Die Autoren möchten dem Labor von Dr. Carol Kim für die Mikroinjektion Ausbildung, Clarissa Henry um Rat danken über die Beschleunigung Embryo-Entwicklung und Nutzung von Geräten, und Nathan Lawson für den Beitrag FLI1: EGFP Fisch. Wir danken Mitglieder der Wheeler-Labor und Shawn Wände für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten auch Mark Nilan für Fische Betreuung und Beratung, und Ryan Phennicie und Kristin Gabor für technische Beratung bezüglich dieses Projektes bedanken. Diese Arbeit wurde von einem MAFES Forschung Assistenzzeit an K. Brothers, ein MAFES Hatch Zuschuss E08913-08, und ein NIH NCRR Auszeichnung P20RR016463 zu R. Wheeler finanziert.

Alle Zebrafisch Pflege-Protokolle und Experimente wurden unter Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokoll A2009-11-01 durchgeführt. 1. Morpholino und Larven Injection Dishes Experimentelle Dauer: * (10-15 Minuten) Schwierigkeitsgrad: * <ol><li> Für Ei-Injektionen, bereiten Sie einen 2% igen Lösung in sterilem Wasser und Mikrowelle. Wenn die Lösung abgekühlt ist schütten einen Teil davon in eine extra tiefe Petrischale (Fisher Scientific), bis er halb voll ist. Cool auf Eis und sicherstellen, dass die Platte waagerecht steht. </li><li> Sobald die Schale abgekühlt ist, gießen Sie einen 15-ml-Deckschicht aus 2% Agarose. Sprühen Sie ein Ei Injektion gerillten Kunststoff-Form (Adaptive Science Tools) mit sterilem Wasser aus einer Sprühflasche. Legen Sie das Werkzeug Nut Seite nach unten in die heiße Agarose. Wenn die Agarose abgekühlt ist, mit einem flachen Spatel aus Metall (VWR Scientific), die Form aus der AGA distanzierenstieg. Entfernen Sie langsam das Gitter aus der Agarose. Wrap Embryo Injektion Gerichte in Parafilm (VWR Scientific) und bei 4 ° C invertiert </li><li> Für Fisch-Larven-Injektionen, bereiten Sie einen 2% igen Lösung, wie beschrieben. Füllen Sie die Lösung in eine Standard-Größe Petrischale (VWR Scientific) und beiseite stellen, bis sie erstarrt. Wrap Larven Injektion Gerichte in Parafilm und lagern bei 4 ° C invertiert </li></ol> 2. Pilzkultur Vorbereitung Versuchsdauer: ** (30 Minuten) Schwierigkeitsgrad: ** <ol><li> Planen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-Agarplatten: 10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose und 20 g / l Agar in und Autoklaven. Für YPD-Flüssigkeit herzustellen 10 g / l Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / l Dextrose und Autoklav 20-30 Minuten bei 121 ° C </li><li> Zwei Tage vor dem Fisch-Infektionen bereiten einen Streifen Platte aus gefrorenemAktien von Candida albicans Kulturen auf YPD-Agar, um einzelne Kolonien zu erhalten. </li><li> Bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Setzen Sie 5 ml YPD-Brühe in 16 x 150 mm Kulturröhrchen (VWR Scientific). </li><li> Am Tag vor der Fisch-Infektionen holen 1 kleine Kolonie an der YPD-Agar mit einem hölzernen Dübel (VWR Scientific). Setzen Sie den Stick in die Röhre Kultur und wirbeln um zu resuspendieren Kolonie in der YPD-Flüssigkeit. </li><li> Wachsen bei 37 ° C über Nacht auf einem TC-7 Tissue Culture Bandage mit einem 14-Zoll-Rad Reagenzglas (New Brunswick Scientific) ausgestattet. </li><li> Am nächsten Tag, der Spin-Down 1 ml Kultur bei 14000x g für 1 Minute in einem 1,7 ml Röhrchen (Axygen). Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in Restflüssigkeit durch Vortexen (VWR Scientific). </li><li> 1 mL 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (VWR Scientific) und Spin wie zuvor beschrieben. </li><li> Wiederholen Sie den PBS 3 x waschen. </li><li> Verdünnung 1:100 Verdünnung in 1x PBS (10 ul gewaschene C. albicans in 990 ul 1x PBS). </li><li> Rechnen Sie mit einer Zählkammer (VWR Scientific). </li><li> Verdünnen auf 10 7 Zellen / ml. </li></ol> 3. Zebrafisch-Infektionen Experimentelle Dauer: **** (1-3 Stunden) Schwierigkeitsgrad: **** <ol><li> Sammle Embryonen gemäß § 5 und lagern in Ei-Wasser, 60 mg / L Instant Ocean Salze (Fisher Scientific) in sterilem, deionisiertem Wasser. </li><li> Mit einem Binokular wie dem Olympus SZ61 (Olympus), dechorionate Embryonen auf Infektion Tag. Verwenden Sie Dumont Dumoxel Pinzette (VWR Scientific), um das Chorion 27 auseinander ziehen wie das Öffnen einer Tüte Chips oder sanft stoßen die Pinzette in der geschlossenen Position in die Chorion und dann langsam öffnen. Die Fische sollten Recht herausspringen des Chorion. </li><li> Swirl das extra tiefe Petrischale mit dem Deckel auf, um Fische in der Mitte der Schale zu bewegen. Übertragen Fische mit dem Deckel der Schale. Entfernen Sie Ei-Wasser-undersetzen Sie sie durch frische Medien. Fisch hinzufügen, um Medien. </li><li> Warme Gerichte Larven Injektion in einem Brutschrank bei 28 ° C. Bereiten Tricain Methansulfonat (Western Chemical Inc.) Verdünnung bei 200 ug / ml für Fische betäuben. </li><li> Zählen Sie die gewünschte Anzahl von Larven für Infektionsforschung (20-50 Fische). Setzen Sie Fisch in Tricain Methansulfonat Lösung und warten Sie 1-2 Minuten, bis sie zum Stillstand kommen. </li><li> Schalten Sie den MPPI-3 Einspritzeinheit (Applied Scientific Instruments). Sicherstellen, dass der Druckschalter ist auf &quot;Impuls&quot; und die &quot;Pulsdauer&quot; ist mit 3 bis 9 für die PSI-Gegendruck-Einheit eingestellt. Öffnen Sie das Ventil auf die Stickstoff-Tank, bis der Druck auf die Spritzeinheit 30 PSI liest. </li><li> Legen Sie eine gezogen Mikropipette 28 mit 5 ul gevortexten Candida albicans bei einer Konzentration von 1x10 7 Zellen / ml. Legen Sie die Mikropipette in der Mikropipette Halter (Applied Scientific Instruments). Füllen Sie eine leere extra tiefe Petrischale mit Wasser. Bewegen Sie die Mikropipette, bis die Spitze is in Sichtweite nur die Berührung der Oberfläche des Wassers über Seziermikroskop und Nutzung Dumont Dumoxel Pinzette (VWR Scientific), um die Nadel etwa 3 mm von der Spitze der Pipette gezogen Clip. </li><li> Drücken Sie den Fußschalter (Applied Scientific Instruments) zu überprüfen, die Nadel wurde abgeschnitten. Sie sollten sehen, die Flüssigkeit zu dispergieren, wenn Sie erfolgreich waren. Der Durchmesser des flüssigen Bolus sollte nicht größer als der Durchmesser der Pupille des Prims 25 Zebrafischlarve (0,21 mm, was eine Kugel von 4,9 nL in Volumen). Passen Sie den Druck entsprechend, wenn die Flüssigkeit Bolus zu groß oder zu klein ist. </li><li> Betäuben die Fische in Tricain Methansulfonat (200 pg / ml). Sobald die Fische haben aufgehört sich zu bewegen, schwenken Sie die Schale mit dem Deckel auf, bis die Fische sind in der Mitte. Sammle 50 Fische mit einer Transferpipette (Fisher Scientific). Tippen Sie auf die Seite der Pipette, um die Fische gegen die Spitze zu begleichen. Vorsichtig pipettieren Fisch auf die Larven-Agarose Schüssel mit so wenig Flüssigkeit wie möglich. </li><li> Line-up den Fisch mit einer glatten Glasstab (darauf achten, nicht zu zerdrücken!). Saugen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus der Schale. Verwenden Sie einen Kimwipe Docht entfernt, um keine Feuchtigkeit. </li><li> Positionieren Sie den Larven Agarose Gericht mit Fisch unter dem Mikroskop, bis Sie eine gute Sicht auf die Fische und die Nadel zur gleichen Zeit zu bekommen. Bewegen Sie das Glas Nadel gegen den Fisch. Vergrößern Sie sowohl den Fischen und Nadel, wie Sie die Nadel gegen die Fische zu positionieren. Bringen Sie den Glas-Nadel in das Ohr Vesikel 27, 29 (Ohr) des ersten Fisch. Du wirst wissen, wenn Sie die Nadel in die Fische sind umgezogen, weil, wenn Sie den Fußschalter (Applied Scientific Instruments) zu drücken, das Hinterhirn Ventrikel hebe leicht. </li><li> Drücken Sie den Fußschalter (Applied Scientific Instruments) und beobachten Sie die Flüssigkeit im Inneren des Fisches Hinterhirn Ventrikel 27 zu verteilen. Ziehen Sie die Nadel aus der Fisch-und Umzug in den nächsten Fisch. Wiederholen Sie den Vorgang, bis Sie alle Fische auf dem Teller haben, injiziert. Entfernen Sie alle dEAD Fisch und injizieren Ersatz zu halten, die Zahl richtig (50 Fische). Für jede Gruppe von 50 Fischen injiziert eine neue Mikroinjektionsnadel vorbereitet werden müssen, oder die C albicans lässt sich in der Unterseite der Nadel und verstopft, oder wirft die Konzentration injiziert. </li><li> Waschen Sie den Fisch aus der Schale, durch Verdrehen der Schale und Ei-Spritzen Wasser auf die Fische in ein sauberes extra tiefe Petrischale mit 60 ml Wasser-Ei. Es ist wichtig, nicht um die Fische auf dem Agarose länger als 15-20 Minuten zu verlassen, oder sie werden austrocknen und sterben. </li><li> Wiederholen Sie die gesamte Einspritzvorgang bis zum Ende. Vergessen Sie nicht, PBS und nicht-pathogene injiziert Kontrollen. </li><li> Wenn Sie fertig sind, halten die Fische bei 28 ° C </li><li> Schließen Sie das Ventil Stickstofftank. Bewegen Sie die Spritzeinheit Schalter von &quot;Puls&quot; bis &quot;stetig&quot;, um den Druck in der Tankleitung zu entlasten, sollte der Druck auf Null an dieser Stelle fallen zu lassen. Schalten Spritzeinheit zurück zu &quot;Puls&quot;. Schalten Sie die Spritzeinheit und säubern Sie den Arbeitsbereich. </li></ol&gt; 4. Vorbereiten der Fische für Imaging Versuchsdauer: ** (30 Minuten) Schwierigkeitsgrad: ** <ol><li> Bereiten Tricain Methansulfonat Lösung wie vorher (200 pg / ml). Raus aus infizierten Fischen, und überführen sie in Tricain. </li><li> Bereiten 47,9 ml 0,4% low-melt Agarose (VWR Scientific) in Ei-Wasser. Erhitzen Sie die Lösung durch die Mikrowelle. Abkühlen auf 37 ° C und Add Tricain Methansulfonat (200 pg / ml) zur Mischung </li><li> Sobald Fische werden in Tricain Methansulfonat, Pipette einzelnen Fische in eine Petrischale (VWR Scientific) mit 0,4% niedrig schmelzende Agarose (VWR Scientific) immobilisiert. </li><li> Anschließend bewegen Sie den Fisch aus niedrig schmelzenden Agarose in einzelne Vertiefungen einer Glasboden-Spiegel (MatTek Corporation) für die Bildgebung. Verwenden Sie so wenig niedrig schmelzende Agarose wie möglich, damit der Fisch liegt flach auf dem Boden der Schale. Verwenden Sie nur genug von der Tricain-Agarose zu füllen in derner Kreise der Glasboden Gericht. </li></ol> 5. Änderungen im Bereich der Protokolle Jupiter Mikropipetten für die Mikroinjektion Experimentelle Dauer: * (10-15 Minuten) Schwierigkeitsgrad: * <ol><li> Ziehen hohlen Glasstäbe BF120-69-10 (Sutter Instruments) mit einem Flaming Brown Feinpipettenziehvorrichtung Modell P-97 (Sutter Instruments) nach Yuan et al. 30. Wählen Sie Programm Nr. 7 mit der folgenden Bedingungen Hitze = 470, Velocity = 120, Time = 200. Das resultierende Nadel 8 mm von der Spitze und dem Kegel, einmal in 3 mm über die Spitze hat einen Durchmesser von etwa 10 um abgeschnitten. </li><li> Legen Sie eine Glasmikropipette in die Halterungen. Wählen Sie &quot;Ziehen&quot;. Der Heizfaden die Nadel nach den Programm-Parameter und der Glasstab wird in zwei gezogen Mikropipetten trennen zu erwärmen. Shop Mikropipetten in einer Pipette Aufbewahrungsbox (SuttER Instrumente). </li></ol> Embryo-Entnahme-, Morpholino-Injektion und Wartung Experimentelle Dauer: *** (1-2 Stunden) Schwierigkeitsgrad: *** <ol start="3"><li> Sammeln Embryonen gemäß den Verfahren von Rosen et al. 31. Verwenden Sie einen Kunststoff-Sieb (Wares von Knutsford), um Eier aus dem Laich-Tank (aquatische Habitate) zu sammeln. Halten Sie das Sieb auf den Kopf über eine extra tiefe Petrischale und spülen mit Wasser Tank, um Eier zu sammeln. </li><li> Für Morpholino Vorbereitung, fügen Sie 300 ul sterilem Wasser auf 300 Nanomol Morpholino (GeneTools, LLC). Daraus ergibt sich eine Arbeitsgruppe Bestand von 1,0 mm. </li><li> Überprüfen der Konzentration des Morpholino unter Verwendung eines Nanodrop (Thermo Scientific). Wählen Sie &quot;Nukleinsäure und ändern Sie den Typ auf Probe&quot; Anderen &quot;und Wellenlänge auf 265. Geben Sie die Konstante durch Multiplikation des Molekulargewicht des Morpholino durch 1000 dividiert durch die absorptivity-Koeffizienten in der Morpholino-Oligo Karteikarte notiert. </li><li> Blank die NanoDrop mit 2 ul 0,1 N HCl. Verdünnen Sie 5 ul der Morpholino-Lösung in 95 ul 0,1 N HCl (20x Verdünnung). Setzen Sie 2 ul der Verdünnung auf dem Podest, und klicken Sie NanoDrop Maßnahme. Multiplizieren Sie die Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor (20). Man erhält eine Arbeitskonzentration von Morpholino ist. Um die millimolaren Konzentration zu berechnen unterteilen die Konzentration durch das Molekulargewicht der Morpholino erhalten. </li><li> Bereiten Sie eine Bilanz der Arbeit in Danieau Morpholino-Puffer (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,6) und 0,01% Phenolrot (VWR Scientific). </li><li> Für Morpholino Injektion Arbeiten folgen dem Protokoll nach Rosen et al. Und 31 Yuan et al. 30. Spülen Sie Morpholino Injektion Gerichte mit Ei-Wasser und warm bei 28 ° C für 15 Minuten. Entfernen von Wasser aus Injektion Gerichte und ein Line-Up-cell Embryonen in die Nuten der Injektion Schüssel (hergestellt aus Abschnitt 1) ​​mit einer Pipette. Jede Platte wird ein Fassungsvermögen von ungefähr 250 Eier. Inject 1-2 Zell-Stadium Embryonen mit Morpholino. Eier werden in der Ein-Zellen-Stadium für 15 Minuten 27 verbleiben. </li><li> Spülen Sie injizierten Eier mit Ei-Wasser, wenn Sie fertig (sterilem, deionisiertem Wasser mit 60 mg / L Instant Ocean Salze) werden in 60 ml Ei-Wasser in extra tiefe Petrischalen. Morpholino Injektion Speisen wiederverwendet werden kann. Spülen Sie mit Ei-Wasser, wenn Sie fertig und bei 4 ° C lagern invertiert </li><li> Für die Lagerung von Embryonen mit 60 ml Wasser, um Ei-Schale. Zählen Sie 110 Embryonen mit einer Transferpipette in separaten extra tiefe Petrischalen mit 60 ml Wasser-Ei. In 0,00003% Methylenblau um das mikrobielle Wachstum und inkubieren Embryonen bei 28 ° C verhindern </li><li> Zur Beschleunigung der Entwicklung von Embryonen zu halten Embryo Geschirr bei 33 ° C für 24 Stunden und Bühne nach Kimmel et al. 27, so dass Embryonen zu einem Kopf entwickelnStamm Winkel von 75 ° (25 Prim Stadium 27). </li><li> Für Larven-Infektion Arbeit zu halten Embryonen bei 28 ° C nach der Injektion mit C. albicans. </li><li> Jeder Tag ersetzen Embryo Gerichte mit 60 ml frisches Ei-Wasser. </li></ol> Imaging Experimentelle Dauer: ***** (1-5 Stunden) Schwierigkeitsgrad: *** <ol start="14"><li> Bereiten Sie Fisch in niedrig schmelzende Agarose (gemäß Abschnitt 4.2) mit Tricain im Glasboden Imaging-Gerichte (MatTek Corporation) wie oben beschrieben. Anschließend wird die Schale auf einem Olympus IX-81 (Olympus) inverse Mikroskop Bühne. Bringen Sie den Fisch in den Fokus unter 4x Vergrößerung unter Differential Interferenz Kontrast (DIC) Licht. Bilder können mit 4x, 20x erfasst werden, und 40-facher Vergrößerung an der DIC, TRITC (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat) und FITC (Fluoresceinisothiocyanat) Filter-Einstellungen. </li><li> Verwenden Sie eine Olympus IX-81 mit einem inversen Mikroskop FV-1000 Laser-Scanning-konfokalen System nach Ariga et al. 32. Führen Sie Zeit-Verläufe bei 40-facher Vergrößerung, indem Sie Z-Stapel mit 1 bis 1,5 mu m Scheiben jede Stunde der Infektion. </li><li> Für lange Zeit natürlich Bildgebung von 2 Stunden oder mehr, legen Sie eine Schicht von niedrig schmelzenden Agarose auf der Oberseite des Fisches in der Imaging-Schüssel alle 2-3 Stunden. Dies verhindert die Agarose vor dem Austrocknen und Zerkleinern der Fisch während es abgebildet wird. Für längere Zeit Kurse mit einer kleinen Anzahl von Fischen, verwenden Sie ein beheiztes Stufe (Bioptechs Inc.) bis 28 ° C während der Infektionen zu halten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine erfolgreiche Rautenhirn Ventrikels C albicans-Infektion in einem Zebrafischlarve bei 5 Stunden nach der Infektion (hpi) und 24 hpi ist in (1). Makrophagen-artigen Zellen, die mit C verschlungen albicans im Rautenhirn Ventrikel bei 5 hpi gesehen. Bis zum 24. HPI, C. albicans ist in Makrophagen-artigen Zelles in der dorsalen Schwanz Gewebe indikativen von disseminierten Candidiasis. Diese Infektion Ergebnis ist stark abhängig von einer genauen Injektion von 10-15 Hefe-Form C. albicans in das Hinterhirn Ventrikels. Screening der infizierten Fische sofort nach der Injektion kann dies sicherstellen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> Abbildung 1 Transgene FLI1:. EGFP 22, 33 Larve mit CaF2-yCherry Candida albicans und abgebildet intravital durch konfokale Mikroskopie infiziert. (AC) 5 Stunden nach der Infektion (A) Infizierte Larve mit EGFP-exprimierenden Makrophagen-ähnlichen Zellen am Ort der Infektion (Hinterhirn Ventrikel) Maßstab = 100 um. (B und C) Stärker vergrößerte Bilder der gleiche Fisch, zeigt C. albicans innerhalb von Fresszellen. Maßstab = 100 mu m für B und 10 um für C (DF) 24 Stunden nach der Infektion (D) Infizierte Larve mit disseminierter Candidiasis mit CaF2-yCherry C. albicans innerhalb EGFP Macrophage-Zellen, die in der dorsalen Schwanz Gewebe. Maßstab = 100 um. (E und F) Stärker vergrößerte Bilder der gleiche Fisch, zeigt C. albicans im Gewebe Schwanz. Maßstab = 100 um.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Zebrafisch Mikroinjektion hier vorgestellte Verfahren unterscheidet sich von Gutzman et al. 34 in diesem Hier zeigen wir Injektion durch die Ohr-Vesikel in die Herzkammer Rautenhirn von 36 bis 48 hpf Larven. Die Methode, die wir beschreiben, erlaubt das gleichmäßige Injektion von 10-15 Hefe in die Ventrikel mit eingeschränkter Hinterhirn Gewebeschädigung. Dieses Protokoll erzeugt eine zunächst lokale Infektion, die im ganzen Körper ausbreitet um 24 hpi (Abbildung 1) und fü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Laichbehältern </td><td> Aquatischer Lebensräume </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 ml Röhrchen </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Fisher Scientific </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> Extra tiefe Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 bis 757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> Standard-Petrischalen </td><td> VWR Scientific </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> Transferpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Hefeextrakt </td><td> VWR wissenschaftlichFIC </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> Fisher Scientific </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> Einweg Hämocytometer </td><td> VWR Scientific </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinzetten Dumoxel </td><td> VWR Scientific </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> Holzdübel </td><td> VWR Scientific </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR Scientific </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> Low MeltAgarose </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose zur Injektion Gerichte </td><td> VWR Scientific </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming Brown Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Hohle Glasstäbe </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> Für Glasstäbe glatten Glas durch Erhitzen über Bunsenbrenner </td></tr><tr><td> Pipette Aufbewahrungsbox </td><td> Sutter Instruments </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 Einspritzsystem </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> Back-Pressure-Einheit </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipette Holder Kit </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> Foot Switch </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulator </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> Magnetfuß </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td> Magnetfuß </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine Methansulfonat </td><td> Westlichen Chemical Inc. </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> Binokular </td><td> Olymp </td><td> SZ61 oben SZX-ILLB2-100 Basis </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX-81 mit FV-1000 Laser-Scanning-konfokalen System </td><td></td></tr><tr><td> TC-7 Tissue Culture Roller Trommel mit 14-Zoll-Rad Reagenzglas </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> Imaging Dishes </td><td> MatTek GmbH </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> Pipettenspitzen zum Be-Nadeln </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td><td></td></tr><tr><td> Teller gießen Gitter </td><td> Adaptive Science Tools </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> Heiztisch </td><td> Bioptechs Inc. </td><td> Delta-T-5 </td><td></td></tr><tr><td> Flachen Spatel </td><td> VWR Scientific </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffsieben </td><td> Wares von Knutsford Online </td><td> 12 cm </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR Scientific </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td> VWR Scientific </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 x 150 mm Kulturröhrchen </td><td> VWR Scientific </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td> VWR Scientific </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> VWR Scientific </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4534-500GP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4532-500GP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0246-500GP </td><td></td></tr><tr><td> Ca (NO 3) 2 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0226-500GP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4520-500GP </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae

Multipel Candidiasis durch das Pathogen Candida albicans ist ein klinisch bedeutendes Problem in Krankenhauspatienten mit einer 30 bis 40% auf Mortalität 6 zugeordnet ist. Systemische Candidiasis wird normalerweise durch angeborene Immunität kontrolliert, und Individuen mit genetischen Defekten in angeborenen Immunsystems Zellbestandteile wie Phagozyten NADPH-Oxidase sind anfälliger für Candidämie 09.07. Sehr wenig ist über die Dynamik von C bekannt albicans Interaktion mit Zellen des angeborenen Immunsystems in vivo. In umfangreichen in-vitro-Studien haben ergeben, dass außerhalb des Wirtes C. albicans keimt innerhalb von Makrophagen, und wird schnell durch Neutrophile 10-14 zerstört. In-vitro-Studien, aber nützlich, kann nicht rekapitulieren die komplexe in vivo-Umgebung, die zeitabhängige Dynamik Cytokinspiegel, extrazelluläre Matrix-Anhänge, Kontakte und interzellulären 10 enthält, 15-18 </sup&gt;. Um den Beitrag dieser Faktoren bei der Wirt-Pathogen-Interaktion zu untersuchen, ist es wichtig, ein Modell zu finden Organismus, diese Aspekte der Infektion nicht-invasiv zu visualisieren in einer Live-Host intakt. Die Zebrafischlarve bietet eine einzigartige und vielseitige Wirbeltier-Wirt für das Studium der Infektion. In den ersten 30 Tagen der Entwicklung Zebrafischlarven haben nur angeborene Immunabwehr 2, 19-21, Vereinfachung der Untersuchung von Krankheiten wie der disseminierten Candidiasis, die in hohem Maße von der angeborenen Immunität sind. Die geringe Größe und Transparenz der Zebrafischlarven erlauben Abbildungen von Infektionen Dynamik auf zellulärer Ebene sowohl für Wirt und Pathogen. Transgene Larven mit fluoreszierenden Zellen des angeborenen Immunsystems können bestimmte Zelltypen in 22-24 Infektion beteiligt zu identifizieren. Geändert Antisense-Oligonukleotide (Morpholinos) kann verwendet werden, um knock down verschiedenen Immun-Komponenten wie Phagozyten NADPH-Oxidase und studieren die Veränderungen als Reaktion auf Funga werdenl 5-Infektion. Zusätzlich zu den ethischen und praktischen Vorteile der Verwendung einer kleinen unteren Wirbeltieren, bietet das Zebrafisch-Larven die einzigartige Möglichkeit, das Bild Feldschlacht zwischen Erreger und Wirt sowohl intravital und in Farbe. Der Zebrafisch hat, um Modell-Infektion wurde für eine Reihe von humanpathogenen Bakterien verwendet, und war maßgeblich an der großen Fortschritte in unserem Verständnis der Mykobakterieninfektion 3, 25. Doch erst in jüngster Zeit viel größer Krankheitserregern wie Pilzen verwendet worden, um Larven infizieren 5, 23, 26, und bis heute hat es nicht eine detaillierte visuelle Beschreibung der Methodik Infektion. Hier präsentieren wir unsere Techniken für Hinterhirn Ventrikel Mikroinjektion von prim 25 Zebrafisch, darunter Modifikationen an unseren früheren Protokollen. Unsere Ergebnisse unter Verwendung der Zebrafisch-Larven-Modell für die Pilzinfektion aus in vitro Studien divergieren und verstärken die Notwendigkeit, die Wirt-Erreger-Intera untersuchenktion in der komplexen Umgebung des Wirtes statt des vereinfachten Systems der Petrischale 5.

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Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der Infektion<sup&gt; 4.1</sup&gt;. Hier zeigen wir Techniken zur Infektion mit dem Zebrafisch-Larven Pilzpathogen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Durch Mikroinjektion, Methodik kürzlich verwendet, um Phagozyten NADPH-Oxidase-Aktivität in Kontrolle von Pilz-Dimorphismus implizieren<sup&gt; 5</sup&gt;.

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

non-invasive-imaging-of-disseminated-candidiasis-in-zebrafish-larvae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K Aufrufe.  University of Maine. Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der Infektion 4.1. Hier zeigen wir Techniken zur Infektion mit dem Zebrafisch-Larven Pilzpathogen Candida albicans Durch Mikroinjektion, Methodik kürzlich verwendet, um Phagozyten NADPH-Oxidase-Aktivität in Kontrolle von Pilz-Dimorphismus implizieren 5.

Serie: Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Forschung

Krebsforschung

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Entwicklungsbiologie

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Analyse der Herzkontraktion von Zebrafischen mit Virtual-Reality-Interaktion

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Autor im Rampenlicht: Hochauflösende 4D-Lichtblatt-Bildgebung und Virtual Reality im Zebrafisch zur Einzelzellanalyse der Herzfunktion

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Biotechnik

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von

Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt