Die Finanzierung wurde durch die NIH MH-64611 und NARSAD Young Investigator Award zur Verfügung gestellt. Die Autoren möchten auch Adam Beagley, Mark Dikopf und Ben Smith für ihre technische Unterstützung zu bestätigen.

SU-8 Formenbau Master-Vorbereitung <ol><li> Die SU-8 Master auf Silizium-Wafer-Substrat wird unter Verwendung eines zweistufigen Standard-Negativ-Resist Lithographie-Prozess. </li><li> Die Ausrichtungsmarkierungen auf dem Silizium-Wafer werden mittels einer Rasierklinge die Höhe dieser Strukturen (befindet sich entlang der äußeren Peripherie des Wafers) ist mehr als das eigentliche Gerät Strukturen. </li><li> Die Silizium-Wafer wird dann gereinigt mit Isopropylalkohol gewaschen und in einem N 2-Strom. Stützpfeiler aus Band mit einer Dicke von weniger als der höchste Gerät Struktur ersetzen die Ausrichtungsmarkierungen auf vier Seiten des Wafers. Hinweis: Wenn die Stützpfeiler Höhe ist mehr als das höchste Gerät Strukturen, die durch die Löcher sind nicht im PDMS Schimmel gebildet. </li><li> Der Master-Silizium-Wafer ist auf einer heißen Platte an der Raumtemperatur vorgelegt. </li></ol> PDMS-Aufbereitung <ol><li> Vier Gramm Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung wird durch gründliches Mischen 10 Teile aus Silikon-Elastomer mit 1 Teil Härter vorbereitet. Hinweis: Achten Sie darauf, dass die beiden Lösungen gleichmäßig auf ähnliche physikalische Eigenschaften in der PDMS Form erhalten wurde. </li><li> Die Blasen in der PDMS-Lösung beim Mischen erzeugt werden entfernt mit einem Vakuum-Exsikkator. </li></ol> PDMS-Beschichtung und Aushärtung <ol><li> Die blasenfreie PDMS Lösung wird langsam auf die SU-8 Master dafür sorgen, dass Blasen, nicht während der Abgabe Prozess erzeugt verzichtet. </li><li> Ein Ende eines Schreib-on Transparenz Film wird dann auf der Heizplatte gestellt und langsam auf dem PDMS-Lösung gelegt, um gleichmäßig verteilt die PDMS auf die SU-8-Master. Jede Blasen während dieses Prozesses generiert, müssen beseitigt mit Hilfe einer Sonde werden. [Hinweis: Heben Sie die Transparenz der Erzeugung von mehr Blasen zu verhindern.] </li><li> Ein Borofloat Platte befindet sich oben auf die Transparenz Blatt, um eine einheitliche Druck auszuüben platziert. Sanfter Druck auf der Oberseite der höchsten kreisförmige Strukturen (auf halbem Weg der Kanallängen und zentriert entlang der Breite der Kanäle), so dass es keine oder nur minimale PDMS eingeklemmt zwischen der Transparenz und der SU-8 Oberfläche der kreisförmigen angewendet Strukturen. </li><li> Drei weitere Borofloat Brammen werden auf der Oberseite des Silizium-Wafer-Borofloat Platte Sandwich um einen konstanten Druck auf der Oberseite der kreisförmigen Öffnung Strukturen vor und während der Aushärtung gelten platziert. </li><li> Die Temperatur der heißen Platte wird dann auf 75 ° C erhöht und die PDMS ist bei dieser Temperatur 1 Stunde gehärtet. Die Heizplatte wird auf eine Temperatur von 50 ° C gebracht </li><li> Die Platten werden entfernt und die Transparenz wird sanft entfernt und hinterließ der Meister und die dünne PDMS Blatt oben drauf beschichtet. </li></ol> Der Bau der Mikrofluidikvorrichtung Entfernung von PDMS Blatt vom Meister <ol><li> Die äußere Begrenzung des Perfusionskammer erfolgt auf der PDMS Blatt mit einer Rasierklinge nach dem Ausrichten der Anschlüsse auf der Perfusionskammer mit den Häfen an der SU-8 Master geschnitzt. </li><li> Die PDMS Blatt wird dann vorsichtig aus dem Master entfernt, zieht sich entlang der Länge der Kanäle zu verhindern Reißen PDMS. Die PDMS Blatt ist auf einer Transparenz Blatt mit der mikrofluidischen Netzwerk Oberfläche nach oben gelegt. </li><li> Die Einlass-und Auslasskanäle werden dann unter Verwendung einer Korkbohrer. </li></ol> Kleben von PDMS Blatt zu Deckglas <ol><li> Die Klebefläche des PDMS Blatt (die Oberfläche mit der Mikrofluidik-Netz) und einem Deckglas werden dann schonend gereinigt mit einem 3M Scotch Tape, platziert auf einem Blatt der Transparenz, und schließlich in der O 2 Plasmakammer gelegt. </li><li> Die Klebeflächen sind mit 165 Watt Plasma für 10 s. behandelt Das Plasma behandelte Oberfläche des Deckglases wird sofort an das Plasma behandelte Oberfläche des PDMS geklebt. Hinweis: Wenden Sie sanften Druck auf die Glasoberfläche, um mögliche Luftblasen zwischen den Klebeflächen gefangen zu entfernen. </li><li> Lassen Sie 5 Minuten, um eine gute Bindung zwischen dem PDMS und Glas zu erhalten. Nach 5 Minuten entfernen Sie vorsichtig die Transparenz auf dem die PDMS Blatt für die Bonding-Prozess gelegt wurde. </li><li> Die mikrofluidischen Gerät ist in der Sauerstoff-Plasma-System, um die Kanäle hydrophilen platziert. Die Plasma-Behandlung ist bei 165 Watt für 1 Minute. </li></ol> Integration von mikrofluidischen Gerät und Perfusionskammer Vorbereitung der Perfusionskammer <ol><li> Eine off-the-shelf Perfusionskammer bestellt wurde, und Einlass-und Auslasskanäle wurden gebohrt, so dass, wenn die Mikrofluidik-Gerät und die Kammer gebunden sind, die Anschlüsse an die Kammer und das Gerät ausgerichtet werden. Die untere Fläche des Perfusionskammer ist mit P beschichtetDMS um eine gute Abdichtung zwischen der Kammer und der mikrofluidischen Gerät zu erhalten. </li><li> Ein Schreib-on Transparenz Blatt ist auf einer heißen Platte an der Raumtemperatur vorgelegt. </li><li> Ein Gramm PDMS-Lösung wird in einem Prozess ähnlich wie oben beschrieben vorbereitet. Die blasenfreie PDMS-Lösung wird dann langsam auf die Transparenz Blatt Vermeidung Generation von Blasen verzichtet. </li><li> Die Perfusionskammer wird dann auf dem PDMS-Lösung gelegt. </li><li> Ein Borofloat Platte wird dann auf der Oberseite der Kammer um eine gleichmäßige Druck auszuüben und zu einer dünnen Beschichtung von PDMS an der Bodenfläche der Kammer zu erhalten platziert. </li><li> Die Temperatur der heißen Platte wird dann auf 75 ° C erhöht und die PDMS ist bei dieser Temperatur 1 Stunde gehärtet. </li></ol> Bonding von mikrofluidischen Gerät und Perfusionskammer <ol><li> Die Platte wird entfernt und die Transparenz wird sanft entfernt werden, wobei hinter dem Perfusionskammer und die dünne PDMS beschichtetes Blech auf der unteren Fläche. Unerwünschte PDMS entfernt mit einer Rasierklinge und einer scharfen Spitze Sonde für PDMS Entnahme aus Access-Ports. </li><li> Die PDMS Oberfläche des mikrofluidischen Gerät und dem PDMS Bodenfläche der Kammer werden dann schonend gereinigt mit einem 3M Klebeband, platziert auf einem Blatt der Transparenz, und schließlich in der Sauerstoff-Plasma-Kammer gelegt. </li><li> Die Oberflächen sind mit 165 Watt Plasma für 10 s. behandelt Die PDMS beschichtete Oberfläche der Kammer sofort an der PDMS-Oberfläche des Mikrofluidikvorrichtung verklebt. Hinweis: Wenden Sie sanften Druck auf die Glasoberfläche, um mögliche Luftblasen zwischen den Klebeflächen gefangen zu entfernen. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch wird das Gerät in der Sauerstoff-Plasma-System, um die Kanäle hydrophilen platziert. Die Plasma-Behandlung ist bei 165 Watt für 1 Minute. </li></ol> Offenlegen von Hirnschnitten zu neurochemischen Mikroumgebung mit dem Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Die hydrophile Mikrokanäle der (Mikrofluidik-Gerät) - (Perfusionskammer) Kombination mit Standard-ACSF (Artificial Rückenmarksflüssigkeit)-Lösung gefüllt. </li><li> Dispense kleinen Tropfen ACSF-Lösung am Eingang-Ports und lassen Sie die Lösung, böse zu sein bis in die Kanäle. Entfernen Sie alle Luftblasen links mit einer Spritze aus dem Auslass. Dispense eine große Tropfen ACSF-Lösung an der Auslassöffnung zu ermöglichen passive Abpumpen von Flüssigkeiten vom Einlass zum Auslass-Ports des Mikrofluidikvorrichtung. Hinweis: Achten Sie darauf, um alle Luft aus den Kanälen zu entfernen, um Strömung von Flüssigkeiten mittels passiver Pumpen-Methode zu ermöglichen. </li><li> Fix die (Mikrofluidik-Gerät) - (Perfusionskammer) Combo in der Ebene Plattform und fixieren die Ebene Plattform in das Mikroskop-Adapter. </li><li> Schließen Sie die Standard-Ein-und Auslass (Saug-) Schlauch an den Perfusionskammer für die kontinuierliche Perfusion des Gehirns Scheibe mit Standard-ACSF Lösung. Die ACSF Lösung wird kontinuierlich mit 95% O2-5% CO 2 angesaugt. Hinweis: Passen Sie die Position der Saugleitung zu konstanten Niveau von ACSF in das Bad der Perfusionskammer aufrecht zu erhalten. </li><li> Sobald die Perfusionskammer mit ACSF-Lösung gefüllt ist, legen Sie ein Hirnschnitt in der Perfusionskammer mit Hilfe einer Pipette. Mit einer Sonde, positionieren Sie den Hirnschnitt über der runden Öffnungen in der Mikrofluidik-Gerät. Sobald das Gehirn Scheibe an der gewünschten Position über der runden Öffnungen, verwenden Sie ein Stück Anker an das Gehirn Scheibe zu fixieren. </li><li> Die mikrofluidischen Gerät kann nun verwendet werden, um den Hirnschnitten (platziert in der Perfusionskammer und auf der Oberseite des mikrofluidischen network) auf verschiedene Neurotransmitter mit passiven Abpumpen von Flüssigkeiten ausgesetzt werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+PDMS+microfluidic+chamber+for+controlling+brain+slice+microenvironment.">Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment.</a> Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).</li><li>Walker, G. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+passive+pumping+method+for+microfluidic+devices.">A passive pumping method for microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).</li></ol>

Die Autoren sind offen für Kooperationen mit der nachgewiesen Mikrofluidik-Technologie auf verschiedene Bereiche der Biologie.

Bestehende makroskopischen oder mikro Hirnschnitt Perfusionskammern sind in Bezug auf die räumliche Auflösung bieten sie an Hirnschnitten mit Neurotransmittern aussetzen begrenzt. Die Mikrofluidikvorrichtung Technologie demonstriert hier überwindet diese Einschränkung mit einfachen BioMEMS Techniken. Es wird erwartet, dass die Einfachheit in der Herstellung der Mikrofluidik-Gerät und die Leichtigkeit in die Integration mit bestehenden Elektrophysiologie Setups wird weit verbreitete Anwendung der Beweis Gerätetechnik ermöglichen. Inte...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RC-26GPL</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>W2-64-0236</td>
<td>Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>SHD-26GH/10</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>W2-64-0253</td>
<td>Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing </td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Plasma Preen-II 862</td>
<td>Tool</td>
<td>Plasmatic Systems, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microwave plasma system</td>
</tr>
<tr>
<td>Model P-1</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>W2-64-0277</td>
<td>Series 20 Plain Platform, Model P-1</td>
</tr>
<tr>
<td>SA-NIK</td>
<td>Tool</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>W2-64-0291</td>
<td>Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK</td>
</tr>
<tr>
<td>Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid)</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exact composition will vary with application</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

brain slice stimulation using a microfluidic network and standard perfusion chamber

Wir haben die Herstellung eines Zwei-Ebenen-Mikrofluidik-Gerät, das leicht in bestehende Elektrophysiologie Setups integriert werden demonstriert. Die Zwei-Ebenen-Mikrofluidikvorrichtung wird unter Verwendung eines zweistufigen Standard-Negativ-Resist-Lithographie-Prozess 1. Die erste Stufe enthält Mikrokanäle mit Einlass-und Auslasskanäle an jedem Ende. Die zweite Ebene enthält mikroskaligen kreisrunde Löcher auf halbem Weg von der Kanallänge und zusammen mit Kanalbreite zentriert. Passive Pumpen-Methode wird verwendet, um Flüssigkeiten von der Einlassöffnung zu der Auslassöffnung 2 Pumpe. Die mikrofluidischen Gerät ist mit off-the-shelf Perfusionskammern integriert und ermöglicht die nahtlose Integration mit der Elektrophysiologie-Setup. Die Flüssigkeiten am Eingang-Ports fließen durch die Mikrokanäle zum Auslass-Anschlüsse eingeführt und auch durch die kreisrunden Öffnungen auf der Oberseite der Mikrokanäle in das Bad der Perfusion befindet entkommen. So ist die untere Fläche des Gehirns Scheibe in der Perfusionskammer Bad und über der Mikrofluidikvorrichtung platziert werden können mit verschiedenen Neurotransmittern ausgesetzt werden. Die mikro-Dicke der Mikrofluidik-Gerät und die transparente Beschaffenheit der Materialien [Deckglas und PDMS (Polydimethylsiloxan)] verwendet werden, um die Mikrofluidikvorrichtung ermöglichen Mikroskopie des Gehirns in Scheiben schneiden. Die mikrofluidischen Gerät ermöglicht Modulation (sowohl räumlich und zeitlich) der chemischen Reize eingeführt, um die Hirnschnitt Mikroumgebungen.

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Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

Wir zeigen die Herstellung eines einfachen Mikrofluidik-Gerät, das mit Standard-Elektrophysiologie-Setups integriert werden kann, um mikro-Oberflächen eines Hirnschnitt in einer gut kontrollierten Weise zu verschiedenen Neurotransmittern aussetzen.

Hirnschnitt Stimulation mit einem mikrofluidischen Netzwerk-und Standard-Perfusionskammer

We have demonstrated the fabrication of a two-level microfluidic device that can be easily integrated with existing electrophysiology setups. The ...

brain-slice-stimulation-using-microfluidic-network-standard-perfusion

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Aufrufe.  University of Illinois, Chicago. Wir zeigen die Herstellung eines einfachen Mikrofluidik-Gerät, das mit Standard-Elektrophysiologie-Setups integriert werden kann, um mikro-Oberflächen eines Hirnschnitt in einer gut kontrollierten Weise zu verschiedenen Neurotransmittern aussetzen.

Serie: Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Forschung

Biologie

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Einfrieren, Auftauen und Packaging Cells für Verkehr

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Kartierung der Nachwirkungen der Theta Burst Stimulation auf das menschliche Gehör Cortex mit Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...