Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Wellcome Trust (: 084277 Ref) unterstützt.

1. Kleinhirn Granulat Neuron Vorbereitung <ol><li> Autoclave etwa 100 25 mm Durchmesser Deckgläser (Tabelle 1). </li><li> Legen Sie Deckgläschen in einer 50 ml sterilen Röhrchen mit steriler Poly-D-Lysin-Lösung (Tabelle 2). Auf eine rotierende Plattform für 2 h zur Beschichtung der Deckgläser. </li><li> Dry beschichtete Deckgläser auf sterile Seidenpapier in einer Sterilbank (Tabelle 1). </li><li> Legen Sie Deckgläser in sterile 6-well Platten und warm in eine CO 2-Inkubator (Tabelle 1). Deckgläser kann für 1 Monat bei 4 ° C für Vor Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Euthanize einer 7 Tage alten Sprague Dawley Ratten Welpen nach den örtlichen Ethikkommission Richtlinien. Wir eingeschläfert Welpen mit Genickbruch. </li><li> Präparieren Sie die Kleinhirn und legen Sie sie in einer sterilen Petrischale mit einem Phosphat-gepufferte Salze (Lösung B, Tabelle 3). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,5 und 1,6 für 4-6 Rattenjungen. </li><li> Cerebella werden dann auf dem sterilen Stadium einer McIlwain Tissue Cho platziertpper (Tabelle 1). Das Gewebe wird bei 375 um Abstand vor dem Drehen der Bühne um 90 ° und den Prozess wiederholen gehackt. </li><li> Die gehackte cerebella werden in einer Trypsin-Lösung (Lösung T, Tabelle 4), die zuvor auf 37 war ° C erwärmt übertragen </li><li> Inkubieren cerebella bei 37 ° C für 20 min unter leichtem Schütteln ca. alle 5 min. </li><li> Während tryptischen Verdauung, Flamme polnisch drei sterile Glaspipetten (Tabelle 1) mit einem Bunsenbrenner. Verwenden Sie die Flamme zu einer Geldstrafe Bohrung, Medium Bohrung und eine große Bohrung an der jeweiligen Mündungen der Pipetten zu schaffen. </li><li> Nach 20 min Inkubation in Lösung T, mit 20 ml einer Trypsin / DNase-Inhibitor-Lösung (Lösung B, Tabelle 5), die Kleinhirn-Aufhängung und Pellet-Zellen bei 1.000 g für 1 min in einer Tischzentrifuge (Tabelle 1). </li><li> Den Überstand und Zellpellet in 1,5 ml einer konzentrierten Trypsin / DNase-Inhibitor (Lösung C, Tabelle 6) mit dem breitesten Bohrung Pipette. </li><li&gt; Man reibt die Zellen mit Hilfe von zunächst die weite Bohrung Pipette, dann die mittlere Bohrung und schließlich die enge Bohrung, bis die Zellsuspension homogen ist. Dies ist ein wichtiger Schritt, die Aussetzung muss in dieser Phase homogen. </li><li> Schicht der Zellsuspension auf 10 ml einer vorgewärmten (37 ° C) Rinderserumalbumin Earles Balanced Salzlösung (Tabelle 7) in ein steriles 15 ml Tube. </li><li> Die Suspension für 5 min bei 1.500 g und Zellpellet in 2 ml vorgewärmtem (37 ° C) Kulturmedium (Tabelle 8). </li><li> Schätzen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zählkammer (Tabelle 1) und verdünnen die Zellsuspension auf eine endgültige Dichte von 3,3 x 10 6 Zellen pro ml. </li><li> Die Zellen werden durch Zugabe von 75 ul der Zellsuspension in die Mitte des Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläschen (Enddichte 2,5 x 10 5) beschichtet. </li><li> Die Kultur-Platten, die die Deckgläser sind in der CO 2-Inkubator für 60 min in der Lage, die Zellen zu einem erlaubendhere. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Kulturmedium in jedes Well dabei nicht auf der plattierten Zellen stören und Rückkehr der Kultur-Platten, die CO 2-Inkubator. </li><li> Am nächsten Tag ersetzen das Kulturmedium mit frischem Kulturmedium mit der mitotischen Inhibitor Cytosinarabinosid (Tabelle 8) ergänzt. Diese Verhaftungen Proliferation von Gliazellen in Kultur. </li></ol> 2. Experimenteller Aufbau <ol><li> Grundlegende Versuchsaufbau sollte wie folgt aussehen (siehe Tabellen 1 und 9 für spezielle Geräte und Software): <ul><li> Inverted Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop </li><li> Gekühlte CCD-Kamera </li><li> Fluorescent Lichtquelle (Monochromator oder Filterrad) </li><li> Gravity Perfusionsapparatur </li><li> Imaging Kammer mit parallel Platinelektroden </li><li> Elektrostimulatoren </li><li> Computer </li><li> Bildaufnahme-Software </li></ul></li><li> Experimente sollten in der Dunkelheit oder unter Rotlicht cond durchgeführt werdenitions mit einem Minimum an fluoreszierende Beleuchtung der Probe zu vermeiden, FM Farbbleichung. </li><li> Die Experimente werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Wenn physiologischen Temperatur erforderlich ist, kann eine Temperatur-kontrollierte Perfusion System verwendet werden. </li></ol> 3. Probenvorbereitung <ol><li> Kulturen sollten nach 8-12 Tagen in vitro verwendet werden. </li><li> Übertragen einer einzigen Deckglas zu Kochsalzlösung (Tabelle 10) für 10 min bei Raumtemperatur zu einer Stabilisierung in neuen Medium zu ermöglichen. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas, trockenen seiner Unterseite und die Umgebung des anhaftenden Zellen mit einem kleinen Stück Papiertuch oder saugfähigen Papier. </li><li> Mit Silikonfett (Tabelle 2), das Deckglas Kleber an der Unterseite der Bildgebung Kammer. Die Zellen sind zwischen den beiden parallelen Drähte werden. Ausreichende Silikonfett sollten verwendet werden, um vollständig zu versiegeln der Kammer werden aber ohne Fett in die Mitte des Bades Kammer. </li><li> Vorsichtig füllt das Bad Kammer mit ~ 260 ul saline-Lösung und füllen Sie dann die Eingabe-Schlauch mit der gleichen Lösung. </li><li> Kleben Sie ein sauberes Deckglas mit Silikonfett an die Spitze der Kammer zu verschließen. Die Input-und Output-Schlauch kann verwendet werden, um eventuell vorhandene Luftblasen in der Kammer eingeschlossen zu entfernen. Es ist wichtig, dass die elektrische Schaltung nicht durch Luftblasen unterbrochen. </li><li> Immobilise der Imaging-Kammer in einem Edelstahl-Plattform und auf Dichtheit prüfen, indem Sie vorsichtig Perfusion Salzlösung durch die Eingabe Schlauch. </li><li> Bringen Sie die zusammengebauten Kammer auf der Bühne eines inversen Mikroskops, und verbinden Sie die Kammer auf einen Schwerpunkt Perfusion System, nachdem er den Einlauf mit Kochsalzlösung grundiert. </li><li> Bringen Sie Anschlussdrähte der Kammer zu den elektrischen Stimulator. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel, wenn ein Öl-Objektiv verwendet wird. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen in der Mitte der Kammer mit Hellfeldbeleuchtung. </li></ol> 4. S1 Phase <ol><li> Perfundieren Neuronen mit 1,5 mlvon FM-Farbstoff (Tabelle 2) in Kochsalzlösung verdünnt. </li><li> Stimulieren Neuronen Farbstoffaufnahme evozieren unter Verwendung des beigefügten Stimulator. </li><li> Nach Stimulation, perfuse Neuronen mit frischen Kochsalzlösung für 2 Minuten abwaschen, um überschüssige FM-Farbstoff (Flussrate 7 ml / min). Glial Kontamination in der CGN Kultur ist weniger als 5% 14, ist daher dieser Zeitrahmen ausreicht, um Farbe zu entfernen . </li><li> Lassen Neuronen für 8 min ruhen. </li><li> Während dieser Zeit finden axonalen Netzwerken, in denen einzelne FM farbstoffbeladenen Nervenendigungen sind mit Fluorescein Wellenlängen (Anregung, 480 nm; Emission,&gt; 550 nm). Vermeiden Sie Bereiche mit Clustern von Zellen. Keep Beleuchtung auf ein Minimum zu diesem Schritt, da intensive Erregung in Farbstoff Phototoxizität führen kann. Offensichtliche Anzeichen dafür sind von Axonen und ein Mangel an Farbstoff Entladung (durch Fixierung Farbstoff) blebbing. </li><li> Re-Fokussierung Bild unmittelbar vor der Bildaufnahme, da eine leichte Drift kann während der Ruhezeit begangen haben. </li&gt; <li> Begin Zeitraffer-Bildaufnahme mit einer Rate von 1 Frame alle 4 s. </li><li> Nach dem Erwerb von 5 bis 10 baseline Bilder evozieren Exozytose der UVP durch die Bereitstellung einer 30 Hz Stimulation für 2 s (60 Aktionspotentiale) 8 Commence Stimulation manuell sofort nach Frame Capture.. </li><li> Nach der Übernahme von weiteren 10 Bilder evozieren SV Exozytose der RP mit drei Stimulationen von 40 Hz für 10 s (400 Aktionspotentiale), die jeweils 30 s auseinander 8. </li><li> Erwerben Sie ein anderes 5 bis 10 Bildern und dann Pause Bildaufnahme. </li></ol> 5. Recovery-Phase (siehe Abbildung 2) <ol><li> Lassen Neuronen zu erholen über mindestens 20 min. </li><li> Optional - Wenn die Wirkung eines Medikaments auf die Endozytose zu prüfenden, perfuse Neuronen mit Drogen-Lösung während dieser Zeit (Abb. 2b) 3,8. </li></ol> 6. S2 Phase <ol><li> Wiederholen Sie die S1-Phase-Protokoll (Abschnitt 4) für einen Kontroll-Versuch mit dem gleichen Sichtfeld wiein S1. </li><li> Optional - Wenn die Wirkung eines Medikaments auf die Endozytose zu prüfen ist, perfuse Neuronen mit dem Medikament Lösung mit FM-Farbstoff (Abb. 2b) 3,8 ergänzt. </li><li> Optional - Alternativ, wenn Medikament Auswirkungen auf die Exozytose von Interesse sind, perfuse Neuronen mit dem Medikament Lösung sowohl vor als auch während der RRP und RP Entladen Reize (Abbildung 2c) 3. </li></ol> 7. Data Analysis <ol><li> Verwenden Sie ImageJ und Microsoft Excel oder eine vergleichbare Software für die Datenanalyse. </li><li> Für die Analyse wird eine Bildsequenz in Stack-Format erforderlich. Einige Bildbearbeitungs-Software können Sequenzen als einzelne Bilder exportieren. Wenn dies der Fall ist, Konvertieren von Bildern in einem Stapel mit einem ImageJ eingebaute Funktion Bild&gt; Stacks&gt; Bilder zu stapeln. </li><li> Stellen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Stapels, um den Dynamikbereich zu maximieren. Das Bild&gt; Einstellen&gt; Helligkeit / Kontrast (Abb. 3a). </li><li> Wenn bedeutende horizontale Drift während t aufgetretenEr Experiment laufen StackReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> ) und TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ) Plugins auf ImageJ zu Bildstapel (Abbildung 3b) ausrichten . </li><li> Run Time Series Analyzer-Plugin ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ) (Abbildung 3c). </li><li> Definieren regions of interest (ROI) über mindestens 90 Nervenendigungen. Diese sollten identisch sein (circular ROIs mit 1,5 Mikrometer Durchmesser) Es ist hilfreich, um zwischen den Bildern wechseln, bevor und nachdem Farbstoff Entladen der aktiven Nervenendigungen (alternativ ein Vorstimulation Image kann von einem post-Stimulation Bild subtrahiert werden) zu offenbaren. Ein idealer ROI Größe ist einer, der etwas größer als eine typische Nervenendigung (Abbildung 3c) ist. </li><li> Besorgen Sie sich die Beiträge / integrierte Fluoreszenzintensität der einzelnen ROI über time und Export zu Microsoft Excel (Abbildung 3d und 4a). </li><li> Normalisieren ROI Spuren auf die gleiche beliebigen Wert ein, indem Spuren in der Ebene der Y-Achse für die ersten Entladung Stimulus sowohl in S1 und S2-Phasen (Abb. 4b-c). Dies ist für kleine Variationen im Hintergrund Fluoreszenzintensität zu kontrollieren. </li><li> Messen Sie die absolute Abnahme der Fluoreszenz von jedem Entladen Impulse in beliebiger Fluoreszenz Einheiten für S1 und S2 wie folgt (Abb. 4d) hervorgerufen: <ul><li> UVP = Veränderung der Fluoreszenz (AF) von 30 Hz 2 s ausgelöst </li><li> RP = Summe der AF ausgelöst durch 3 x 40 Hz 10 s </li><li> Insgesamt Recycling-Pool = RRP + RP </li></ul></li><li> Für jeden relevanten Parameter in 7,9, berechnen Sie den Mittelwert über alle Nervenendigungen von einem einzigen Experiment. </li><li> Für die statistische Analyse, Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Experimenten gemittelt werden können. Die Zahl der Deckgläser anstatt die Anzahl der Nervenenden sollte als statistica verwendet werdenl n. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Ein Kontrollversuch, wo CGNs unterzog zwei Runden identischer Be-und Entladen Schritte ist in Abbildung 5 dargestellt. Bei Beginn einer Reihe von Experimenten, ist es unerlässlich, dass eine Kontrolle Experiment wie dieses durchgeführt wird jeden Tag zu bestätigen, dass S1 und S2 vergleichbar, bevor unterschiedlichen experimentellen Bedingungen während der S2 sind. In diesem Beispiel wurden CGNs mit 10 uM FM1-43 mit einem 80 Hz 10 s Stimulation (Abbildung 5a) geladen. Abbildung 5b zeigt FM1-43-geladen Nervenendigungen durch fluoreszierende puncta vertreten. ROIs wurden über 90 Nervenendigungen definiert, wie in Abbildung 5c ​​dargestellt. Der gleiche Satz von ROIs wurde für beide S1 und S2 verwendet. Während der beiden entlädt, wurde die RRP zunächst mit einer 30 Hz (2 s) Stimulation durch RP Entladen mit 3 sequentiellen 40Hz (10 s) Reize (Abbildung 5a), gefolgt entladen. Die Fluoreszenz-Drop bei jedem Stimulus kann deutlich beobachtet und quantifiziert werden (Abbildung 5d-e).<html> Bei der Untersuchung der Fluoreszenz entsprechend der UVP fällt, wurden RP-und Kreislauf-Pool vergleichbar in beiden S1 und S2. Darüber hinaus wohnten 20% aus recyceltem SVs in der UVP, während 80% in der RP in beiden S1 und S2 residierte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung eines typischen FM Experiment. A) SV Endozytose ist in Gegenwart von FM-Farbstoff (vertreten in grün) ausgelöst. Der Farbstoff wird durch einstülpende Membran (single SVs oder Bulk-Endosomen) übernommen. B) Nicht verinnerlicht Farbstoff auf der Plasmamembran entfernt durch Perfusion gewaschen. C) Auf Antrag einer Entladung Reiz, etikettiert SVs, die verfügbar sind zur Freisetzung Sicherung mit der Plasmamembran was zu einem Verlust der Fluoreszenz. D) Die Veränderung der Fluoreszenz (AF), die proportional zur Menge des freigesetzten gekennzeichnet SVs kann dann quantifiziert werden. _upload/3143/3143fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2 Schematische Darstellung der möglichen experimentelle Protokolle. A) Flussdiagramm einer Steuerung Experiment, bei dem Zellen durchlaufen zwei Runden FM Farbstoff Be-und Entladen (S1 und S2). Die Zellen können geladen mit einer Reihe von unterschiedlichen Stimuli werden. Entladen Schritte sind identisch, dass die UVP mit 30 Hz für 2 s entladen wird, gefolgt von RP Entladen mit 3 mal 40 Hz für 10 s. RRP und Reservepool Entladen Stimuli wurden von 40 sec, alle anderen Reize von 30 sec getrennt. Die Zellen sind von links nach 20 Minuten zwischen S1 und S2 zu erholen. Flussdiagramme für mögliche Änderungen an der Wirkung einer Substanz auf beiden B-Test) Endozytose oder C) Exozytose sind ebenfalls dargestellt. Entsprechende Test Medikament kann in der Kammer während angegebenen Zeiträume perfundiert werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" /> Abbildung 3 Screenshots der Datenanalyse in Image J. Screenshots werden gezeigtfür A) Helligkeits-und Kontrastwerte, B) Rahmen Ausrichtung C) ROIs Auswahl, und D) Intensitätswerte Extraktion mit Bild J. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" /> Abbildung 4 Screenshots der Datenanalyse in Microsoft Excel. Screenshots sind für A) den Import von Rohdaten von Image J (1 st Spalte = Anzahl der Frames, restlichen Spalten = Daten aus den einzelnen Nervenenden) B) Anpassung der S1 Baseline-Werten (Bild 10) auf einen beliebigen Wert (200) am Start der erste Reiz, C) Anpassung der S2 Baseline-Werte bei Bild 55 mit einem identischen Protokoll S1 und D) Messung der Fluoreszenz fällt mit Microsoft Excel. Beachten Sie, dass die gemittelten Spur in D gezeigt wird verwendet, um Zeitpunkten vor und nach jedem Tropfen zu definieren. Die Größe der Fluoreszenz-Tropfen für jede ROI sollte von Werten auf dem Arbeitsblatt in C gezeigt bestimmt werden <img alt="Abbildung 5" src = &quot;/ files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5. Vertreter Kontrolle zu experimentieren. A) Flussdiagramm einer Steuerung Experiment, bei dem CGNs mit 10 um FM1-43 geladen wurden unter Verwendung von 80 Hz (10 s) Stimulation. Die S1 und S2 Phasen identisch sind. RRP und Reservepool Entladen Stimuli wurden von 40 sec, alle anderen Reize von 30 sec getrennt. B) Ein Bild, das Nerven-Terminals mit FM1-43 geladen. C) Das gleiche Bild wie B zeigt 90 nummerierte ROIs für die Analyse ausgewählt. D) Bilder von einer Fläche mit einem roten Feld in B an ausgewählten Zeitpunkten dargestellt. Basal = vor der Stimulation, 30 Hz = 30 Hz nach 2 s Stimulation; 40 Hz 1,2,3 = nach jeder 40 Hz 10 s Stimulation. Diese Bilder werden in Falschfarben dargestellt, um Veränderungen in der Fluoreszenz (Spektrum-Bar auf der rechten Seite angezeigt) illustrieren. E) Mittelwert ± SEM Spur von 90 Nervenendigungen in C. Individuelle Reize dargestellt, erhalten durch horizontale Balken dargestellt werden. Maßstabsbalken = 10 pm.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

FM Farbstoffe werden in großem Umfang verwendet werden, um Nervenendigung Funktion in vielen neuronalen Vorbereitungen zu untersuchen. Sie wurden vor allem auf das Ausmaß der entweder SV Endozytose, SV Umsatz oder die Kinetik der Exozytose 6 zu überwachen beschäftigt. Das beschriebene Protokoll erweitert diese Studien, um die Differenz Entladen von bestimmten SV-Pools zu untersuchen. Dies bietet zusätzliche Informationen über die Wiederauffüllung der SV-Pools und auch ihr Ausmaß der Mobilisierung. FM-Farbstoffe können mehrere Runden SV Recycling innerhalb der gleichen Nervenenden Label sein. Wir haben diese Eigenschaft genutzt und gestaltet Protokolle, in denen SV Umsatz in jedem Terminal zweimal in den gleichen Nervenenden überwacht werden kann. Dies ermöglicht eine genaue interne Kontrolle, die wesentlich aufgrund der heterogenen Natur der SV-Recycling in parallel Nervenendigungen 11 ist. Über die Verwendung der S1-Phase als interne Kontrolle, das Nachfüllen der RRP, RP und die gesamteSV-Pool in der Gegenwart von Arzneimitteln zuverlässig und direkt verglichen werden. Neben der Bereitstellung von Informationen über die absolute Größe des Recycling, RRP und RP-Pools unter verschiedenen Stimulation Bedingungen kann dieses Protokoll auch Daten für die folgenden - 1) Die Aufteilung der SVS zwischen dem Marktpreis und RP in Abhängigkeit von der Recycling-Pool für S1 und S2, 2) die relative Größe der S2-Pools (RRP und RP) als Funktion der gesamten S1 Recycling-Pool und 3) die relative Größe einer definierten SV Pool in S2 in Abhängigkeit von den gleichen Pool in S1. Dieses Protokoll wird insbesondere keine Informationen über Entladen Kinetik jedoch seit der Übernahme der Zeit ist zu langsam (für kinetische Messungen Messzeiten sollten so zügig wie möglich und Entladen automatisch synchronisiert image capture). Unsere 30 Hz 2 s Stimuli evoziert ein identisches Ausmaß der RRP Entladen zu hypertonen Saccharose 8. Da die Größe des RRPvon hypertoner Saccharose Entladen 15 definiert ist, können wir feststellen, dass dieses Protokoll alle UVP SVs entlädt, im Einvernehmen mit dem Studium in Hippocampus-Neuronen 16. Die Reserve-Pool ist fast vollständig von drei Züge von 400 Stimuli (40 Hz 10 s jeweils), da diese Stimulation entlädt eine identische Menge an Farbstoff zu einem Paradigmenwechsel (2 Reize mit 50 mM KCl), dass 95% aller Farbstoff-markierten SVs erschöpft erschöpft 8,17. Genaue Quantifizierung der Größe sowohl der UVP und Reserve-Pool ist auch abhängig von den Erwerb von Informationen innerhalb des linearen dynamischen Bereich der CCD-Kamera. Dieses einfache Protokoll kann auch weiter modifiziert werden. Die Stärke der Belastung Reize kann auch variiert werden, um festzustellen, wie neuronale Aktivität und verschiedene Endozytose Modi beeinflussen SV Pool Nachschub werden. Darüber hinaus können mehr als zwei Zyklen von Be-und Entladen auch durchgeführt werden, wenn erforderlich. Dieses Protokoll kann auch in Zellen entweder mit Überexpression oder transfiziert werdenshRNA-Vektoren. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz der primären neuronalen Kulturen, müssen exprimierten Proteine ​​mit fluoreszierenden Proteinen markiert werden. Es ist wichtig, dass diese fluoreszierenden Markierungen nicht mit dem FM-Signal stören Farbstoff (Verwendung Cyan und Rot-Proteine, zum Beispiel). In diesem Fall kann Nervenendigungen von transfizierten und nicht transfizierten Zellen in der gleichen Sichtfeld auch als eine zusätzliche Steuerung 8 verglichen werden. In solchen Experimenten ein Vergleich des Ausmaßes der Belastung zwischen S1 und S2 Lasten ist von geringem Wert, da die Störung während der beiden Belastungen zu präsentieren. Partitionierung des Farbstoffs zwischen SV-Pools können noch jedoch 8 visualisiert werden. Genetische Reporter namens pHluorins auch eingesetzt, um SV Exozytose und Endozytose in primären neuronalen Kultur zu überwachen. Diese Sonden mit einem pH-sensitive grün fluoreszierendes Protein, um den pH-Umfeld luminalen Domänen der markierten SV Proteine ​​wie VAMP, Synaptophysin und VGLUT1 18 </sup&gt;. In Verbindung mit vesikuläre ATPase-Inhibitoren eingesetzt wird, kann pHluorins Bericht sowohl die Kinetik und das Ausmaß der SV Pool Mobilisierung 19. Die FM-Farbstoff hier beschriebene Ansatz hat einige Vorteile gegenüber dem pHluorin Technik Erstens bieten FM Farbstoffe Informationen über die SV Endozytose-Modus füllt die RRP und Reserve-Pools 8. Zweitens spezifische SV-Pools können mit FM-Farbstoffe, die unterschiedliche spektrale Eigenschaften haben 20 und schließlich gibt es keine Anforderung für die Transfektion bezeichnet werden. FM Farbstoffe können keine Informationen über SV-Verkehr zwischen der Rast-und Recycling-SV-Pools jedoch (im Gegensatz zu pHluorins 19), da per Definition SVs mit Farbstoff während der Endozytose zu sehen sein geladen werden müssen. So auch FM Farbstoffe und pHluorins haben Stärken und Schwächen und mächtigsten, wenn in unabhängigen Experimenten verwendet, um die gleiche Frage zu stellen. Qualitativ hochwertige Bilder sind für valide Analyse und reproducib wesentlichele Ergebnisse. Während horizontale Drift leicht korrigiert werden kann, können Experimente, in denen es einen Drift in der Z-Achse nicht wiederhergestellt werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, wieder unscharfe Bilder vor Beginn der S1 und S2 entlädt. In Fällen, in denen eine signifikante Fluoreszenz-Zerfall stattgefunden hat, kann Zerfallskorrekturen angewendet (in der Regel durch Abzug einer zuvor aufgezeichneten Spuren von FM-beladenen Zellen in der Abwesenheit von Stimulation) werden. Allerdings wird vorgeschlagen, dass Karies Korrektur ist nur für die grafische Darstellung und nicht für jede quantitative Analyse verwendet werden durchgeführt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th></tr><tr><td> AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Observer.A1 Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> Zellkulturplatten (6 Bohrlöcher) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Zentrifuge (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2-Inkubator </td><td> Heraeus Instruments </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> Falcon-Röhrchen (15/50 ml) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0,75 ∞ / 0.17 Ziel </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> Deckgläser (Ø25mm) </td><td> VWR International </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> Glas Pasteur Pipetten (230 nm) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Hämocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> Imaging Kammer </td><td> Warner </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> Laminarströmungshaube </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain Tissue Chopper </td><td> Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> Mercury Lampe </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim-System Elektrostimulatoren (100mV, 1ms Pluse Breite) </td><td> Digitimer Ltd </td><td> D330 </td></tr><tr><td> Perfusionspumpe </td><td> Watson-Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Serologische Pipetten (5/10/25 ml) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> Shutter-Controller </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> Spritze (20 ml) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> Spritzenvorsatzfilter (Minisart - 0,20 um) </td><td> Sartorius Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 Sechs-Kanal-Ventilsteuerung </td><td> Warner </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filter-Set (Set 46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ausstattung und Geräte <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> Cambridge BioScience </td><td> BT70021 </td><td> 10 uM </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> Cambridge BioScience </td><td> BT70044 </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P7886 </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td> Silikonfett </td><td> Sigma </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spezifische verwendeten Reagenzien <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 0,3% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 mg/100 ml </td></tr></tbody></table> -Make 100ml frische für jedes Präparat -Sterilfilter vor dem Einsatz Tabelle 3. Lösung B für CGN Vorbereitung <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> Lösung B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 ml </td></tr><tr><td> Trypsin (5 mg / ml Brühe, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9201 </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Lösung für T CGN Vorbereitung <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> Lösung C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> Lösung B </td><td align= &quot;Center&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16,8 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Solution W für CGN Vorbereitung <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNase, 500 U pro 0,5 ml Brühe, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> Lösung B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (SBTI, 0,5 mg pro 0,5 ml Brühe, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9003 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Lösung C für CGN Vorbereitung <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Earle Balanced Salt Solution (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 3 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 7. EBSS Lösung für CGN Vorbereitung <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> Cytosin β-D-arabinofuranosid (Ara-C) * </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td> 10 uM </td></tr><tr><td> Fetale Bovine Serum </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Sigma </td><td> G3126 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Minimal Essential Medium (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Penicillin (P) / Streptomycin (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 ug / ml (S) </td></tr></tbody></table> * Ara-C sollte mittelfristig von 1 DIV seit hinzugefügt werden Tabelle 8. Nährmedien für CGN Vorbereitung <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Version </th><th> Firma </th></tr><tr><td> AxioVision Rel.. </td><td> 4,8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> National Institutes of Health </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> Microsoft </td></tr></tbody></table> Tabelle 9. Spezielle Computer-Software verwendet <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nr. </th><th> Konzentration </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,3 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td> 0,4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH Laboratory Supplies </td><td> 10264 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> TES </td><td> Sigma </td><td> T1375 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 10. Saline Solution (pH 7,4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

Nach Freisetzung von Neurotransmittern im zentralen Nerven-Terminals sind SVs schnell durch Endozytose abgerufen. Retrieved SVs werden dann mit Neurotransmitter befüllt und wieder in den Recycling-Pool, als SVs definiert, die für Exozytose 1,2 sind. Die leicht lösbare pool (RRP) und die Reserve-Pool (RP) - Die Recycling-Pool kann in der Regel in zwei verschiedene Pools aufgeteilt werden. Wie die Namen vermuten lassen, besteht die UVP des SVS, die sofort verfügbar sind für die Fusion, während RP SVs nur während intensiver Stimulation 1,2 freigesetzt werden. Es ist wichtig, einen zuverlässigen Test, dass die unterschiedliche Auffüllung dieser SV-Pools Berichte, um 1 zu verstehen) haben, wie SVs Verkehr nach verschiedenen Modi der Endozytose (wie Clathrin-abhängige Endozytose und Aktivitäts-abhängigen bulk Endozytose) und 2) die Mechanismen Steuerung der Mobilisierung sowohl der UVP und RP in Reaktion auf verschiedene Reize. FM Farbstoffe werden routinemäßig eingesetzted quantitativ Bericht SV Umsatz in Zentral-Nerven-Terminals 3-8. Sie haben einen hydrophoben Kohlenwasserstoff-Schwanz, der reversible Partitionierung ermöglicht in der Lipid-Doppelschicht und einer hydrophilen Kopfgruppe, die Blöcke Passage durch Membranen. Die Farbstoffe haben wenig Fluoreszenz in wässriger Lösung, aber ihre Quantenausbeute steigt dramatisch, wenn in Membran 9 unterteilt. So FM Farbstoffe sind ideal fluoreszierenden Sonden für das Tracking aktiv Recycling SVs. Die Standard-Protokoll für den Einsatz von FM-Farbstoff ist wie folgt. Zuerst werden sie zu Neuronen angewendet und sind während der Endozytose aufgenommen (Abbildung 1). Nach nicht verinnerlicht Farbstoff wird von der Plasmamembran, Recycling SVs Umverteilung innerhalb der Recycling-Pool gewaschen. Diese SVs sind dann erschöpft mit Entladen Reize (Abbildung 1). Da FM Farbstoff Kennzeichnung von SVS ist quantal 10, ist die resultierende Fluoreszenz Tropfen proportional zu der Menge von Vesikeln freigesetzt. So erwirtschaftete das Recycling und die Fusion von SV aus dem previous Runde der Endozytose verlässlich quantifiziert werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das modifiziert wurde, um zwei zusätzliche Elemente von Informationen zu erhalten. Erstens sind sequentielle Entladen Reize verwendet, um differentiell Entladen der UVP und der RP, um die Quantifizierung der Auffüllung der spezifischen SV-Pools ermöglichen. Zweitens wird jede Nervenendigung das Protokoll zweimal. So kann die Reaktion der gleichen Nerv Terminal S1 gegen die Anwesenheit einer Testsubstanz in der Phase S2 (Abbildung 2) verglichen werden, die Bereitstellung eines internen Kontrollsystems. Dies ist wichtig, da das Ausmaß der SV-Recycling über verschiedene Nervenendigungen ist sehr variabel 11. Jeder Anhänger primären neuronalen Kulturen für dieses Protokoll verwendet werden kann, jedoch die Beschichtungs-Dichte, Lösungen und Stimulation Bedingungen sind für zerebelläre Nervenzellen Granulat (CGNs) 12,13 optimiert.

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Eine Live-Fluoreszenz-Imaging-Technik, um den Nachschub und die Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikel (SV)-Pools in zentralen Nervenendigungen quantifizieren beschrieben. Zwei Runden SV Recycling sind in der gleichen Nervenenden Bereitstellung eines internen Kontrollsystems überwacht.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Aufrufe.  University of Edinburgh. Eine Live-Fluoreszenz-Imaging-Technik, um den Nachschub und die Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikel (SV)-Pools in zentralen Nervenendigungen quantifizieren beschrieben. Zwei Runden SV Recycling sind in der gleichen Nervenenden Bereitstellung eines internen Kontrollsystems überwacht.

Serie: Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Zusammenfassung

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