This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Aggregationspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Lagern Sie bei RT, über Monate stabil. Supplement 1 mM Dithiothreitol (DTT) vor dem Gebrauch. HINWEIS: a HEPES-basierten Puffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) erzeugt auch ähnliche Ergebnisse in Tau-Aggregation. </li><li> Bereiten Thioflavin T oder Thioflavin S-Stammlösung (3 mM, in Aggregationspuffer) und Filter von 0,22 um sterile Filtereinheit. Bei -20 ° C in einem Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt, über Monate stabil. </li><li> Bereiten Heparin-Stammlösung (300 &amp; mgr; M in Aggregationspuffer). Lagerung bei -20 ° C, für Monate stabil. </li><li> Bereiten Dithiothreitol (DTT) Lager (1 M, gelöst in Wasser). Aliquot in 1,5-ml-Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C. Vor Aggregationstests, tauen die 1M Lösung bei RT. Von diesem 1,000x Lager, bereiten eine aliquote Menge von 100 mM Arbeits Lager mit VE-Wasser. Lassen Sie auf dem Eisbis bereit. </li><li> Entfernen tau von -80 ° C Tiefkühltruhe. Tauwetter auf Eis. Passen tau zu vorbestimmten Konzentration mit der Aggregationspuffer. In einer Mikrozentrifuge bei 20.800 × g für 10 min bei 4 ° C auf vorgeformte große Aggregate zu entfernen. Diese Pre-Spinnschritt erhöht die Konsistenz in der anschließenden Fluoreszenz-Messung von jeder Charge des Proteins prep. Den Überstand in ein anderes Röhrchen; lassen auf Eis, bis bereit, die Aggregationsreaktion zu montieren. </li></ol> 2. No-Farbstoff, Terminal Assay HINWEIS: Der Aggregationsreaktion dieses Assays wird in Abwesenheit des fluoreszierenden Farbstoffs erfolgt. Nach dem Vermischen aller Komponenten wird das Reaktionsgemisch auf vorbestimmten Zeitpunkten fort. Aliquote werden dann aus der Aggregationsreaktion aufgenommen und mit ThT oder ThS für Amyloid Bindung vor Fluoreszenzmess gemischt. Das Anfangsvolumen der Aggregationsreaktion hängt von der Anzahl von Zeitpunkten benötigt. Dieser Ansatz kann require eine große Menge von Tau-Protein, aber schnell, einfach, und kann in einem Fluorometer oder einem Multiwell-Plattenleser (siehe Diskussion) erfolgen. Unten ist die Schritt-für-Schritt-Betrieb mit Hilfe der ISA SPEX FluoroMax-2 Kompakt Spektrofluorometer für Fluoreszenz Quantifizierung. <ol><li> Einrichten des Aggregatmischung in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen, wie in Tabelle 1. Jede Säule repräsentiert die Zutaten für einen 100 &amp; mgr; l-Reaktion, die für einen Zeitpunktmessung ausreichend ist notwendig. Stellen Sie die Anzahl für das Aggregations Mischung auf der Basis der Zeitpunkte für das jeweilige Experiment benötigt. Fügen Sie zusätzliche 10% der einzelnen Komponenten, um Platz für das Pipettieren Fehler geben. Die hier gezeigte typische Reaktion, die Heparin kann durch Arachidonsäure oder Aggregationspuffer ersetzt werden. Hinzufügen DTT 1 mM zu dem Reaktionsgemisch. Wenn die gesamte Reaktion dauert mehr als einen Tag, ergänzen frischem DTT Alltags (1 mM), um eine reduzierende Umgebung zu gewährleisten. </li><li> Das Röhrchen ein paar Mal, um zu mischen. Place jede Reaktion in einem 37 ° C Brutschrank oder Wasserbad. Das Rühren wird für Tau-Aggregation notwendig. </li><li> Vor der Messung der Fluoreszenz, schalten Sie den Spektrofluorometer (Lampe, dann Computer). HINWEIS: Die Xenon-Bogenlampe, die sofort verwendet werden kann. Für die besten Ergebnisse lassen jedoch die Maschine zum Aufwärmen für etwa 10 Minuten vor dem Lesen Fluoreszenz. </li><li> Starten der Software auf dem Computer. <ol><li> Wählen Sie Echtzeit-Anzeige-Modus im Instrument Control Center eingestellt Anregungswellenlänge von 450 nm (Schlitz bis 2 nm) und Emissionswellenlänge auf 510 nm (Spalt bis 5 nm). Schließen Echtzeit Anzeigemodus-Fenster, um das Instrument Control Center zurückzukehren. </li><li> Wählen Constant Wellenlänge Analyse, drücken Sie auf Hinzufügen &gt;&gt; Taste im oberen Rahmen auf Wellenlängen-Sets hinzuzufügen. Stellen Erfassungsparameter der Standardfehler um 1 und Maximum Trials bis 3, dann auf Hinzufügen. Klicken Sie auf Los! Um die Datenanzeige zu öffnenFenster. </li><li> Im Datenanzeigefenster, klicken Sie auf Start, um das Dialog Acq Musterkiste Neu öffnen. Wählen Sie &quot;unbekannt&quot; für die Probentyp. </li></ol></li><li> Zu jeder 100 ul Aggregation Mischung, fügen Sie 98 ul Aggregationspuffer und 2 ul 3 mM Thioflavin T. Pipettieren mehrmals, um zu mischen. </li><li> Übertragen Sie die gesamte Mischung in eine Küvette (FCA3, Außenabmessung, BxLxH = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter in den Probenraum und den Deckel schließen. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenz-Daten zu sammeln. Notieren Sie die Daten. </li><li> Entfernen Sie die Küvette und dekantiert die Lösung. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser 3-mal. Trocken durch Einblasen von Luft in und außerhalb der Küvette. </li></ol> 3.-Farbstoff, kontinuierliche Modus Probe mit SpectraMax M2 Plate Reader Hinweis: Dieses Assay unterscheidet sich von der vorhergehenden dadurch, dass der fluoreszierende Farbstoff ThT oder ThS im aggrega enthaltention Reaktion. Dies ermöglicht eine kontinuierliche Messung der gleiche Satz von Reaktionen. Aufgrund der wiederholten Verwendung der Reaktion ist dieses Verfahren besser mit einem automatischen Multiwell Plattenlesegerät durchgeführt (wie nachfolgend den Betrieb SpectraMax M2 gezeigt). Eine regelmäßige Fluorometer funktioniert auch, aber die Häufigkeit der Messung des schnellen Aggregationsreaktionen etwas begrenzt ist, aufgrund der manuellen Natur des Vorgangs. <ol><li> Richten Sie die Aggregation Mischung in einer 96-Well-Platte (96-Loch-schwarzen Festplatte, gut Volumen 360 ul, flacher Boden), wie in Tabelle 2. Jede Spalte steht die Zutaten für eine 200 ul-Reaktion, die für eine ausreichend ist erforderlich Zeit-Punkt-Messung. Gut mischen durch Pipettieren mehrmals. Ergänzen frischer 1 mM DTT jeden Tag im Verlauf der Experimente. </li><li> Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 37 ° C. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt vor der Fluoreszenzmessung, schalten Sie den Multimode-Mikroplatten-Reader und den Computer ein. Lassen Sie ausreichend Zeit für die maschine zu stabilisieren, ca. 10 min. </li><li> Starten der Software auf dem Computer. Temperatur auf 37 ° C und wählen Fluoreszenzintensität (FI-Top Read) Modus eingestellt Anregungswellenlänge bei 450 nm und Emissionswellenlänge bei 510 nm. </li><li> Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in die Schublade und drücken Sie die READ-Taste, um die Messung zu starten. </li><li> Nach der Lektüre, entfernen Sie die Platte aus und senden es zurück zu der 37 ° C-Inkubator. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie ihn in eine Excel-Tabelle für die Datenanalyse und Plotten. </li></ol> 4.-Farbstoff, kontinuierliche Modus Assay auf einer Compact Spectrofluorometer <ol><li> Richten Sie die Aggregation Mischung in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wie in Tabelle 3. Jede Spalte steht die Zutaten für eine 200 ul-Reaktion, die für eine Zeit-Punkt-Messung genug ist notwendig. </li><li> Das Röhrchen ein paar Mal, um zu mischen. </li><li> Schalten Sie die Spektrofluorometer und stellen Sie die Software wie in den Schritten 2.3 und 2.4. </li><li> Übertragen Sie die gesamte Mischung toa Küvetten. Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter in den Probenraum und den Deckel schließen. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenz-Daten zu sammeln. Notieren Sie die Daten. </li><li> Lesen in angemessenen Abständen, indem Sie auf Ausführen und Aufzeichnen der Daten auf Weiter. Wenn die Aggregation bei einer hohen Frequenz (beispielsweise alle 30 oder 60 Sekunden) überwacht werden soll, lassen die Reaktion in der Küvette und in der Maschine, bis entweder die Messung beendet ist, oder, wenn genügend Zeit vorhanden ist, um Reaktionen oder Küvetten vertauschen. </li><li> Entfernen Sie die Küvette und dekantiert die Lösung. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser 3-mal. Trocken durch Einblasen von Luft in und außerhalb der Küvette. </li></ol>

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Dieses Protokoll zeigt unterschiedliche Assaybedingungen und Instrumente, die phosphorylierungsabhängige schnell tau Aggregationskinetik erkennen. Im Terminal Assay wird der Fluoreszenzfarbstoff ThT zu einem Teil der Reaktionsmischung aus dem Master zu jedem Zeitpunkt entfernt, hinzugefügt. Amyloid-bindende-induzierte Fluoreszenz wird gemessen 26. In der zweiten, mit Farbstoff Modus Tau-Aggregation in Gegenwart von ThT oder ThS geführt, wodurch diese Art von Reaktion geeignet für automatischen Echtzeit-Be...

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine von einer großen Sammlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Tauopathien bekannt. Die Quintessenz der zugrunde liegenden Pathologie Tauopathie um die Neurofibrillen, NFTs, in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia 1-4. Die NFT Dichte korreliert mit kognitiver Beeinträchtigung 3,5 und Verlust von Nervenzellen 6. NFT enthält in erster Linie hyperphosphoryliertem Tau-Protein (im Folgenden als &quot;p-tau&quot; fortan genannt), die direkt oder gepaarten helikalen Filamenten (PHF) 7,8 bildet. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein vermutlich axonalen Transport, die für neuronale Signalübertragung und den Handel 9,10 ist zu erleichtern. Jedes tau Molekül 2-3 Phosphate im normalen Gehirn, sondern die Phosphoryl-Gehalt steigt um mehrere Falten in Tauopathie Patienten 11. Mehrere Kinasen sind wahrscheinlich zu Tau-Hyperphosphorylierung beitragen einschließlich GSK3 &amp; bgr; (Glykogensynthasekinase 3β) und CDK5 (cyclin-dehängig Kinase 5) 12,13, aber der direkte Auslöser für die pathologischen Phosphorylierung weiter Ferne 14. Abnormalen Phosphorylierung in oder in der Nähe der Mikrotubulus-Bindungsmotive distanziert tau vom Filament 15, und bewirkt tau Fehllokalisierung zu der somatodendritischen Faches, p-tau oligomerisiert in gerader oder gepaarte helikale Filamente, die schließlich in NFT Einschlüsse polymerisieren kann. Die enge Verbindung zwischen Tau-Hyperphosphorylierung, NFT-Bildung und Neurodegeneration zu einer vorherrschenden Annahme, dass p-tau Tangles hervorrufen apoptotischen und andere zytotoxische Reaktionen, und damit ist die zugrunde liegende Ursache für Tauopathie Neurodegeneration 16,17. Drogen-Bildschirme und frühen klinischen Tests, die auf dieser Prämisse wurden eingeleitet 18. , Gibt es bei diesem Hypothese Herausforderungen 19,20. Zum Beispiel Santacruz et al. Zeigten, dass die kognitiven Funktionen von transgenen Mäusen kann durch Unterdrücken der Expression eines mutierten verbessernhumanem tau, obwohl NFTs weiterhin von bestehenden tau Moleküle 21 bilden. In einem Drosophila Modell NFT wurde gezeigt, dass die toxische zytosolische Tau-Sequestrierung, die zugrunde liegenden Nervenzellen 22,23 schützen. Offensichtlich ist die Pathogenese Rolle NFT, falls vorhanden, stark beeinflussen die Richtung Tauopathie Therapeutika Entwicklung. In hohen Konzentrationen rekombinanten oder normale Gehirn tau Protein spontan, sondern langsam polymerisiert in ein PHF-ähnliche Struktur in vitro, wie durch die Bindung mehrerer β-Faltblatt bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe, elektronenmikroskopischen und Lichtstreuungsspektroskopie 24-27 angegeben. Hinzufügen von Heparin oder Arachidonsäure, eine reichliche Fettsäuren im menschlichen Gehirn, drastisch beschleunigt PHF-Bildung in tau isoform- und Induktor konzentrationsabhängigen Weise 28-32. Interessanterweise hyperphosphoryliertem tau gereinigt von AD-Gehirnen oder vollständig in vitro Phosphorylierungsreaktionen a vorbereitetggregates schneller und effizienter 26,33-35. Diese Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit der pathologischen Rolle von p-tau. Ein in vitro-System auf der Grundlage der Aggregation von p-tau kann somit als ein leistungsfähiges Werkzeug für AD Wirkstoff-Screening dienen. Angesichts der engen Verbindung zwischen Tau-Aggregation und die fortschreitende Neurodegeneration von AD, sowie die letzten Fehler in der Medikamentenentwicklung zur Förderung der Aß-Plaques eine andere Taste histologische Marker der AD 36-38, das Interesse an der Entdeckung Drogen, die steuern, Tau-Aggregation steigt. In der Tat, einige Gruppen haben bereits Drogen-Bildschirme mit unterschiedlichen Durch begonnen, mit In-vitro-Tau-Aggregation Reaktionen als primäre Assay. Eine Reihe von Chemikalien wurden als hemmend oder Umkehrung Aktivitäten auf Tau-Aggregation in vitro 39-42 aufweisen. Allerdings werden alle aktuellen Tau-Aggregation Regler Bildschirme verwenden unmodifizierten tau, die den Schlüssel pathologischen Kennzeichen Phosphor vermisstlierung und hob eine Sorge um die Spezifität und Wirksamkeit der Verwendung dieser Verbindungen bei AD-Behandlung. Eines der Haupthindernisse für die Entwicklung Aggregationsassays zur biochemischen Charakterisierung und AD Wirkstoff-Screening ist die Herstellung von ausreichenden Mengen des pathophysiologisch relevanten hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Verwendung des Zippers Assisted Catalysis System, in dem die 1N4R Isoform von tau und der GSK-3β-Kinase in E. coexprimiert coli als Leucin-Zipper-Fusionsproteine, haben wir diese Herausforderung zu meistern (. Sui et al, eingereicht; siehe Abbildung 1 für die Endprodukte von Tau und p-tau; siehe auch 43 Vorab Massenspektrometrie Charakterisierung von p-tau). Aus einem Panel von für unterschiedliche Phosphorylierungsstellen von Tau neun Antikörper wurden positive Signale in acht Positionen gesehen (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden beschreiben wir, Protokolle und Besetzungen, die die Aggregation kinetische d unterscheiden kannifferences zwischen unmodifizierten tau und p-tau-Arten. Diese Assays wurden aus veröffentlichten Protokollen, die den Anstieg der Fluoreszenz von Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) auf Amyloid (tau Aggregate) Bindung 26 gemessen modifiziert. In der ersten &quot;Endgerät&quot;, keine Farbstoffansatz Aggregationsreaktionen werden zusammengebaut und in der Abwesenheit des Amyloid-Farbstoff inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird ein Aliquot jeder Reaktion entnommen und mit einem gleichen Volumen des ThT-haltigen Puffer gemischt, um eine Aggregation schalten und THT tau Aggregate binden. Fluoreszenz wird von einem IAP FluoroMax-2-Fluorometer gemessen. In der zweiten &quot;mit Farbstoff&quot; kontinuierliche Überwachung Assay ThT oder ThS in den Aggregationsreaktionen enthalten. Fluoreszenz kann kontinuierlich während des gesamten Experiments manuell oder unter Verwendung eines Mehrplatten-Lesegeräts gemessen werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen Test, der eine nahezu physiologische Konzentration von Tau und p-tau für die Aggregation in der kontinuierlichen Messung mo verwendetde. Die Wirkung der Phosphorylierung bleibt leicht nachweisbar. Im Folgenden werden wir Schritt-für-Schritt-Betrieb wird beschrieben, und zeigen repräsentative Ergebnisse dieser Tests. Diskussion über einige der Vor-und Nachteile der einzelnen Ansätze sowie potenzielle Wirkstoff-Screening-Anwendungen werden folgen. In einer hohen Konzentration, aggregiert tau amyloidartigen Strukturen spontan. Jedoch im Labor tau Fibrillenbildung wird typischerweise durch solche Induktoren wie Heparin (mittleres Molekulargewicht 6000 g / mol) und Arachidonsäure beschleunigt. Beispiele hier gezeigten sind 30 uM Heparin. Die Bildung von Tau Amyloidaggregaten durch die Fluoreszenz von Amyloid-Bindung durch Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) resultierenden überwacht. Nach Bindung an Tau-Aggregaten weist ThT eine Rotverschiebung der Fluoreszenz (Anregung: 450 nm; Spitzenemission: 485 nm). ThS andererseits eine schwache Emission bei 510 nm (Anregung bei 450 nm) vor Amyloid-Bindung, aber dies fluorescence steigt signifikant in Gegenwart eines Amyloid Protein wie das aggregierte tau 44. Beide Farbstoffe funktionieren gut bei der Aufdeckung von Tau und p-Tau-Aggregation. Aufgrund des starken und relativ breite Emissionsspitze von ThT (siehe Abbildung 2), gibt es nur 30% ige Reduktion der Fluoreszenz-Einheit bei 510 nm. Der Bequemlichkeit halber verwenden wir die gleiche Kombination von Anregungs- / Emissionswellenlängen (das heißt, 450 nm / 510 nm), um Tau-Aggregation zu überwachen, wenn entweder Farbstoff. Tau-Aggregation kann in Gegenwart oder Abwesenheit des Farbstoffs durchgeführt werden, abhängig von dem Zweck des Tests und Verfügbarkeit der Tau-Protein. Beide Arten der Reaktionen sind unten dargestellt. Darüber hinaus zeigen wir, den Betrieb von zwei verschiedenen Instrumenten - eine Einzelprobe Fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) und eine Multi-Plattenlesegerät (SpectraMax M2). Die Leser sollten in der Lage, diese Protokolle anzupassen, um ihre spezifischen Bedürfnisse und Verfügbarkeit Instrument zu entsprechen.

<table><tbody><tr><td>Trizma&amp;nbsp;base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>Stored in dark</td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>Stored in dark</td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>Stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB3494</td><td>Stored at &amp;ndash;80 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Unter Verwendung rekombinanter tau und p-tau (Abbildung 1), haben wir zwei verschiedene Protokolle, die Kinetik der Aggregation von Tau und p-tau zu vergleichen, unter Ausnutzung der starken Fluoreszenzemission ThT THS bei Bindung an amyloide Protein-Aggregate, einschließlich tau und p-tau (Abbildung 2). Mit oder ohne dem Fluoreszenzfarbstoff in der Aggregationsreaktion beobachteten wir konsequente Weiterentwicklung der Tau-Aggregation durch Hyperphosphorylierung (Figuren 3-5)....

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.3K Aufrufe.  Michigan State University.  Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden. 

Serie: In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Forschung

Biochemie

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning because it is involved in microtubule assembly and stabilization. Besides neurons, tau is expressed in human breast, prostate, gastric, colorectal, and pancreatic cancers where it shows nearly similar structure and exerts similar functions as the neuronal tau. The amount of tau and its phosphorylation can change its function as a stabilizer of microtubules, and lead to the development of paired helical filaments in different neurodegenerative disorders, such as Alzheimer&#39;s disease. Determining the phosphorylation state of tau and its microtubule-binding characteristics is important. In addition, examining the intracellular localization of tau is important in different diseases. This manuscript details standard protocols for measuring tau phosphorylation and tau binding to microtubules in colorectal cancer cells with or without curcumin and LiCl treatment. These treatments can be used to stop cancer cell proliferation and development. Intracellular localization of tau is examined by using immunohistochemistry and confocal microscopy while using low amounts of antibodies. These assays can be used repetitively for screening compounds that affect tau hyperphosphorylation or microtubule binding. Novel therapeutics used for different tauopathies or related anticancer agents can potentially be characterized using these protocols.

This manuscript describes standard protocols for measuring tau hyperphosphorylation, measuring tau binding to microtubules, and localization of intracellular tau following drug treatments. These protocols can be used repetitively for screening drugs or other compounds that target tau hyperphosphorylation or microtubule binding.

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Biotechnik

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In-vitro- Test zur Untersuchung der Aggregation von Tau-Protein und Drogen-Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Neurowissenschaften

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing neuronal dysfunction which eventually leads to cognitive decline. Hyperphosphorylated tau aggregates in the neuron are believed to cause most of the pathology associated with AD. These aggregates are assumed to be released into the extracellular compartment and taken up by adjacent healthy neurons where they induce further tau aggregation. This &#34;prion-like&#34; spreading can be interrupted by antibodies capable of binding and &#34;neutralizing&#34; extracellular tau aggregates as shown in preclinical mouse models of AD. One of the proposed mechanisms by which therapeutic antibodies reduce pathology is antibody-mediated uptake and clearance of pathological aggregated forms of tau by microglia. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess tau uptake by microglia. This assay uses the mouse microglial cell line BV-2, allows for high specificity, low variability and medium throughput. Data generated with this assay can contribute to a better characterization of anti-tau antibody effector functions.

Here we describe a cell-based assay to quantitatively assess tau uptake by microglia with the aim of creating an investigational tool to better characterize the mechanisms of action of anti-tau antibodies.

Zellbasierte Assays, Antikörper-vermittelten Tau Clearance von Mikroglia zu studieren

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). Although mouse models of tauopathy have provided a valuable resource for investigating the neurotoxic mechanisms of aggregated tau, it is becoming increasingly apparent that, due to interspecies differences in neurophysiology, the mouse brain is unsuitable for modeling the human condition. Advances in cell culture methods have made human neuronal cultures accessible for experimental use in vitro and have aided in the development of neurotherapeutics. However, despite the adaptation of human neuronal cell cultures, in vitro models of human tauopathy are not yet widely available. This protocol describes a cellular model of tau aggregation in which human neurons are transduced with lentiviral-derived vectors that code for pathogenically mutated tau fused to a yellow fluorescent protein (YFP) reporter. Transduced cultures produce tau aggregates that stain positively for thioflavin and display markers of neurotoxicity, such as decreased axonal length and increased lysosomal volume. This procedure may be a useful and cost-effective model for studying human tauopathies.

This protocol details a procedure in which human neuronal cultures are transduced with lentiviral constructs coding for mutant human tau. Transduced cultures display tau aggregates and associated pathologies.

Ein In-Vitro-Modell für das Studium der Tau Aggregation mit Lentiviral-vermittelter Transkription menschlicher Neuronen

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy to Identify Multiple Phosphorylations in Proteins

Source: Danis, C. et. al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55001">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2016).
This video demonstrates the use of nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) techniques to identify multiple phosphorylations in a protein. The phosphorylation of a protein at specific amino acid causes the deshielding of the neighboring amide hydrogen, which generates the spectral difference.

Kernspinresonanzspektroskopie zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen in Proteinen

Source: Danis, C. et. al., Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Spectroscopy Techniques

A Cell-Based Assay to Assess the Tau Protein Uptake by Microglia

Source: De Marco, D. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58576">Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video showcases a cell-based assay quantifying Tau uptake by murine microglia using pH-sensitive fluorescent-labeled Tau aggregates, analyzed via fluorescence-activated cell sorting for a quantitative assessment.

Ein zellbasierter Assay zur Beurteilung der Aufnahme des Tau-Proteins durch Mikroglia

1. BV-2 Microglia Cells Culture
NOTE: Handle BV-2 cells under Biosafety Level 2 containment. The BV-2 cell line produces an enveloped recombinant ...

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Phosphatase Assay in CRC Cells: A Method to Examine the Phosphorylation Status of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Source: Huda, M. N., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55932"> Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video describes a protocol for assessing the phosphorylation status of tau protein by a phosphatase assay in colorectal cancer cells. Phosphatase enzyme acts on the phosphate groups present on the tau protein, increasing the mobility of tau protein on SDS PAGE gel compared to the untreated tau protein samples.

Phosphatase-Assay in Darmkrebszellen: Eine Methode zur Untersuchung des Phosphorylierungsstatus des Tau-Proteins in Darmkrebszellen

Source: Huda, M. N., et al.  Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. ...

Krebsforschung

Colorectal Cancer

Assays & techniques

Lentiviral-Mediated Transduction of Human Neurons for Tau Protein Aggregation Analysis

Source: Aulston, B., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59433">An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons.</a>&#160;
This video demonstrates the process of transducing human neuronal cells with a lentivirus encoding a mutant human tau protein tagged with yellow fluorescent protein (YFP) to study protein aggregation. It outlines the steps from viral entry to mutant tau expression, culminating in the formation of visible cytoplasmic tau aggregates in the neurons.

Source: Aulston, B., et al. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons.&#160;
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