Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lubor Borsig (Institut für Physiologie, Universität Zürich) für seine Ratschläge danken auf der Technik der Lungenperfusion. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Krebsliga des Kantons Zürich, der Walter L. und Johanna Wolf-Stiftung, Zürich, der Lydia Hochstrasser-Stiftung, Zürich, der Swiss National Science Foundation, SNF, der Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist und der Universität unterstützt Zürich.

1. In-situ Lung Perfusion und Fixation <ol><li> Anästhesieren Mäusen durch ip Injektion von ~ 150 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 112,5 mg / kg (Körpergewicht) Ketamin, 16,5 mg / kg Xylazin und 15 mg / kg Acepromazin (oder durch eine andere geeignete Anästhesie enthält Schmerzmittel). </li><li> Wenn Reflexe der Maus nicht mehr beobachtet werden, fixieren sie auf dem OP-Tisch zurück-down-und benetzen das Fell mit 70% Ethanol zu slick den Haaren nach unten. </li><li> Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals und ziehen Sie sie an den Seiten oder entfernen. </li><li> Öffnen Sie das Bauchfell und den Brustkorb auf eine reichliche Größe. Verhindern von großen Brüchen Gefäße (zB die Vena jugularis) in reduzierter Effizienz der nachfolgende Perfusion vermeiden. </li><li> Schneiden Sie die Vena cava caudalis unter der Leber. </li><li> Verwenden eines 20-ml-Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel langsam 10-15 ml PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens zu injizieren, bis die Lungen vollständig weiß unddas Herz aufhört zu schlagen (Asystolie). </li><li> Abkneifen die Blutgefäße der Leber und der Membran mit einer Gefäßklemme. </li><li> Eine 10 ml Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel auf ~ 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den rechten Ventrikel zu injizieren. </li><li> Entdecken Sie die Luftröhre außerhalb des Thorax. Verwenden das gleiche Spritze auf ~ 3 ml 3% PFA in PBS kraniale (außerhalb des Thorax) injizieren in die Trachea bis zur Lunge aufgeblasen wird. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel, abkneifen die Luftröhre kaudalen der Punktion mit einer Gefäßklemme und für 10 min, um die Fixierung zu ermöglichen. </li><li> Durchschneiden die Blutgefäße oberhalb der Gefäßklemme, entfernen die Klemme und injizieren ~ 2 ml PBS in die rechte Herzkammer, um überschüssiges PFA entfernen. </li><li> Punktieren der unteren Teile aller Lungenlappen mit einer Nadel, entfernen die Gefäßklemme an der Trachea und injizieren 3-5 ml einer Lösung von PolyFreeze Einbettungsmedium / PBS 1:1 in der Luftröhre kaudalen des ersten Punktion bis PFA in der LungeLappen durch die Lösung ersetzt. </li><li> Entfernen Sie die Lunge sorgfältig, indem das Herz mit einer Pinzette und durch Durchschneiden des Bindegewebes Bändern, Blutgefäßen und der Luftröhre. Halten Sie das Herz an der Lunge. </li><li> Je nachdem, wie mit dem Lungengewebe Analyse gehen mit den Protokollen in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben fortsetzen. Wenn Sie beide Analysen durchführen möchten, entfernen Sie ein Lungenlappen und wie unter 3 beschrieben. Verarbeiten Sie die verbleibenden Lappen mit dem Herzen wie unter Punkt 2 beschrieben. </li></ol> 2. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Entire Lungenlappen <ol><li> Legen Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit engen schließenden Deckel aufsetzen und mit 2% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30-60 min. </li><li> Entfernen Fixierungslösung und gründlich 3-mal mit PBS. </li><li> Hinzufügen mindestens 10 ml frisch hergestellte 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) Färbelösung (X-Gal Stammlösung [40 mg / ml inDimethylformamid] 1:40 verdünnt in Basic Färbelösung; pH 7,1 (Tabelle 1); vor Licht schützen). </li><li> Legen Sie ein Stück Gaze auf der Oberseite des Swimming Lungen, um es vollständig zu halten in der Lösung und setzen Sie den Deckel nur lose auf dem Topf, den Austausch von Luft zu ermöglichen. </li><li> Inkubation bei 37 ° C für 3-5 Stunden vor Licht geschützt. </li><li> Entfernen X-Gal-Lösung, einmal mit PBS spülen, um restliches X-Gal-Lösung (optional) entfernen und 4% PFA. </li></ol> 3. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Lung Kryoschnitte <ol><li> Vorfüll ein markiertes Einbettform bis 1/3 mit unverdünntem PolyFreeze Einbettungsmedium. Legen Sie die Lungenlappen oben und füllen sich mit Einbettmedium bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, um Blasen zu verhindern. </li><li> Inkubieren der eingebetteten Lungen bei 4 ° C für 20 min. </li><li> Dann frieren die eingebettete Lunge langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan und bei -80 ° C. </li><li> Cut 7-10 um KryoAbschnitte auf einem Kryostaten und montieren sie auf SuperFrostPlus Objektträger. </li><li> Inkubiere die Abschnitte sofort mit X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Spülen Sie die Objektträger in PBS 2 mal für 5 min und dann kurz in destilliertem Wasser. </li><li> Counter-Fleck mit Kernechtrot für 10-30 sec gründlich in destilliertem Wasser und montieren Sie die Folien mit Immu-Mount. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Asai et al. Im ursprünglichen Artikel auf der Dunn-OS abgeleiteten LM8 Mausmodell dass sc Primärtumoren von den parentalen Dunn Zellen abgeleitet, die sich von denen aus der hoch metastatischen LM8 Sub-Zelllinie abgeleitet sind, nicht spontan bilden nachweisbare Lungenmetastasen in gemeldet syngenen C3H Mäusen 14. Mit den hier berichteten Techniken, untersuchten wir die Bildung von Metastasen in den Dunn/LM8 Maus OS-Modelle. Wir nutzten stabile lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zelles und eines Protokolls für in-situ Lungenperfusion und Fixierung in Mäusen. Repräsentative Bilder perfundierten und nicht-perfundierten Lungen von Mäusen subkutan injiziert mit lacZ-transduzierten und nicht-transduzierten Steuerung Dunn und LM8 Zellen in Abbildung 1 gezeigt. In Mäusen, die mit Zellen injiziert Steuerung Dunn blieb makroskopischen und mikroskopischen Metastasen in nicht nachweisbar nicht perfundierten und perfundierten Lunge (1A, i-iv). Aber interessanterweise in Mäusen mit Dunn-lacZ-Zellen injiziert, offenbarte X-gal-Färbung blauen mikrometastatischen Foci von Einzelzellen oder kleinen Zellaggregaten (&lt;0,1 mm) auf der Oberfläche des nicht-perfundierten Lunge (Abbildung 1A, vi). Im situ Perfusion und Fixierung der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Dunn-lacZ Mikrometastasen (1A, viii). Jedoch wurde Auswuchs auf makroskopische Foci nicht beobachtet (Abbildung 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; Bei Mäusen mit Steuerung LM8 Zellen, transluzent, kaum nachweisbar macrometastatic Foci injiziert größer als 0,1 mm Durchmesser wurden im nicht-perfundierten Lunge (1B, i) erfasst. Perfusion der Lunge (1B, iii) nicht verbessert die Erkennung der Brennpunkte. Jedoch in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen injiziert mehrere X-Gal blau gefärbt makro-(1B, v) und Mikrometastasen (1B, vi) wurden auf der Oberfläche von nicht-perfundierten Organen detektiert. Darüber hinaus Perfusion der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Makro-und Mikrometastasen (Abbildung 1B, VII - VIII). Folglich wurde der Mikro-und sichtbaren Makrometastasen bei einer höheren Dichte und einer größeren Anzahl, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebe, in dem Brennpunkte unterhalb der Organoberfläche wurde ebenfalls sichtbar. Ein zusätzlicher histological Analyse mit Gefrierschnitten des Lungengewebes bestätigt die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen mit lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zellen injiziert. Bei Mäusen mit Primärtumoren von Dunn-lacZ oder lacZ LM8-Zellen abgeleitet wurden im Gegensatz zu Mäusen, die mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen, Mikrometastasen oder sogar einzelne Zellfoci in Lungenschnitten (Abbildung 2) erfasst. Darüber hinaus waren auch Makrometastasen deutlicher sichtbar in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen als bei Tieren mit der Steuerung LM8 Zellen (2C, D) injiziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Abbildung 1. Nachweis von spontanen Metastasen von nicht-transduzierten (i-iv) und lacZ-transduzierten (v-viii) Dunn (A) und LM8 (B) Zellen im nicht-perfundierten (i, ii, v, vi) und perfundierten (iii, iv, vii, viii) Lungen in C3H-Mäusen. Metastasen in repräsentativen X-Gal-stained ganzen Lunge (v, vii in A und B) und die entsprechenden Nahaufnahmen (vi, viii in A und B) blau erscheinen. Macrometastatic Brennpunkte (&gt; 0,1 mm) in den Organen von Mäusen mit nicht-markierten Zellen LM8 (i-iv in B) eingespritzt sind durch Sternchen gekennzeichnet. Bereiche, in Nahaufnahmen sind repräsentativ für die gesamte Lunge. Maßstab Balken zeigen 1 mm in Bildern ganzer Lunge und 0,1 mm in Nahaufnahmen. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Abbildung 2. Erkennung von Dunn und LM8 Mikrometastasen in der Lunge Kryoschnitten. Abschnitte von OCT eingebettet Lungengewebe wurden in X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer inkubiert und dann gegengefärbt mit Kernechtrot. Pfeile zeigen auf mikrometastatischen Foci in Lungenschnitten von Mäusen mit Dunn-lacZ (B) oder LM8-lacZ-Zellen (D) eingespritzt erfasst. Micrometastases blieb nicht nachweisbar in Lungenschnitten von Mäusen mit nicht-transduzierten Dunn (A) oder LM8 Zellen (C) injiziert. Maßstab Balken zeigen 0,1 mm.

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	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Ergebnisse im Dunn/LM8 Maus OS Modells demonstrieren die Macht des neu gegründeten Methode, die die X-Gal-Färbung von lacZ-markierten Tumorzellen mit in-situ Perfusion / Fixierung von Lungengewebe kombiniert. Diese Kombination der beiden Techniken ermöglicht eine hohe Empfindlichkeit Nachweis von Mikrometastasen Läsionen bis zum einzelnen Zellebene und verbessert auch die Visualisierung von Makrometastasen auf der Lungenoberfläche (Abbildung 1) als auch in der Lunge Abschnitten (Abbildung 2). Während die X-Gal-Färbung ermöglicht auch die Detektion von (Mikro-) Metastasen in anderen Organen, in-situ-Perfusion / Fixierung verbessert die Erkennbarkeit der metastatischen Foci in anderen Geweben als der Lunge nur leicht aufgrund der natürlichen Blut-und Gewebe-bezogene Farbe 13 dieser Organe. Selbst wenn die Perfusion einem anderen Organ gerichtet ist, zB der Leber, wären Entfernung des Blutes nur teilweise Verbesserung des Kontrasts Wetteschen X-Gal-Färbung und die natürliche Farbe des Organs. Jedoch ist das Verfahren anwendbar auf jede Art von lacZ-markierten Tumorzellen ist, wird die Gewinnung und Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bis auf die Ebene der ruhenden einzelligen Mikrometastasen und ermöglicht eine einfache und zuverlässige Quantifizierung von Makro-und Mikrometastasen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens und alle anderen Techniken, die auf Reportergenen, einschließlich Luciferase und fluoreszierende Proteine, bezogen sind, ist die Stabilität der Transgen-Expression. Wie in 2d gezeigt ist, werden nicht alle Tumorzellen innerhalb der Herde macrometastatic blau gefärbt, was auf ein Fehlen von beta-Galactosidase-Aktivität. Das könnte im Zusammenhang mit Nekrose, aber es ist wahrscheinlicher, auf einen Verlust der Transgenexpression. Wir beobachteten, dass die Dunn und LM8 Zellen sehr wirksam bei der Herabregulierung von lacZ und andere Transgene auch unter kontinuierlicher Selektion auf Expression sind. Deshalb schaltet in neueren Studien der murinen K12und K7M2 und die menschlichen HOS, 143B und Saos-2 Osteosarcom-Zelllinien, die alle stabil lacZ-Expression in vitro als auch in vivo bis zu 100% der Zeit beibehalten wird. Sobald stabile lacZ-Expression garantiert wird, kann diese Technik in Studien mit genmanipulierte Tumorzellen, zB um mechanistisch untersuchen den Prozess des Gewebes Kolonisierung 13 sowie für die Entwicklung und Erprobung neuer Therapien dem Ziel Tilgung der metastatischen Läsionen 15 angelegt werden , 16. Weiterhin kann als Richtwert für die Verbesserung des aktuellen radiologischen Bildgebung, wie PET, (Mikro-) CT-und MRI, für die frühe Erkennung des metastatischen Läsionen verwendet dienen. In einer kürzlich durchgeführten Studie PET (unveröffentlicht) mit unterschiedlichen Tracer wir überprüft die in vivo nachgewiesen Lungenmetastasen anschließend ex vivo mit dem beschriebenen Protokoll. In einer laufenden Studie mit einem neuen Kleintier Mikro-CT (SkyScan) sind wir so weit able, um Lungenmetastasen in vivo nachzuweisen bis zu einer Größe von 0,5 mm und ex vivo bis zu 0,3 mm, aber wir wollen mit einer Auflösung von 0,1 mm. Interessanterweise ist dies die maximale Größe, die wir zu unterscheiden Makro-von Mikrometastasen mit dem kombinierten Verfahren der in-situ Perfusion und X-Gal-Färbung eingestellt. Dies unterstreicht erneut die Empfindlichkeit und die Nützlichkeit dieses einfache und kostengünstige Technik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Narketan10 (Ketamin) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Xylazin (Xylazin) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Prequilan (Acepromazin) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Bulldog Typ Serrefine Gefäßklemme </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18051-35 </td><td> gekrümmten, 35 mm </td></tr><tr><td> Plastikbecher mit Deckel </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml Becher mit Deckel </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal); Pulver </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> lösen sich in N, N-Di-Methylformamid bis 40 mg / ml, Lagerung Licht geschützt bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Grundlegende Färbelösung, äquilibriert auf pH 7,1, gelagert Licht geschützt bei 4 ° C für max. 1 Monat </td><td> selbst gemacht </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% Natrium-Desoxycholat </td></tr><tr><td> PolyFreeze Embedding Medium </td><td> Polysciences; Schweizer Vertrieb: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Einbettform </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 Kryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost Dias </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - Aluminium-Sulfat-Lösung </td><td> Abteilung Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, Schweizer Vertrieb: HistoCom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metastasierung ist die häufigste Todesursache in den meisten Krebsarten und daher ein Schwerpunkt in der Krebsforschung. Allerdings bleiben die Detektion von Mikrometastasen durch radiologische Bildgebung und dem Erfolg in ihrer therapeutischen Tilgung begrenzt. Während Tiermodellen erwiesen haben unschätzbare Werkzeuge für die Krebsforschung 1 sein, bleibt die Überwachung / Visualisierung von Mikrometastasen eine Herausforderung und ungenaue Auswertung der Metastasierung in präklinischen Studien möglicherweise zu enttäuschenden Ergebnissen in klinischen Studien 2. Folglich besteht ein großes Interesse bei der Verfeinerung der Methoden, um endlich zu reproduzierbaren und zuverlässigen Nachweis von Metastasen bis in die einzelne Zelle Ebene in normalem Gewebe. Das Hauptaugenmerk liegt daher auf Techniken, die den Nachweis von Tumorzellen in vivo zu ermöglichen, wie Mikro-Computer-Tomographie (Mikro-CT), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Biolumineszenz oder Fluoreszenzabbildung &lt;sup&gt; 3,4. Wir derzeit Optimierung dieser Techniken zur in vivo Überwachung des primären Tumorwachstum und Metastasierung in verschiedenen Modellen Osteosarkom. Einige dieser Techniken können auch für die ex vivo-Analyse von Metastasen neben klassischen Methoden wie qPCR 5, 6 oder FACS verschiedenen histologischen Färbung verwendet werden. Als Maßstab haben wir in der vorliegenden Studie stellte die stabile Transfektion oder Transduktion der Tumorzellen mit dem lacZ Gen, das das bakterielle Enzym β-Galactosidase, die das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D metabolisiert -galactopyranosid (X-Gal) an einen unlöslichen Farbstoff Indigoblau 7 und ermöglicht hochempfindlichen und selektiven histochemische Färbung der Tumorzellen in der Maus Gewebe ex vivo auf der einzigen Zelle Ebene wie hier dargestellt. Dies ist ein Low-Cost-und nicht Geräte-intensive Werkzeug, das eine präzise Validierung von Metastasen 8 in Studien, in denen neue ein ermöglichtticancer Therapien 9-11. Ein limitierender Faktor X-gal-Färbung ist die geringe Unterschied zu blutsverwandten rote Färbung von gut vaskularisierten Geweben wie zB. Im Lungengewebe kann dieses Problem durch in-situ Lungenperfusion, eine Technik, die vor kurzem von Borsig et al. 12, der die Lungen von Mäusen unter Narkose perfundiert, um sie aus dem Blut zu löschen und zu fixieren und diese in-situ unter etabliert gelöst werden Inflation durch die Luftröhre. Diese Methode verhindert auch den Zusammenbruch der Lunge und hält dadurch die Morphologie der funktionellen Lungenalveolen, die die Qualität des Gewebes für die histologische Analyse verbessert. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein neues Protokoll, das ausnutzt einer Kombination von X-gal-Färbung von lacZ-exprimierenden Tumorzellen und in-situ-Perfusion und Fixierung von Lungengewebe. Dieses elegante Protokoll ermöglicht hochempfindliche Nachweis von einzelnen metastatischen Zellen in der Lunge und es uns ermöglicht, in einer aktuellen Studie zu derwähle &quot;ruhend&quot; Lunge Mikrometastasen in einem Maus-Modell 13, die ursprünglich beschrieben wurde als nicht-metastasiertem 14.

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Lungenperfusion und Fixierung und X-Gal-Färbung von<em&gt; LacZ</emTumorzellen&gt;-Tag.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K Aufrufe.  Balgrist University Hospital, Zurich. Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ Lungenperfusion und Fixierung und X-Gal-Färbung von LacZ-Tag.

Serie: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Forschung

Medizin

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these strategies is to examine their effects on heart function. There are several techniques to measure in vivo cardiac mechanics (e.g., echocardiography, pressure/volume relations, etc.). Compared to echocardiography, real-time left ventricular (LV) pressure/volume analysis via catheterization is more precise and insightful in assessing LV function. Additionally, LV pressure/volume analysis provides the ability to instantaneously record changes during manipulations of contractility (e.g., &#946;-adrenergic stimulation) and pathological insults (e.g., ischemia/reperfusion injury). In addition to the maximum (+dP/dt) and minimum (-dP/dt) rate of pressure change in the LV, an accurate assessment of LV function via several load-independent indexes (e.g., end systolic pressure volume relationship and preload recruitable stroke work) can be attained. Heart rate has a significant effect on LV contractility such that an increase in the heart rate is the primary mechanism to increase cardiac output (i.e., Bowditch effect). Thus, when comparing hemodynamics between experimental groups, it is necessary to have similar heart rates. Furthermore, a hallmark of many cardiomyopathy models is a decrease in contractile reserve (i.e., decreased Bowditch effect). Consequently, vital information can be obtained by determining the effects of increasing heart rate on contractility. Our and others data has demonstrated that the neuronal nitric oxide synthase (NOS1) knockout mouse has decreased contractility. Here we describe the procedure of measuring LV pressure/volume with increasing heart rates using the NOS1 knockout mouse model.

This article describes the measurement of murine left ventricular function via pressure/volume analysis at different heart rates.

Herzkatheter in Mäuse, um den Druck Volumen Relationship Maßnahme: Untersuchung der Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Offene Tracheotomie Magensäure Aspiration Mausmodell der akuten Lungenschädigung Ergebnisse in Maximal Akute nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Generation von menschlichen 3D Lungengewebe Kulturen (3D-LTCs) für Krankheit Modellierung

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte

Zusammenfassung

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