Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell Zuschuss (AB), Pardee Stiftung (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY) und einer NSF Graduate Research unterstützt Fellowship (BL). Wir danken den Bordey lab Mitglieder für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Das vorliegende Material ist auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, Incorporated das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovationen.

Ein. Herstellung von Lösungen, Dissection und Vibratom <ol><li> Die Lösungen müssen in der richtigen Osmolarität und pH-Wert (Tabelle 1) hergestellt werden. Verglichen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) wird Dissektion Lösung mit niedrigeren Konzentrationen von Natrium und Calcium, und höhere Konzentrationen an Magnesium hergestellt. Dies ist zu Exzitotoxizität Effekte während des Schneidens zu minimieren. </li><li> Beide Dissektion und ACSF Lösungen müssen mit 95% O 2/5% CO 2 durch Einblasen von mindestens 10 min, um den gewünschten pH-Wert von 7,3 zu erreichen. Gesättigt sein </li><li> Bereiten Sie ein Eisbad in einem Tablett. Legen Sie eine Dissektion Platte im Eisbad und füllen mit Dissektion Lösung. Blase die Dissektion Platte. </li><li> Bereiten Sie die Vibratom durch die Schaffung eines Eisbad. Legen Sie das Schneiden Gericht im Eisbad, füllen Sie die Schale mit Dissektion Lösung und Blase. </li><li> Füllen Sie das Slice-Aufnahmekammer mit ACSF und Blase, diese Lösung zu gewährleisten ausreichend belüftet unabhängigvon denen Scheiben angeordnet sind. </li></ol> 2. Removal of Brain Tissue Akute Hirnschnitten tendenziell gesünder mit jüngeren Mäusen. Die postnatale SVZ die zelluläre Architektur in Nagetieren ist reif rund postnatalen Tag (P) 20 1. Deshalb versuchen wir, unseren Experimenten zu Maus Alter von P20-P30 zu begrenzen, aber wir haben erfolgreiche Versuche bei Mäusen so alt wie die 3 Monate durchgeführt. Während der gesamten Handhabung des Gewebes, muss man darauf achten, die mechanischen Bewegungen und Druck auf das Gehirn zu minimieren, halten gekühlten Bedingungen, und setzen die SVZ zur Lösung so schnell wie möglich nach der Tötung. <ol><li> Nach Injektion von Pentobarbital wird die Maus schnell enthauptet. Das Fell wird entfernt und Einschnitte durch die Basis des Schädels hergestellt. Der Kopf wird dann in eine Schale mit Dissektion Lösung gefüllt war. </li><li> Während Stabilisierung des Kopfes mit einer Pinzette, kontinuierliche Schnitte um den Schädel gemacht und manchmal bis zur Mittellinie mit Microscissors. Seien Sie vorsichtig, um den Kontakt mit dem Gewebe zu minimieren. Da der Riechkolben ist das endgültige Ziel der neugeborenen Neuronen aus dem SVZ, muss man darauf achten, bewahren diese Region, vor allem während Knochenentfernung in dieser Gegend. Microscissor Schnitten um den Schädel sollten auf der dorsalen Seite zu sein, um für ein leichtes Entfernen des Schädels zu ermöglichen. </li><li> Entfernen des Schädels über dem Gehirn wird nun aus den Knochen unterhalb des Gehirns getrennt. Wenn Schnitte im vorherigen Schritt richtig gemacht sind, kann dies darüber liegenden Knochen leicht mit einer Pinzette oder einer Pinzette entfernt werden. </li><li> Halten Sie den Kopf mit einer Pinzette, kann man einem Skalpell sauber zu entfernen mehrere Stücke von Hirngewebe vor Slicing, wie die folgenden. Ein koronalen Schnitt kann auf der Ebene der Lambda erfolgen. Sagittalen Schnitte auf beiden Seiten des Gehirns lateral der SVZ erfolgen. Eine konservative Schätzung würde ~ 2,5 mm von der Mittellinie liegen. Falls gewünscht, kann das Gehirn auch hier hemisected werden. Diese Kürzungen werden sowohl facilitate Befestigung des Gewebes und damit die SVZ mehr schnell erreicht werden beim Gehirn schneiden. Es ist wichtig, sich zu erinnern, die minimale Menge von mechanischen Kräften auf das Gehirn (zB nicht Schieben oder Ziehen) auszuüben. </li></ol> 3. Akute Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Um für die weiteren Schritte vorzubereiten, sicherzustellen, dass die Super-Klebstoff verwendet werden, um das Gewebe zu montieren frei von Verstopfungen und bereit für die Vibratom Platte anzuwenden. Es ist wichtig, möglichst schnell gehen, ohne Schädigung des Gehirns. </li><li> Das Hirngewebe kann dann von unten, die das Gewebe trennt sich von den darunter liegenden Knochen gleichzeitig trennt Nerven geschöpft werden. </li><li> Das Gewebe wird fertig verklebt auf einer Platte und auf dem Vibratom. Aufgrund der rostral-kaudale Anatomie des SVZ, haben wir uns darauf sagittale Schichten, wie es die wandernden Weg der Neuroblasten, die Gliazellen Scheide und das Gefäßsystem, die weitgehend in diese Richtung ausgerichtet sind konserviert konzentriert. Man kann entweder mount das Gewebe an der Mittellinie oder auf der flachen Oberfläche, indem sie sagittalen Schnitte quer zur SVZ erstellt. Ein optionaler Schritt ist, eine 3% Agarose Block hinter dem Gewebe zu platzieren, um als Anschlag zu der Klinge dienen als die Scheiben abgehen. Wir bevorzugt Cyanoacrylat-Basis Superkleber verwendet. </li><li> Spülen Sie die Klinge mit Ethanol zur Beseitigung von Ölen und spülen mit destilliertem Wasser. Zeigen die Klinge am Klingenhalter. Montieren Sie den Messerhalter der Vibratom. </li><li> Passen Vibratom Einstellungen, um Gewebe in einer Dicke von 250 bis 350 um pro Scheibe geschnitten. Es ist wichtig, um den Vorgang mit hochfrequenten Schwingungen und mit geringer Geschwindigkeit. </li><li> Abschnitt progressiv durch das Gewebe. Das Aussehen der Riechkolben ist ein guter Indikator dafür, dass ein in der Nähe des SVZ in sagittaler Scheiben als die meisten seitlichen Scheiben weder Region enthalten wird, ist. Weitere Sehenswürdigkeiten zu suchen sind die Herzkammer und die Verdickung des Corpus callosum, unter dem die SVZ befindet. Die SVZ erscheint in mehreren seitlichen Sagit erstental Scheiben schneiden. Das RMS wird im medialen sagittalen Schnitte zeigen. </li><li> Entfernen Sie Scheiben mit der SVZ mit einem Kunststoff-Pasteurpipette mit der Spitze abgeschnitten. Übertragen auf die Scheibe Aufnahmeraum. Wir erhalten oft mehr Scheiben als wir in einem Werk Tag nutzen können. Allerdings werden Scheiben von der Menge der Zellen, die das SVZ variieren. Es ist manchmal notwendig, um durch mehrere Scheiben schauen, um ein für die Bildgebung gewünschte zu finden. </li></ol> 4. Vorbereitung Mikroskop und Farbstoffe Die Scheiben müssen eine Stunde Inkubationszeit in ACSF von der Dissektion und Schneiden erholen. Mehrere Schritte können während dieser Scheibe Erholungsphase durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung von Pipetten für Calcium Farbstoff und / oder Drug Application <ol class="lalpha"><li> Glaspipetten benötigen, um eine Spitze von 2-3 um Durchmesser und einer Spitze Länge (~ 2 mm) und Winkel (~ 16 ° für den Pipettenhalter), die Kontakt mit dem verhindert Perfusionskammer haben und erlaubt eine Platzierungdas Ziel. </li><li> Man kann in der Regel bereiten 6-8 Druck Pipetten für jeden Tag der Experimente. </li></ol></li><li> Calcium Farbstoffzubereitung <ol class="lalpha"><li> Bei der Herstellung der Arbeitslösung (4-5 uM durch Bad, 250 uM durch Druck-Anwendung), ist es am besten, um die minimale Menge an DMSO, um Zellen aussetzen. Dies kann durch hochkonzentrierte Bestände erreicht werden kann. Zum Beispiel für Fluo-4, ist ein Rohr, enthaltend 50 g pro Tag verwendet wird. Man kann eine 10 mM Vorratslösung dieses Aliquot durch Zugabe von 4,6 ul Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO machen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Mikroskop-Setup (Abbildung 2). <ol class="lalpha"><li> Verwendung einer peristaltischen Pumpe für einen Lösungsfluß half Bilddrift minimieren. Führen Sie die Schlauchpumpe vor, damit ACSF durch die Perfusion verlaufen und sicherzustellen, dass es blasenfrei ist. </li><li> Röhren-Einlass auf der Perfusionskammer und sicherzustellen, dass keine Leckagen. </li><li> Positionieren Sie den Vakuum-Spitze ensure, dass die Lösung, die ausgewählt ist aus der Perfusionskammer abgesaugt. Sicherzustellen, dass er auf einem adäquaten Niveau ist so, dass das Ziel die richtige Arbeitshöhe Abstand eingetaucht wird, aber nicht so hoch, so daß Lösung kann über die Kammer gelangt. Ein niedriges Niveau der Lösung minimiert auch Flow Verzerrungen. Eine ständige Streben können auch durch das Hören für Stabilität überprüft werden. </li></ol></li></ol> 5. Dye Loading Dieses Verfahren ist im Detail in einer anderen Manuskript 2 beschrieben. Bitte siehe Abbildungen darin. <ol><li> Bath Ladefarbstoff <ol class="lalpha"><li> Machen Sie eine 1-2 ml Arbeitslösung des Farbstoffes. Für Fluo-4 AM, ist eine Konzentration von 4-5 uM ausreichend für die Kennzeichnung SVZ Neuroblasten. </li><li> Scheiben werden zunächst für eine 35 mm Kulturschale mit einem Siebeinsatz, das bereits mit ACSF gefüllt übertragen. Ersetzen Sie die Lösung unter Verwendung eines 3 ml Kunststoff-Pipette vorsichtig entfernen ACSF, während gleichzeitige Zugabe des calcium Farbstoff funktionierende Lösung. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 30-60 min in einer 5% CO 2-Gas-kontrollierten Umgebung. </li><li> Legen Sie die Scheibe wieder in den ACSF gefüllte Vorratskammer abzuwaschen Farbstoff, keine Zellen eingegeben hat. Alternativ kann man sie direkt auf den Mikroskop Perfusionskammer, auf dem ACSF wird. Diese Wäsche beträgt 30-45 min. </li><li> Übertragen Sie das Slice der Perfusionskammer. </li></ol></li><li> Druckbeaufschlagung von Farbstoff <ol class="lalpha"><li> Übertragen der Scheibe von der Haltekammer zum Perfusionskammer am Mikroskop Setup. </li><li> Füllen Sie ein Glas Pipette mit eine funktionierende Lösung, die 250 uM und auf den Mikromanipulator ist. </li><li> Senken Sie die Pipette in die Region von Interesse. Die Pipette kann derart platziert werden, dass die Spitze entweder mehrere Mikrometer über der Scheibenoberfläche oder vergraben mehrere Mikrometer unterhalb der Scheibenoberfläche, aber entfernt von der aufgenommenen Region. Der Winkel der Pipette nicht Affect das Laden Effizienz. Bei der Abbildung unterhalb der Scheibenoberfläche, finden wir, dass die Platzierung der Pipettenspitze unterhalb der Bildebene wird von uns gewünschten Bildbereich besser kennzeichnen. </li><li> Wenn der Druck der Farbstoff Anwendung, stellen Sie den Picospritzer so dass es &lt;3 psi ist. Wir haben nicht das Volumen der Farbstoffdiffusion geschätzt, weil diese unterliegt Schwankungen der Pipettenspitze Durchmesser, angelegten Druck, und der Dichte des Gewebes, wo der Farbstoff injiziert. Wir wenden einfach, bis wir unsere gewünschte Beladung zu erreichen, wie mit dem Auge beurteilt. Minimieren Beschädigung der Scheibe während der Applikation, insbesondere, wenn die Spitze unterhalb der Scheibenoberfläche angeordnet ist. Bewerben Sie sich für 1-2 min. Manchmal wiederholten Anwendungen notwendig sind je nach Kennzeichnung als mit dem Auge beurteilt. Aus diesem Konzentration und Anwendungsdauer, finden wir, dass Oberflächen Anwendung der Farbstoff bevorzugt beschriftet Neuroblasten, während unter der Oberfläche Anwendung bevorzugt beschriftet Astrozyten. Allerdings wird&gt; 3 min Anwendung bei 500 uM auch benennen Neuroblastenunabhängig davon, ob die Spitze oberhalb oder unterhalb der Scheibenoberfläche (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Lassen Sie für Wasch-und Slice-Recovery für 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Konfokalen Imaging von Calcium Activity <ol><li> Finden Sie die Region von Interesse zunächst mit einer geringeren Leistung Ziel wie 4x oder 10x. Platz in der Mitte des Feldes vor dem Wechsel zu einer höheren Macht Ziel. An diesem Punkt kann ein allgemeiner slice Gesundheit mit der Feststellung, das Aussehen der SVZ-Zellen unter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) zu beurteilen. Gesunde Zellen erscheinen rund und plump. Darüber hinaus werden gesunde Zellen anzuzeigen schwachen Fluo-4 Belastung wie zu keiner Belastung bei allen oder helle Fluoreszenz (eine sterbende Zelle) angenommen. </li><li> Senken Sie das Wasser-Immersions-Objektiv auf die Region von Interesse, welche nun farbstoffbeladenen. Entweder ein 40x oder 60x Ziel war für unsere Bedürfnisse ausreichend, obwohl 40x bietet ein breiteres Sichtfeld und ermöglicht eine größere Pipette Zugang. Bei der Abbildung unterhalb derOberfläche, wir gehen oft mindestens 15 &amp;mgr; m unterhalb der Scheibe Oberfläche, wo die 3-dimensionale Architektur und Zell Gesundheit besser erhalten bleiben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Perfusion und Vakuum werden angemessen funktioniert. </li><li> Richten Sie das Mikroskop, so dass Zeitraffer-Auflösung und räumliche Auflösung gewünschten Raten eingestellt sind. Für die konfokale Mikroskopie, müssen diese Faktoren als Erhöhung Zeitauflösung ausgeglichen werden gewöhnlich zu einem Verlust an räumlicher Auflösung aufgrund der Scanbewegung Natur des Systems. Für Calcium Aktivität haben wir einen Rahmen etwa jede zweite mit einem 512x512 Bildpunkten abgebildet. Wenn mehrere Kanäle separat erworben notwendig sind, wird sich dies auch auf Abtastraten. Stellen Dauer der Film (2-10 min). </li><li> Initiieren laufen. Wenn die Durchführung pharmakologischer Studien, auf Antagonisten oder nicht-desensibilisierenden Agonisten waschen für mindestens 5-10 min, und dann noch einen Film von 5-10 min. Agonisten, die Rezeptoren desensibilisieren kann akut können angewendet werden, wie beispielsweise durch Verwendung einer prEssure Pipette durch einen Mikromanipulator gesteuert. </li></ol> 7. Calcium Analyse Analyse folgt Standardverfahren, dass wir in pervious Veröffentlichungen beschrieben 2-4. F 0 (dh Baseline) und F sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten über alle Regionen von Interesse (ROI) und in jedem ROI gemessen. Eine Änderung in der Fluoreszenz wurde als ein Ca 2 + Erhöhung sein, wenn es&gt; 15% war F / F 0 erhöhen. Intrazellulärer Ca 2 + Veränderungen wurden anhand Calsignal 5. 8. Repräsentative Ergebnisse Wir waren in der Lage, um eine selektive Beladung von SVZ Zellen in Abhängigkeit von den Farbstoff Belastungsprotokolle oben beschrieben und anderswo 2-4,6 erhalten. Bath Belastung oder Druck-Anwendung auf dem Scheibenoberfläche Fluo-4 AM (4-5 oder 250 uM, jeweils) Etiketten meist Neuroblasten. Während der Druck-Anwendung laden können neurobdauert schneller als Badbelastung in einer einzigen Scheibe, ermöglicht Badbelastung die gleichzeitige Laden von mehreren Scheiben. Wir bestätigen die Identität von markierten Zellen als Neuroblasten durch (1), ob sie Zugverhalten 4,7, (2) ihre Morphologie, (3) eine negative Färbung des Sulforhodamin 101, eine Astrozyten-spezifischen Farbstoff 3 oder (4) eine positive Färbung mit Display DCX-DsRed Ausdruck (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Neuroblasten schnell migrieren (durchschnittlich 60 um / h) bei physiologischen Temperaturen 4,7-9, aber ihre Bewegung kann leicht beobachtet werden, selbst bei Raumtemperatur. Die Bewegung der Neuroblasten nicht stellen ein Problem in Bezug auf Platzierung regions-of-interest (ROI) von Calcium-Aktivitäten zu verfolgen, da unsere Filme sind in der Regel von kurzer Dauer. Doch während lange Wartezeiten, wie zum Beispiel während Arzneimittellösung Austausch, müssen die Ermittler vorsichtig sein, um ROIs in Kontroll-und Behandlungsgruppen Zeiträume entsprechen. Es ist nicht ungewöhnlich für Neuroblasten in das oder aus dem i migrieren<html> Maging Feld oder Brennebene. Pressure Anwendung von Fluo-4 AM (250 uM) tief in die Scheibe und für begrenzte Dauer (&lt;2 min) bevorzugt beschriftet SVZ Astrozyten 2. Astrocyten Etikettierung durch positive Markierung mit Sulforhodamin 101 und ihre Morphologie verifiziert worden, insbesondere durch das Vorhandensein von Vorsprüngen und endfeet auf Blutgefäße, die neu 3 beschrieben haben. Mit diesen Methoden haben wir spontane Aktivität sowohl in der SVZ Neuroblast und Astrozyten Population (Abbildung 1) beobachtet. Die Aktivität in Astrozyten nimmt oft die Form von Wellen, die Blutgefäß 3 eingreifen. Darüber hinaus mit Calcium-Imaging als Assay wurde die Anwendung von pharmakologischen Agonisten offenbart oder bestätigt Expression von GABA A-Rezeptoren auf Neuroblasten und Astrozyten 6, Rezeptoren AMPA und NMDA auf Neuroblasten 4. Figures 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Propagierung von Calcium Aktivität in Astrozyten. (A) Repräsentative gemittelt Bild aus einer Zeitraffer-Aufnahme von Kalzium Aktivität. Astrozyten im SVZ wurden mit Druck Anwendung von Fluo-4 geladen Uhr in die Scheibe tief. Filme wurden bei 0,75 s Zeit-Schritten erworben. Regions of Interest (ROI) über Zellen, die eine Tätigkeit gelegt. (B) von Spuren platziert ROIs über Zellen, die aus dem Film in (A) dargestellt. Spuren wurden mit einem gleitenden Durchschnitt und normalisierte gefiltert. Die vertikale Skala repräsentiert 2 x &amp;Dgr; F / F 0, wobei F die Signalintensität und F 0 der mittlere Ausgangswert-Signal und AF = FF 0. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bild des Perfusionssystem. Ein Ende der Röhre wird in 95% O 2/5% CO 2-Gas-p untergetauchterfused Lösung. Die Lösung wird dann durch das Rohr und der Badkammer durch eine peristaltische Pumpe (nicht dargestellt) perfundiert. Das andere Ende ist in die Lösung Einlass der Badkammer montiert auf einer Plattform eingefügt. Die Absaugspitze wird dann zu der Lösung Auslass der Kammer angeschlossen und auf einer Ebene zur Lösung Höhe zu bestimmen. Aus der Steckdose, ist die Absaugspitze mit der Vakuumleitung, welche die Lösung ansaugt aus der Kammer in einen Abfallbehälter verbunden ist. Die Perfusion wird aus dem Mikroskoptisch für visuelle Klarheit dargestellt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Calcium Bildgebung SVZ Zellen verwendet wurde, um Muster in spontaner Aktivität in Neuroblasten 10, Rezeptorkanals Expression in beiden Neuroblasten und Astrozyten und 4,6,8 astrozytären Calciumwellen 3 studieren. Da Zellen in der SVZ entweder unreif sind oder glialen Eigenschaften, sie nicht feuern Aktionspotentiale 11,12, was bedeutet, dass Millisekunde Veränderungen in Spannungspotential indikativ Aktivität in reifen Netzen nicht anwendbar ist in dieser Region. Daher er...

<table border="1"><tbody><tr><td> Solute </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Dissection (mM) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mM ACSF: 126 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Chemical Liste und Rezepte der Dissektion Lösung und ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Header] </td></tr><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold oder 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue oder 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Tools </td><td> Roboz oder Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-01.00 Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV300 oder FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser-Immersions-Objektive </td><td> Olymp </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulatoren </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Druckregler &lt;/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI während der Anwendung </td></tr><tr><td> Pipette puller </td><td> Sutter oder Narshige </td><td> Sutter P-97 oder Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Glaspipetten </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Schlauchpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modell 720 </td><td> Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Chamber Bad </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> Low-Profil ermöglicht eine objektive Abstand </td></tr><tr><td> Rohr </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materialien / Geräte Liste.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

Die subventrikulären Zone (SVZ) ist einer der beiden neurogenen Zonen in der postnatalen Gehirn. Die SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen mit astrozytären Funktionen (genannt SVZ Astrozyten), Neuroblasten und mittleren Vorläuferzellen. Neuroblasten in der SVZ geboren tangential migrieren eine große Entfernung zum Riechkolben, wo sie differenzieren sich in Interneuronen. Interzelluläre Signalisierung durch Adhäsionsmoleküle und diffusionsfähigen Signale spielen wichtige Rollen bei steuernden Neurogenese. Viele dieser Signale auslösen interzellulären Kalzium-Aktivität, die Informationen innerhalb und zwischen Zellen überträgt. Calcium-Aktivität ist deshalb reflektierenden der Aktivität von extrazellulären Signalen und ist eine optimale Möglichkeit, funktionelle interzellulären Signalisierung zwischen SVZ Zellen zu verstehen. Calcium-Aktivität wurde in vielen anderen Regionen und Zelltypen, einschließlich reife Astrozyten und Neuronen untersucht worden. Allerdings ist die traditionelle Methode, um load-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff (dh Badbelastung) war nicht beim Laden alle SVZ Zelltypen effizient. Tatsächlich schließt die Zelldichte in der SVZ Farbstoffdiffusion innerhalb des Gewebes. Darüber hinaus wird die Vorbereitung sagittalen Schnitten bessere Erhaltung der dreidimensionalen Anordnung SVZ Zellen, insbesondere der Strom der Neuroblast Migration auf dem rostralen-kaudalen Achse. Hier beschreiben wir Methoden, um Sagittalschnitten mit der SVZ, die Belastung der SVZ-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff und den Erwerb von Kalzium Aktivität mit Zeitraffer-Filme erstellen. Wir verwendeten Fluo-4 AM Farbstoff zum Laden SVZ Astrozyten unter Druck Anwendung innerhalb des Gewebes. Calcium-Aktivität wurde mit einem konfokalen Mikroskop ermöglicht eine genaue Auflösung zur Unterscheidung von einzelnen Zellen. Unser Ansatz ist auf andere Zonen einschließlich neurogener der erwachsenen hippocampalen subgranularen Zone und embryonalen neurogenen Zonen. Darüber hinaus können andere Arten von Farbstoffenunter Verwendung des beschriebenen Verfahrens werden.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Serie: Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...