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaCl-Lösung. </li><li> Zentrifuge bei RT für 10 min bei 16.000 x g. HINWEIS: Eine ELP Pellet zu beachten. </li><li>Sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie die ELP Pellets. Dialysiere den Überstand gegen einen gewünschten Puffer oder eine Filterzentrifuge, einen Pufferaustausch durchzuführen, um die hohe Salzkonzentration von der reinen Peptid-oder Proteinlösung zu entfernen. </li><li> Bestätigen Sie die vollständige Spaltung der freien Peptid oder Protein aus der ELP-Tag durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). </li></ol></li></ol> 5 Charakterisierung:. SDS-PAGE <ol><li> Vorbereitung ELP Proben für SDS-PAGE durch Mischen von 10 ul ELP in Wasser mit 10 ul Probenpuffer, der 2-Mercaptoethanol verdünnt. HINWEIS: 40 ug von ELP ist oft ausreichend, um die Größe und Reinheit des ELP Produkt zu testen. </li><li> Inkubieren der Probe bei 100 ° C für 2 min und geladen auf einem Polyacrylamid-Gel zusammen mit einem passenden Proteinleiter dann. </li><li> Die Elektrophorese bei 180 V, bis der Farbstoff das Ende des Gels (etwa 45 min) nähert. </li><li> Färben Sie dieGel mit 0,5 M CuCl 2-Lösung für 5 min, während die Schwing. HINWEIS: ELPs werden typischerweise nicht durch Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung sichtbar gemacht, wie einige ELP-Sequenzen nicht mit diesem Farbstoff interagieren. Coomassie Brilliant Blue interagiert primär mit Argininresten und interagiert mit anderen schwach basischen Reste Histidin-und Lysin-Resten und aromatischen-Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin 26. Somit ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt werden, wenn ihre Primärsequenz eine ausreichende Anzahl dieser spezifischen Resten. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die MW der ELP-Band entspricht der theoretischen MW von der ELP-Gen und keine Fremdschadstoff Bänder vorhanden sind, erwartet. ANMERKUNG: Manche ELPs migrieren mit einem scheinbaren MW bis zu 20% höher als erwarteten MW 9, 27. </li></ol> 6. Charakterisierung:. Matrix-assisted Laser Desorption /Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) <ol><li> Vorbereiten eines ELP-Lösung in 50% wässrigem Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, um eine ELP-Konzentration von etwa 25 uM zu erreichen. HINWEIS: Diese Lösung sollte frei von Salz, so ELP müssen gegen H 2 O dialysiert werden nach der Reinigung. </li><li> Vorbereitung einer Matrixlösung, gesättigter Sinapinsäure in 50% wässrigem Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure. </li><li> 1 ul der Lösung ELP bis 9 &amp;mgr; l der Matrix-Lösung, um ein ELP-Konzentration von ungefähr 2,5 pmol / &amp;mgr; l zu erreichen. ANMERKUNG: Diese Mischung kann weiter mit Matrixlösung verdünnt werden, um die MALDI-TOF-Signal zu optimieren. </li><li> Kaution 1-2 ul ELP-Matrix-Gemisch auf eine Metallplatte MALDI und lassen Sie den Ort vollständig trocknen. </li><li> 5-10 erhalten Spektren mit MALDI-TOF, um die Masse zu bestimmen, um Verhältnis (m / z) des ESP zu laden und schließen die gemessene MW. </li></ol> 7. Characterization: Temperatur-programmierte Turbidimetrie und dynamische Lichtstreuung <ol><li> Bestimmen Sie die T t der ELP durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung: <ol><li> Verdünnungsreihe (z. B. 5-100 &amp;mgr; M) von ELP-Lösungen im gewünschten Puffer. </li><li> Verwendung eines temperaturgesteuerten UV-Vis-Spektrophotometer, wird die optische Dichte (OD) bei 350 nm über einen Bereich von Temperaturen (z. B. 20-80 ° C) bei einer Aufheizrate von 1 ° C / min. HINWEIS: Wenn kein Anstieg der OD gesehen kann der T t die obere Temperaturgrenze des Geräts übersteigt. Die scheinbare T t kann durch die Zugabe von NaCl verringert werden. Starten Sie bei 1 M NaCl und erhöhen in Schritten von 0,5 M bis der ELP Übergang innerhalb einer messbaren Temperaturbereich festgestellt. </li><li> Verifizierung der Reversibilität der ELP Übergang durch Messung der Abnahme der OD über den gleichen Temperaturbereich mit einer Abkühlungsgeschwindigkeit von 1 ° C / min. </li><li> Bestimmen Sie die T t des homoPolymer ELP durch Identifizieren der Wendepunkt der Trübung Profil (OD aufgetragen gegen die Temperatur). ANMERKUNG: Diese Temperatur kann leicht von der Ableitung der OD-Kurve, wobei die Temperatur, die dem Maximum der Ableitung wird als t definiert werden. Komplexere ELP Architekturen komplizierter Trübung Profile angezeigt und sollte weiter untersucht werden, wie in Abschnitt 7.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Weitere Charakterisierung von ESPs, die komplexer thermischen Eigenschaften (zB ELP Diblock-Copolymere, die Selbstorganisation in kugelförmige Mizellen) angezeigt wird durch dynamische Lichtstreuung (DLS) erreicht: <ol><li> Bereiten Sie einen ELP-Lösung in der gewünschten Puffer und die Probe durch einen Filter mit einer Porengröße von 20 bis 450 nm. HINWEIS: Die Auswahl der Filterporengröße wird auf der Anwesenheit, Größe und Stabilität von ELP Baugruppen in Lösung ab. Die kleinste führbar Filterporengröße ist bevorzugt, Verunreinigungen, wie zu eliminierenStaub, die die Qualität der DLS-Messungen verringern. Eine größere Filterporengröße verwendet, wenn bedeutende Widerstand erlebt, wenn Gabe eines ELP-Lösung durch kleinere Filterporengrößen werden. </li><li> Messung des hydrodynamischen Radius (R H) über einen Bereich von Temperaturen, die zu einer Region von Interesse in dem Profil identifiziert Trübung entspricht. HINWEIS: ELP Unimere haben typischerweise einen R H &lt;10 nm, Nanopartikel-Baugruppen haben ein R H ~ 20-100 nm und Aggregate eine R H&gt; 500 nm aufweisen. Jeder Anstieg der R H sollte zu einer Erhöhung der OD bei 350 nm durch UV-Vis-Spektrophotometrie als Funktion der Temperatur, die proportional zu der Größe der Teilchen, gemessen entsprechen. </li></ol></li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

ELPs bieten eine kostengünstige und Chromatographie freie Mittel der Reinigung durch Ausbeutung ihrer stimuliresponsiven Phasenverhalten. Dieser Ansatz nutzt die LCST-Verhalten von ESPs und Peptid-oder Protein ELP-Fusionen, sowohl lösliche und unlösliche Verunreinigungen nach der Expression von genetisch kodierten ELPs in E. beseitigen coli. Diese Leichtigkeit der Reinigung verwendet werden, um ELP für eine Vielzahl von Anwendungen zu erzeugen, oder für die Reinigung von rekombinanten Peptide oder Proteine, in denen die ELP als Reinigungs-Tags, die mit Nachreinigung der Verarbeitung entfernt werden kann, handeln nutzt werden. ELP Reinigung beinhaltet vorbereitenden Schritte, um die Lyse von E. coli und entfernen genomischen und unlösliche Zelltrümmer aus dem rohen Lysat Kultur (Fig. 1), gefolgt von der Entfernung der restlichen löslichen und unlöslichen Verunreinigungen durch ITC (Abbildung 2). Zentrifugation nach dem Auslösen der ELP Übergang von der ADDIvon Wärme oder Salz trennt die ELP von löslichen Verunreinigungen im Überstand, in einem Schritt bezeichnet eine heiße Spin. Nach Resolubilisieren der ELP wird die Lösung wieder auf eine Temperatur unterhalb der T t zentrifugiert, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen Pellet wird in einem Schritt ein Kaltrotations bezeichnet. Abwechselnd heiß und kalt Spins verbessert die Reinheit des ELP-Lösung mit jedem Zyklus, gegen einen kleinen Aufpreis zu erhalten. Reinigungsausbeuten hängen von ELP-T t, die Länge und verschmolzen Peptide oder Proteine. Normalerweise ergibt dieses Protokoll 100 mg gereinigtes ELP pro Liter E. coli-Kultur, aber die Renditen können bis zu 500 mg / l zu erreichen bis Die endgültige Reinheit der ELP Produkt durch SDS-PAGE (Fig. 3) bestätigt. Der MW des gereinigten ELP sollte eng mit der theoretischen MW von der ELP-Gen kodiert entsprechen. Wandern jedoch einige ELPs in SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von bis zu 20% höher als erwarteten MW 9, 27. Genauere Analyse der ELPMW kann durch MALDI-TOF-MS, das auch zusätzliche Informationen über die Reinheit des ELP Produkt zusammen mit orthogonalen analytische Techniken, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Verfügung stellen kann erreicht werden. Nach der Reinigung wird die ELP T t durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung gemessen. Diese Technik überwacht die OD eines ELP-Lösung, während die Temperatur erhöht wird. Die T t ist konzentrationsabhängig, so ist es ratsam, eine Konzentrationsreihe, die für die beabsichtigte Anwendung des ESP zu charakterisieren. Für ELP Homopolymere die Trübung Profil eine einzige starke Zunahme, die der ELP Übergang entspricht aus Unimeren bis Mikrometermaßstab Aggregate (Abbildung 4A). Die T t wird als die Temperatur entsprechend dem Wendepunkt der Trübung Profil genau dem Maximum der ersten Ableitung der OD hinsichtlich Temperatur bestimmt wird. Die Reversibilität derELP Phasenübergang wird durch eine Abnahme der OD bestätigt die Basislinie, wenn die Temperatur unterhalb der T t (4B) verringert. Die Trübung Profil mit zunehmender und abnehmender Temperaturrampen werden in Größe und Kinetik durch Absetzen des ELP Koazervate und variable Hysterese von ELP Resolubilisierung abweichen. Peptid oder Protein ELP-Fusionen ähnlich LCST-Verhalten aufweisen, auf diese Weise, wobei das Peptid oder Protein fusioniert an die ELP beeinflußt die T t. Für ELP Protein-Fusionen der Übergang ist reversibel unter der Schmelztemperatur des Proteins. Während temperaturprogrammierte Turbidimetrie ist ein ausgezeichnetes Verfahren für die anfängliche thermische Charakterisierung von ELP-Produkte, alternative Techniken, wie z. B. Differential Scanning Calorimetry (DSC), kann auch verwendet werden, um die ELP-T t zu messen. ELPs mit komplexeren Architekturen Ausstellung komplizierter thermische Verhalten, das auch durch Temperatur-progra charakterisiert werden könnenMMEd Trübungsmessung. ELP-Diblock-Copolymere, beispielsweise, eine charakteristische Trübung Profil entsprechend ihrer Temperatur-gesteuerte Selbstorganisation in sphärische Mizellen in ihrer kritischen Temperatur Mizellenbildung. Für solche ELP Diblockcopolymere der OD 0,1-0,5 Einheiten über der Grundlinie, die den Übergang von Unimere Micellen, wonach eine starke Zunahme der OD (bis 2,0 Einheiten über dem Ausgangswert) bei einer höheren Temperatur zeigt die Bildung von Mikrometer-Maßstab erhöht typischerweise zuerst Aggregate (5A). Weitere Informationen über Temperatur ausgelöste selbstorganisierten Strukturen ELP mit DLS, eine Technik, die die R-H von ELP Baugruppen misst in Lösung erhalten. Änderungen in der R H zustimmen eng mit Veränderungen in OD mit Trübungsmessung (5B) gemessen. ELP Unimere typischerweise eine H R &lt;10 nm, während Nanopartikel Baugruppen weisen eine R H ~ 20-100 nm und Aggregate weisen eine R H </sub &gt;&gt; 500 nm aufweisen. Weitere Informationen über selbstorganisierte ELP Nanopartikel wie Aggregationszahl und Morphologie, können durch statische Lichtstreuung oder kryogene Transmissionselektronenmikroskopie 17, 23, 29 erhalten werden. Durch die Einstellbarkeit der ELP thermischen Eigenschaften wird ein Bereich von T t s von verschiedenen Designs ELP erhalten. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass die inhärente T t wird die Optimierung des Reinigungsprotokoll für jeden ELP, wo extrem niedrigen oder hohen T t s die meisten Änderungen an diesem Standardprotokoll erfordern beeinflussen. ELPs mit extrem hohen Übergangstemperaturen können für die Reinigung mit diesem Ansatz ungeeignet sein. Wenn das Design neuartiger ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen kann die thermische Antwort des ELP gefährden, kann eine einfache Histidin-Tag für alternative Reinigung durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie enthalten. ZusätzlichEigenschaften des ELP-Sequenz kann verlangen, Modifikation dieses Protokoll, wenn der Gast Rückstand wird geladen. Manipulation des Puffers pH-Wert kann als eine Methode, um die Gesamtladung des ELP in dem Bemühen, elektrostatische Wechselwirkungen mit Verunreinigungen zu beseitigen ändern 17 verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für die speziellen Umstände des ELP-Fusionen mit Peptiden und Proteinen, wenn geeignete Maßnahmen getroffen werden, um sicherzustellen, dass der Reinigungsprozess nicht die Aktivität des fusionierten Einheit stören geeignet. Hinweise in der gesamten Protokoll über solche Änderungen dienen dazu, die Reinigung von ELP, die diese Herausforderungen in Bezug auf T t, Ladung, oder Fusions Anliegen präsentieren kann lenken. Die Reinigung von ELP durch ihre LCST-Verhalten stellt eine einfache und Chromatographie freien Ansatz, um die Mehrheit der ELP und Peptid-oder Protein ELP-Fusionen in E. ausgedrückt reinigen coli. Die hier zusammengefassten Protokoll ermöglicht die Reinigung of ELPs an einem einzigen Tag mit Hilfe von Geräten, die in den meisten biologischen Laboratorien ist. Die Leichtigkeit der Reinigung von ELP und ihre Fusionen wird, hoffen wir, ermutigen eine ständig wachsende Vielfalt der ELP Entwürfe für neue Anwendungen in den Materialwissenschaften, Biotechnologie und Medizin.

Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) stellen Biopolymere der Wiederholungspenta VPGXG wobei X die Gast Rückstand, eine beliebige Aminosäure außer Prolin. ELPs weisen untere kritische Lösungstemperatur (LCST) Phasenübergangsverhalten, so daß eine homogene Lösung ELP wird in zwei Phasen beim Erhitzen auf ihre LCST, die üblicherweise die inverse Umwandlungstemperatur (T t) in der ELP Literatur 1 bezeichnet wird trennen. Die beiden Phasen werden von einer sehr verdünnten ELP Kügelchen Phase und einer ELP reichen Sedimentphase zusammen. Das ESP reichen Sediment wird auf einer kurzen Zeitskala auf die Aggregation der ELP-Ketten in Mikrometer große Partikel, die anschließend zusammenwachsen ist. Dieses Verhalten tritt über einen Bereich von einigen Grad Celsius und ist in der Regel reversibel, wie eine homogene Lösung nach der Rückkehr auf eine Temperatur unterhalb T t gewonnen. ELPs werden typischerweise in Escherichia coli (E. coli) synthetisiert from ein künstliches Gen, das in ein Expressionsplasmid ligiert wird. Dieses Plasmid wird dann in einen transformierten E. coli-Zelllinie, die optimal für die Proteinexpression. Wir haben ausschließlich die T7-lac pET-Vektorsystem zur Expression einer Vielzahl von ELP in E. coli, obwohl andere Expressionssysteme in Hefe 2-4, 5 Pilze und Pflanzen 6-8 wurden auch von anderen Forschern genutzt. Eine Reihe von Ansätzen existieren, um genetisch konstruieren wiederholende ELP Gene, einschließlich rekursive gerichtete Ligation (RDL) 9, rekursive gerichtete Ligation von Plasmid-Rekonstruktion (Pre-RDL) 10 und überlappen Erweiterung Rolling-Circle-Amplifikation (OERCA) 11. Die Fähigkeit, ELPs auf der genetischen Ebene zu konstruieren bietet die Möglichkeit, rekombinante DNA-Techniken zu verwenden, um ELP mit einer Vielzahl von Architekturen (z. B. Monoblöcke, Diblock, Triblock, etc.), die mit weiteren funktionellen hängt werden kann erstellenPeptiden und Proteinen. Kontrolle auf der genetischen Ebene auch sichergestellt, dass jeder ELP ist mit der genauen Länge und Zusammensetzung von seiner genetischen Plasmid-Vorlage vorgegeben ausgedrückt und bietet perfekt monodisperse Biopolymer Produkte. Die thermischen Eigenschaften der einzelnen ELP hängen von intrinsischen Parametern an das Biopolymer wie sein Molekulargewicht (MW) und Reihenfolge, als auch extrinsische Faktoren, einschließlich der Konzentration in der Lösung und der Gegenwart von anderen Kosoluten, wie Salze. Die Länge der ELP 12 und seinen Gästen Restzusammensetzung 1, 13, 14 sind zwei orthogonalen Parameter in ELP-Design, die verwendet werden können, um die T t, wobei hydrophobe Gast Rückstände und mehr Kettenlängen führen zu geringeren T t s zu steuern, während hydrophile Gast Rückstände und kürzere Kettenlängen führen zu höheren T t s. ELP-Konzentration umgekehrt proportional zu der T t, wobei Lösungen von gr bezogenenEsser ELP Konzentration niedrigere T t s 12. Die Art und Konzentration der Salze beeinflussen die ELP-T t, bei denen die Wirkung von Salzen folgt der Hofmeister-Reihe 15. Kosmotropen Anionen (Cl - und höher auf der Hofmeister-Serie) senken die ELP T t und steigender Salzkonzentration verstärkt diesen Effekt. Diese inneren und äußeren Parameter können eingestellt werden, um das thermische Verhalten in einem Zieltemperaturbereich, der für eine bestimmte Anwendung eines ELP erforderlich zu erhalten. Der Stimulus-responsive Verhalten ELPs ist nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Biosensorik 16, 17, 18 Tissue Engineering und Drug-Delivery-19, 20. Außerdem, wenn ELPs werden Peptide oder Proteine ​​auf der genetischen Ebene verschmolzen, das ESP kann als einfache Reinigungs-Tag dazu dienen, eine kostengünstige Batch-Verfahren zur Reinigung von rekombinantem pep bietenGezeiten oder Proteine, die keine 21-Chromatographie erfordert. Modifikation der Reinigungsprozess wird sichergestellt, dass die Aktivität des Peptids oder Proteins an die ELP fusioniert gehalten. Peptid oder Protein ELP-Fusionen können für Anwendungen, in denen die ELP-Tag ist nützlich 22, 23 oder alternativ, wenn das freie Peptid oder Protein erforderlich ist, kann eine Protease-Erkennungsstelle zwischen dem Peptid oder Protein und ELP eingefügt werden, gereinigt werden. Die Entfernung des ELP-Tag kann dann durch Verdauung mit kosten Protease oder einer Protease ELP-Fusion, wobei letztere bietet die zusätzliche Leichtigkeit der Verarbeitung als letzte Runde der ELP Reinigung kann das ESP-Tag-und Protease-ELP-Fusion aus dem Zielpeptid oder trennen erreicht werden Protein in einem Schritt 24, 25. Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung Verfahren zur ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen durch ihre thermischen Eigenschaften und erörtert grundlegende Techniken zur Charakterisierungdie thermische Reaktion der ELP-Produkte.

<table><tbody><tr><td>pET-24a(+)&lt;br/&gt; pET-25b(+)</td><td>Novagen</td><td>69749-3&lt;br/&gt; 69753-3</td><td>T7-&lt;em&gt;lac&lt;/em&gt; expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td></tr><tr><td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td><td>Edge BioSystems</td><td>45363</td><td>Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; for recombinant protein expression.</td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td><td>MO BIO Laboratories</td><td>12105</td><td>Media is reconstituted in DI H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and autoclaved before use.</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>IPTG is reconstituted in DI H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195444</td><td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0050</td><td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &amp;mu;l</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-1105</td><td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td></tr><tr><td>Cupric chloride dihydrate (CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C454-500</td><td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels.</td></tr><tr><td>Anotop 10 syringe filter:&lt;br/&gt; 0.02 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 0.1 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 0.2 &amp;mu;m</td><td>Whatman</td><td>6809-1002&lt;br/&gt; 6809-1012&lt;br/&gt; 6809-1022</td><td>These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td></tr><tr><td>Millex-HV filter:&lt;br/&gt; 0.45 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHVX13NK</td><td>These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td></tr></tbody></table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

Elastin-ähnliche Polypeptide sind sich wiederholende Biopolymere, die eine untere kritische Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten zeigen, bestehende als lösliche Unimere unterhalb einer charakteristischen Übergangstemperatur und Aggregation in Mikrometer-Skala Koazervate über ihren Übergangstemperatur. Das Design des Elastin-ähnliche Polypeptide auf der genetischen Ebene erlaubt eine genaue Steuerung ihrer Sequenz und Länge, die den thermischen Eigenschaften bestimmt. Elastin-ähnliche Polypeptide in einer Vielzahl von Anwendungen einschließlich der Biosensorik, Tissue Engineering und Drug-Delivery, wobei die Übergangstemperatur und Biopolymer Architektur des ELP kann für die spezielle Anwendung von Interesse abgestimmt werden verwendet. Ferner die untere kritische Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten von Elastin-ähnlichen Polypeptide können ihre Reinigung durch ihre thermische Reaktion, so daß ihre selektive Koazervation und Wiederauflösung ermöglicht die Entfernung der löslichen und unlöslichen Verunreinigungens nach Expression in Escherichia coli. Dieser Ansatz kann für die Reinigung von Elastin-ähnliche Polypeptide allein oder als Reinigungswerkzeug für Peptid-oder Proteinfusionen in dem rekombinanten Peptide oder Proteine ​​genetisch mit Elastin-ähnlichen Polypeptid-Tags angehängt werden können, ohne gereinigt werden verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen und diskutiert grundlegenden Charakterisierung Techniken des thermischen Verhaltens des reinen Elastin-ähnlichen Polypeptid-Produkte abzuschätzen.

Hier beschreiben wir repräsentative Ergebnisse für die Reinigung und Charakterisierung eines ELP-Homopolymer und einem ELP-Diblockcopolymer. Nach 24 h Expression in E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und durch Beschallung lysiert. Typischerweise wird eine kleine Änderung in der Farbe erfolgt nach der Beschallung bestätigt ausreichende Zell-Lyse (Fig. 1A). Nach der Zugabe von PEI sind genomische Komponenten und Zelltrümmer durch Zentrifugation gesammelt, Abtrennen eines großen Pellets von unlöslichen Verunreinigungen aus der löslichen ELP im Überstand (Fig. 1B). ELP wird durch inverse Übergang Radfahren (ITC), die die LCST-Verhalten ausgenutzt, um die ELP aus löslichen und unlöslichen Verunreinigungen (Fig. 2) 28 getrennt, gereinigt. Der Phasenübergang des ELP wird durch die Zugabe von Wärme und / oder Salz ausgelöst. Zentrifugation führt zur Bildung eines Pellets am Boden der Röhre, die eine aus der ELPnd einige unlösliche Verunreinigungen (Abbildung 1C). Diese Schritt-bezeichnet eine heiße Spin-Rückwürfe lösliche Verunreinigungen im Überstand, während die ELP-Pellet wird beibehalten und in kaltem Puffer. Die resolubilisierten ELP wieder bei 4 ° C zentrifugiert, Diese Schritt-bezeichnet eine kalte Spin-Würfen das Pellet der unlöslichen Verunreinigungen während der Überstand mit löslichen ELP wird beibehalten. Die Wiederholung des Zyklus abwechselnd heiß und kalt Spins erhöht die Reinheit des ELP, aber auf Kosten der leicht rückläufigen Ertrag, als Rest ELP während jeder Runde ITC in Zentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen verloren. Erfolgreiche Reinigung von ELP-und Peptid-oder Protein-Fusionen ELP wird durch SDS-PAGE bestätigt. Kleinen Portionen während des Reinigungsprozesses genommen zeigen die progressive Reinigung von ELP aus dem E. coli-Lysat. ELP im rohen E. überexprimiert coli-Lysat und Schadstoffe verringern Witzh aufeinanderfolgenden Runden der ITC (Abbildung 3). Gereinigtes ELP erscheint als eine einzige Bande in der Nähe der vorhergesagten theoretischen MW. Das ESP T t wird durch temperaturprogrammierte Trübungsmessung aus. Die Trübung Profil eines ELP-Homopolymer weist einen einzigen starken Anstieg der OD bei 350 nm (etwa 2,0 Einheiten über dem Ausgangswert für einen ELP-Konzentration von 25 uM) (Abbildung 4A). Kühltrübungs Scans bestätigen die reversible Natur der ELP Übergang als die OD wieder auf den Ausgangswert zurück, wenn die Temperatur unterhalb der T t (4B) verringert. ELP-Diblock-Copolymere zeigen ein komplexeres Profil Trübung im Vergleich zu ELPs Homopolymer ist. Die OD erhöht typischerweise ersten 0,1-0,5 Einheiten über der Grundlinie, nach der die OD erhöht sich deutlich auf 2,0 Einheiten über der Basislinie (Fig. 5A). DLS-Messungen liefern Informationen über die Änderung in R H in Bezug auf Temperatur, Co<html> rroborating die gewonnenen Informationen aus der Trübung Profil (5B). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Preliminary ELP Reinigung. Nach 24 Stunden des Ausdrucks, E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und in PBS resuspendiert. sind a) Zellen durch Ultraschallbehandlung, die durch eine kleine Änderung in der Farbe, so dass das Lysat dunkelt nach der Beschallung. B) nach Zugabe von PEI-DNA-Verunreinigungen zu kondensieren, ist das Lysat begleitet wird lysiert zentrifugiert und ein großes Pellet der unlöslichen Trümmer aus löslichen ELP im Überstand. C) getrennt Die ELP Übergang wird mit der Zugabe von Wärme und / oder Salz und Zentrifugation bildet eine durchschein ELP Pellet induziert.ank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> 2. Inverse Gangs Radfahren. ELP mittels dessen LCST-Verhalten von löslichen und unlöslichen Verunreinigungen gereinigt. (2) beginnend mit dem ELP-reiche Lysat (1) die ELP-Übergang mit der Zugabe von Wärme und / oder Salz und dem ELP induziert wird durch Zentrifugation (hot Spin) getrennt. Die ELP Pellet zurückgehalten (3a) während der Überstand, der lösliche Verunreinigungen verworfen wird (3b). Das ESP in kaltem Puffer (4) resuspendiert und erneut bei 4 ° C (Kaltrotations) zentrifugiert (5). Das Pellet, das unlösliche Verunreinigungen verworfen (6a), während der Überstand, der lösliche ELP beibehalten wird (6b). Zyklen von abwechselnd heiß und kalt Spins werden wiederholt, bis die gewünschte Reinheit erreicht ist, wie bei festSDS-PAGE. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> 3. SDS-PAGE-Analyse von ELP Reinigungsprodukte. Erfolgreiche Reinigung eines ELP wird durch SDS-PAGE bestätigt. Überexprimiert ELP ist in der rohen E. offensichtlich coli-Lysat nach der Beschallung (2). Nach der Zugabe von PEI und Zentrifugation der löslichen ELP weitgehend im Überstand (3) zurückgehalten, obwohl einige ELP in der Pellet verworfen unlöslicher Verunreinigungen hat (4). Überstand nach dem ersten Heiß Spin enthält bedeutende Mengen von löslichen Verunreinigungen (5). Überstand nach dem ersten Kaltrotations zeigt eine gute Trennung von ELP von unlöslichen Verunreinigungen (6). Zusätzliche Zyklen heißem (7) und calt Spins (8) entfernen restliche lösliche und unlösliche Verunreinigungen jeweils bis zur endgültigen Heiß (9) und Kaltrotations (10) Überstände weisen keine fremden kontaminierenden Banden bestätigt zufriedenstellende Reinheit des ELP Produkt. Diese ELP-Homopolymer, mit einer Folge von SKGPG-(VGVPG) 80-Y, hat eine erwartete Molekulargewicht von 33,37 kDa. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Charakterisierung von ELP-Homopolymer durch temperaturprogrammierte Turbidimetrie. Die ELP-T t wird durch Überwachen der OD bei 350 nm, während die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 1 ° C / min. A) ELP Homopolymere weisen einen einzigen scharfen Anstieg fest OD, dass defines ihre T t bei einer gegebenen Konzentration. B) Die Reversibilität der ELP Übergang wird durch Überwachen der OD bei 350 nm von weniger als 25 μ M Lösung, während die Verringerung der Temperatur, bei der Reversibilität wird durch die Rückkehr der OD auf die Grundlinie bestätigt verifiziert. Diese ELP-Homopolymer hat die Sequenz SKGPG-(VGVPG) 80-Y. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> Abbildung 5. Charakterisierung von ELP Diblockcopolymer durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung und dynamische Lichtstreuung. ELPs, die Nano-Selbstorganisation zu unterziehen, wie ELP Zweiblockcopolymere, die Selbstorganisation in kugelförmige Mizellen, Ausstellungs komplexer Trübung Profilen. <stronG&gt; A) moderate Erhöhung OD zeigt den Übergang von Unimere Micellen vor einem raschen Anstieg der OD, die vollständige Aggregation des ELP in Mikrometermaßstab Aggregate. B) DLS-Messungen bestätigen das Verhalten der Trübung Profil für ein gefolgert zeigt Lösung bei 25 &amp;mgr; M durch Information über die Änderung in R H in Bezug auf die Temperatur. Hier wird der ELP Unimeren hat eine R H ~ 8 nm und die Mizellen eine R H ~ 25 nm auf. Diese ELP Diblockcopolymer die Sequenz GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-ähnliche Polypeptide sind stimuliresponsiven Biopolymeren mit Anwendungen von rekombinanten Proteinreinigung zu Drug Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen aus Escherichia coli unter Verwendung der unteren kritischen Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten, wie eine einfache Alternative zur Chromatographie.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.6K Aufrufe.  Duke University.  Elastin-ähnliche Polypeptide sind stimuliresponsiven Biopolymeren mit Anwendungen von rekombinanten Proteinreinigung zu Drug Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen aus Escherichia coli unter Verwendung der unteren kritischen Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten, wie eine einfache Alternative zur Chromatographie. 

Serie: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Biotechnik

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Chemie

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Immunologie und Infektion

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biologie

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus

Zusammenfassung

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Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Überexpression und Reinigung des Menschen

Identifizierung von Protein-Komplexen in

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus

Zusammenfassung

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Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Überexpression und Reinigung des Menschen

Identifizierung von Protein-Komplexen in

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied