Wir wollen Tyson Foods Inc. für die großzügige Bereitstellung der befruchteten Eier zu erkennen. Shanna Arnold war während der Dreharbeiten zu diesem Protokoll instrumental. Trenis Palmer wurde von den National Institutes of Health unter der Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch CCSRI Grant # 700537 zur JDL und NIH / NCI gewähren # CA120711-01A1 und CA120711-01A1 auf AZ unterstützt.

1. Vorbereitung der Eier für xenografting (spontane Metastasierung) <ol><li> Frisch gelegt befruchtete Hühnereier sind in einer sich drehenden Inkubator für 10 Tage bei 100 ° F und 60% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Eier gedreht werden viermal pro Stunde. </li><li> Auf Entwicklungsstörungen Tag 10 werden die Eier auf ihrer Seite in einem Ei Rack platziert. Ein Schwanenhals-Lampe oder einem anderen geeigneten Lichtquelle dient zur Kerze die Eier durch leuchtendes Licht in der Eierschale am stumpfen Ende des Eis, wo die airsac befindet. </li><li> Die chorioallantoic Vene liegt und markiert. Diese Ader ist an der Spitze der Eierschale, wo es ist Knotenpunkt mehrerer großer Blutgefäße entfernt. An diesem Knotenpunkt des Blutgefäßes fällt nach unten, weg von der CAM und misst an der Embryo. Ein 1cm quadratischer Kasten ist mit Bleistift auf der Eierschale ca. 1 cm entfernt von der Verzweigung in die Vene gezogen. Der Bereich darunter und um den Platz wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in Jod getränkten. </li><li> Mit einem rotierenden Schneidwerkzeug (Dremel) mit einem Silikon-Karbid Schleifstein (Dremel Teil # 84922) ein Loch durch den stumpfen Ende des Eis in die Luft sac gebohrt ausgestattet. Mit diesem gleichen Werkzeug ein Loch in der zuvor gezeichneten Quadrat auf der Oberseite des Ei gebohrt, stoppen kurz der Eierschale Membran. Ein 25-Gauge-Kanüle mit einem feinen Bohrer am Ende wird verwendet, um ein kleines Loch in der Eierschale Membran man aufpassen, nicht auf die zugrunde liegende CAM reißen zu machen. Die CAM wird anschließend aus der Eierschale Membran im Bereich des Platzes mit sanftem Sog mit einer automatischen Pipette Hilfe mit einem Stück ¼ &quot;Tygon-Schlauch gegen das Loch in der airsac platziert ausgestattet erstellt abgelöst. Nach abgesaugt, sollte ein Luftpolster unter dem Loch auf dem Platz bedeutet, dass die CAM wurde erfolgreich entfernt von der Eierschale gesunken. Nach dem CAM fallen gelassen wird, ist das Loch in der Luftsack und das Loch auf dem Platz in der Nähe des chorioallantoic Vene liegt mit einem Stück Klebeband Labor Klebeband versiegelt. Die Eier werden anschließend in einer stationären Inkubator bei 100 ° F und 60% Luftfeuchtigkeit gestellt in der Erwartung der Transplantation der Tumorzellen. Siehe Abbildung 1 für eine sequentielle Darstellung. </li></ol> 2. Vorbereitung der Eier für die intravenöse Injektion (experimentelle Metastasierung) <ol><li> Frisch gelegt befruchtete Hühnereier sind in einer sich drehenden Inkubator für 12 Tage bei 100 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Eier gedreht werden viermal pro Stunde. </li><li> Auf Entwicklungsstörungen Tag 12 werden die Eier auf ihrer Seite in einem Ei Rack platziert. Ein Schwanenhals-Lampe oder einem anderen geeigneten Lichtquelle dient zur Kerze die Eier durch leuchtendes Licht in der Eierschale am stumpfen Ende des Eis, wo die airsac befindet. </li><li> Die chorioallantoic Vene liegt und markiert. Ein 1cm um 0,5 cm Rechteck wird mit Bleistift auf der Eierschale direkt über die Vene gezogen. Der Bereich darunter und um den Platz wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in Jod getränkten. </li><li> Ein kleines Fenster ist in der Eierschale in der gezeichneten Lage mit dem Dremmel Bohrer (Nr. 118) erstellt. Das Fenster wird entfernt, um die zugrunde liegenden Eierschale Membran, die anschließend gerendert wird transparent mit Tropfen Mineralöl aussetzen. Siehe Abbildung 5A für eine grafische Darstellung. </li><li> An dieser Stelle das Loch in der Luftsack und das Loch auf dem Platz in der Nähe des chorioallantoic Vene liegt mit einem Stück Klebeband Labor Klebeband versiegelt. Die Eier werden anschließend in einer stationären Inkubator bei 100 ° F und 60% Luftfeuchtigkeit gestellt in der Erwartung der Injektion der Tumorzellen. </li></ol> 3. Vorbereitung Tumorzellen für die Transplantation oder Injektion. <ol><li> Für xenografting, werden die Tumorzellen von ihrer Kulturschalen mit Trypsin / EDTA abgelöst und gewaschen mit 10 Volumen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), um restliches Medium, Trypsin oder EDTA zu entfernen. </li><li> Für IV Injektion werden kultivierten Zellen abgelöst durch enzymatische Zell-Dissoziation Lösung gewaschen und mit serumfreiem DMEM. und) </li><li> Die Zellen werden mit einem Hämacytometer gezählt und in PBS bei 10-40 Mio. Zellen / ml für die Transplantation, oder alternativ in serumfreiem DMEM auf 1 Mio. Zellen / ml für iv Injektion resuspendiert. </li></ol> 4. Grafting die Tumorzellen auf die neu freigelegten CAM (Spontane Metastase) <ol><li> Die Eier werden aus dem Brutschrank entnommen und in einem kleinen Fenster wird in die Lage der zuvor gezeichneten Platz, wo die neue Luftblase gebildet hat geschnitten. Dies geschieht am einfachsten mit einem rotierenden Werkzeug mit einer Trennscheibe (Dremel-Tool mit der Nr. 409 kreisförmige Trennscheibe) ausgestattet getan. Ein Paar von Nadel-Nase Zange wird verwendet, um den kleinen Teil der Eierschale zu entfernen und legen das darunterliegende CAM. </li><li> Mit einem Wattestäbchen (Fisher Brand # 23-400-001) die CAM ist 5 mal abgeschliffen. Ein wenig Blut soll auf der Baumwolle evident. Unmittelbar nach Beschädigung der CAM ist 25 &amp;mgr; l der Zellsuspension auf die beschädigte Stelle platziert. Die optimale Anzahl der Zellen bestimmt empirically kann aber von 0.5X10 5 bis 1x10 6-Bereich. Die Fenster in das Ei fest mit Klebeband versiegelt und die Küken stehen gelassen für 10-15 Minuten, damit die Zellen zu begleichen. Nach 15 Minuten werden die Eier mit dem stationären Inkubator zurückgegeben. </li><li> Die Tumoren dürfen für 5-8 Tage, abhängig von der jeweiligen Anwendung und der Art der Tumor-Zelllinie verwendet werden. Siehe Abbildung 1 für eine sequentielle Darstellung. </li></ol> 5. Die intravenöse Injektion von Tumorzellen (Experimental Metastase) <ol><li> Mit einer 30-Gauge-Insulinspritze 100 &amp;mgr; Zellsuspension wird in die Allantois Vene jedes Embryos injiziert wurde, wurden die Eier mit einer stationären Inkubator zurück und blieb dort für eine zusätzliche 1-7 Tage. </li><li> An verschiedenen Zeitpunkten werden die Lungen-oder unteren CAM von jedem Embryo geerntet und für den Nachweis von Tumorzellen, wie unten beschrieben. </li></ol> 6. Harvesting Tumoren und chick Gewebe <ol><li> A-Dissektion Gebiet vorbereitet wird. Der Test erkennt metastatischen Zellen durch Quantifizierung menschlicher DNA mit Hilfe eines hochempfindlichen PCR-Ansatz. Es ist daher sehr wichtig, um die Kontamination mit exogenen DNA zu verhindern. Dissektionen sind in einem speziellen Bereich durchgeführt und in der gesamten Dissektionen sind die Werkzeuge zwischen den einzelnen Tieren gereinigt. Ein Satz zum Schneiden das Ei, ein Satz zur Entfernung des Primärtumors und ein Satz für die Entfernung der inneren Organe: Um eine Kreuzkontamination von Proben oder während der Dissektion Prozess 3 separate Gruppen von Werkzeugen verwendet werden zu verhindern. Darüber hinaus sind vier waschen Behälter für sequentielle Spülen von Werkzeugen zwischen den einzelnen Tieren verwendet. In Folge dieser Waschungen sind: 1) doppelt destilliertes Wasser, 2) doppelt destilliertes Wasser, 3) Chlorbleiche, und 4) 70% Ethanol. </li><li> Die Eier werden von der stationären Inkubator entnommen und auf Eis für 15 Minuten zu betäuben und einschläfern der Tiere. Die Fenster sind geöffnet, so dass die Tumoren sichtbar werden. Das Öffnen der Fenster größer, indem einige der Eierschale kann notwendig sein. Die primären Tumoren sind von der CAM reseziert, gewogen und verarbeitet für die Histologie. </li><li> Das Küken aus der Eischale, indem man die Schale radial in gleiche Hälften entfernt. Der Embryo ist vom Schnitt Shell dekantiert und in einen sauberen wiegen Boot Brust nach oben. Das Tier ist mit mit einem frischen, sauberen Satz von Werkzeugen zerlegt. Das Tier ist durch einen Schnitt durch das Brustbein eröffnet. Sobald der Embryo ist offen, ein Stück von der Leber aus der rechten oder linken Lappen gesammelt. Die inneren Organe werden anschließend durch leichtes Ziehen an der Speiseröhre an der Muskelmagen und Schneiden der visera, dass die Organe verbinden entfernt. Um zu sammeln Lunge geschnitten wird der Brustkorb eröffnet die Brust Platte getrennt wird und das Herz wird entfernt. An dieser Stelle ist es möglich, rund um die vier Seiten der Lunge Schnitt (oben am nächsten an der Spitze der linken Seite entlang des Brustkorbs, der Boden in der Nähe des Zwerchfells und der rechten Seite entlang der Luftröhre). Aus Gründen der Konsistenz ist die gleiche Lunge in jedes Tier erhoben. Geerntet Gewebeproben bei -20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert oder sofort für die DNA-Isolierung weiterverarbeitet werden. </li></ol> 7. Genomic DNA Isolation und quantitative PCR-Analyse <ol><li> Genomische DNA aus Geweben mit dem SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit (Sigma-Aldrich Katalog Nr. XNATRG) extrahiert. Die extrahierte DNA kann auf eine saubere Eppendorf-Röhrchen überführt und bei -20 ° C oder sofort verwendet. Es ist wichtig, um die DNA 1:50 in Nuklease freiem Wasser verdünnt, bevor Sie es in der anschließenden PCR-Reaktion. Alternativ können DNA extrahiert mit einer beliebigen Anzahl von Standard-DNA-Extraktion-Protokolle (Zijlstra et al., 2002). </li><li> Menschliche DNA ist in das Küken Gewebe mittels quantitativer PCR spezifisch für humane Alu-Sequenzen erkannt werden. Quantitative PCR mit Alu-spezifischen Primer erfolgt mit dem SYBR green Verstärkung aus der Exract-N-Amp-Kit. Die PCR-Kit kommt mit einem 2x Reaktionsmischung mit SYBR green, Puffer, Salze dNTPs, Taq-Polymerase und die Jumpstart Taq Antikörper. Die Reaktionsmischung wird in einem Endvolumen von 15μl, mit 0.4μM von jedem Primer. Für die meisten Instanzen mit der extrahierten DNA 1:50 wird quantitative Daten zu liefern, jedoch kann die optimale Menge an Template-DNA müssen empirisch optimiert werden. Huhn GAPDH Primer sind als interne Kontrolle der PCR unter folgenden Bedingungen für die Alu-Sequenzen ausgeführt wird verwendet: Polymerase-Aktivierung bei 95 ° C für 2 min von 30 Zyklen bei 95 ° C für 30 s., 63 ° C für 30 s. , 72 ° C für 30 s. Die Reaktionsbedingungen für Hühner GAPDH sind identisch mit denen für Alu beschrieben, jedoch kann es erforderlich sein, um die PCR zu 40 Zyklen erstrecken. </li><li> Quantitative Analyse von Metastasen erfolgt mit dem ΔΔCt Methode vergleicht experimentelle Gruppen zu einer Kontrollgruppe (Schmittgen und Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativ kann eine Standard-Kurve kann mit Hilfe einer Verdünnungsreihe von humanen Tumor-Zellen extrahiert mit der Extract-N-Amp-Kit (Zijlstra et al., 2002). Die statistische Signifikanz ausgewertet wird mittels Student T-Test oder ANOVA-Analyse von Kontroll-und Versuchsgruppen. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Der Hühnerembryo Metastasen-Modell. A) Ein Vier-Panel Diagramm, das Aussehen des Modells im Querschnitt an den wichtigen Schritten: 1. Nach 10 Tagen Inkubation. Die CAM ist eine nahezu maximale Größe erreicht. Die Arterien und Venen sind deutlich sichtbar mit der Allantois Vene gegen die Spitze des Ei positioniert. 2. Das Ei unmittelbar nach dem Bohren Sie zwei Löcher in die Schale: eine in die airsac und einer neben dem Befestigungspunkt für die Allantois Vene. 3. Das Aussehen nach einem milden Vakuum wurde verwendet, um die airsac evakuieren und Drop die CAM. Tumor-Zellen (blau) sind auf die abgelegte CAM angewendet. 4. Nachdem die veredelten Tumorzellen wachsen, werden der Tumor zusammen mit Gewebe aus dem Hühnerembryo zur Analyse geerntet B) Eine serielle Darstellung des Modells:. 1. Inkubation der Eier., 2. Kennzeichnung der Lage des Allantois-Vene., 3. Bohren von Löchern in der Eierschale., 4. Fallenlassen des CAM., 5. Schneiden einer Öffnung für Tumorzellen Pfropfen., 6. Die Anwendung der Tumorzellen., 7. Das Kühlen der Eier auf dem Eis vor dem Sammeln von Gewebe., 8. Die Ernte der Tumor nach 7 Tagen Wachstum. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Histologie der CAM Tumoren. Gewebe von tumortragenden Chorioallantoismembran genommen wurde in Formalin, geschnitten fixiert und mit einem Trichrom. A) HEp3 Tumor nach sieben Tagen Wachstum auf der CAM. B und C zeigen vergrößerte Regionen von A zeigt sowohl Tumor und Stroma. D) Normalen CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Quantitative Längsschnittanalyse von Metastasen. Varianten für den Kopf-Hals-Karzinom HEp3 mit hohem oder niedrigem metastasiertem Fähigkeit (HEp3 M (High) und HEp3 M (Low)), wurden auf ihre Fähigkeit zur Verbreitung mittels Alu-PCR analysiert. Zehn Tiere wurden zu jedem Zeitpunkt für die Dauer von 7 Tagen analysiert. Diese Proben wurden gegen eine Standardkurve quantifiziert und anschließend ausgedrückt als # cells/50mg Gewebe. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Die Hemmung der spontanen Metastasierung Zellen in Tieren, die mit der Metastasierung hemmen Antikörper 1A5 behandelt. Die Tumore wurden gebildet mit 5x10 5 HEp3 Zellen angewendet, um die CAM von Tag-10 Embryonen. Drei Tage nach dem Auftragen der Tumorzellen die Hälfte der Tiere mit dem anti-CD151-Antikörper 1A5 behandelt wurden. Die Lungen von tumortragenden Tieren wurden zwei Tage später geerntet und der quantitativen real-time PCR alu. Umgekehrt quantitative real-time PCR der chGAPDH wurde verwendet, um das Vorhandensein von entsprechenden Mengen von Host genomischer DNA (Die ΔΔCt Methode wurde verwendet, um die beiden Gruppen quantitativ zu vergleichen (B) bestätigen. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Auswertung Verhaftung, Wachstum und intravasation in den metastatischen Kaskade. Verhaftung, Wachstum, und die Rate der intravasation: Grundsätzlich ist Metastasen zu einer sekundären Organ durch die Beiträge der drei Aspekte definiert. Diese können quantifiziert durch eine Kombination von experimentellen Metastasen (A) und spontane Metastasen (B) sein. Mit experimentellen Metastasen (A) zu verhaften, als die Zahl der Zelle definiert wird erkannt 2h nach der Injektion. Überleben und Wachstum von Zellen verhaftet ist als die Veränderung der Zellzahl 24 Stunden nach der Injektion bestimmt. Das Wachstum ist als die Rate der Proliferation während Tage 3-7 definiert. Intravasation wird mit spontanen Metastasierung (B), wo die Zahl intravasated Zellen ist wie die metastatischen Belastung darstellen am Tag 7, dass die vorhergesagten Wert durch das Wachstum der Metastasen Belastung darstellen am Tag 6 übertrifft definiert. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Visualizing Ausbau des metastasierten in die CAM. HEp3 Zellen, die GFP wurden intravenös über Entwicklungsstörungen Tag 12 injiziert. Am Tag 1, 3 und 5 ein Ei wurde geopfert und ein Teil der CAM wurde mit einem fluoreszierenden Stereo-Mikroskop abgebildet. Die dunkelgrünen Hintergrund durch die Eierschale erstellt wird, wird das Gefäßsystem sichtbar als schwarze Linien, und die Tumorzellen sind sichtbar als hellgrüne Flecken.

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	<li>Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling.">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li><li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick.">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li><li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse,+rat,+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos.">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin/MMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases.">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li><li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li><li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151.">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction.">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li></ol>

Das Küken CAM ist seit Jahrzehnten als Modellsystem, um verschiedene Aspekte der Tumorbiologie und metastatischen Progression Studie verwendet. Prinzip Auswertung des metastasierten Fähigkeiten haben in diesem Modell wurde durch eine Vielzahl von Gruppen, einschließlich der Analyse der Vegetationsruhe durchgeführt (. Aguirre Ghiso et al, 1999; Ossowski und Reich, 1983), Gewebe-Remodeling (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) und Metastasierung (Zijlstra et al, 2008;...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 1X Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (1x), flüssig </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td> Trypsin, 0,05% (1X) mit EDTA 4NA, flüssig </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Diese Inkubatoren sind einige der am leichtesten verfügbar. Allerdings wird das Video zeigen verschiedene Geräte. </td></tr><tr><td> Sportsman Inkubator </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dremel Trennscheiben nicht. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Tragbare Pipette Aid </td><td> Fischer </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen Applikatoren </td><td> Fischer </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Befruchteten Eier </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Viele verschiedene Anbieter genutzt werden kann. Die Eier sollten etwa 35-55 Gramm betragen. Die Hühner legt, dass sie sollte zwischen 36 und 55 Wochen alt sein. </td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td> Hausser Scientific, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> LWL-Mikroskopbeleuchtung </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25-Gauge-Nadel </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sybr Grüne Extract-N-Amp Tissue PCR Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

Während Metastasierung von Krebszellen aus dem Primärtumor zu verbreiten, in das umgebende Gewebe einzudringen, und die Ausbreitung auf entfernte Organe. Metastasierung ist ein komplexer Prozess, der viele Gewebetypen, span variable Zeiträume betreffen, können und treten oft tief in Organen, wodurch es schwierig zu untersuchen und zu quantifizieren. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit des metastatischen Prozesses von mehreren Schritten in den metastatischen Kaskade macht es schwierig, den Beitrag eines einzelnen Aspekt der Tumorzelle Verhalten zu bewerten beeinflusst. Als Folge davon sind Metastasen Assays häufig in Versuchstieren durchgeführt, um eine unbedingt realistischen Kontext, in dem Metastasen Studie zur Verfügung. Leider sind diese Modelle durch ihre komplexen Physiologie kompliziert. Der Hühnerembryo ist ein einzigartiges In-vivo-Modell, das viele Beschränkungen überwindet, um das Studium Metastasierung, wegen der Erreichbarkeit der Chorioallantoismembran (CAM), einem gut durchbluteten extra-embryonalen Gewebe unter der Eierschale, die empfänglich für die xenografting von Tumorzellen befindet (Abbildung 1). Da darüber hinaus die Hühnerembryo natürlich immundefizienten ist die CAM leicht unterstützt die Transplantation von Normal-und Tumorgewebe. Am wichtigsten ist, die aviäre CAM erfolgreich unterstützt die meisten Krebszellen Eigenschaften wie Wachstum, Invasion, Angiogenese und Umbau der Mikroumgebung. Dies macht das Modell besonders nützlich für die Untersuchung der Signalwege, die zu Krebs Metastasen führen und die Reaktion von metastasierendem Krebs, neue potenzielle Therapeutika vorherzusagen. Der Nachweis von disseminierten Zellen durch artspezifische Alu-PCR ermöglicht die quantitative Erfassung Metastasen in Organen, die durch so wenig wie 25 Zellen besiedelt sind. Mit dem Human Epidermoidkarzinom Zelllinie (HEp3) verwenden wir dieses Modell zur spontanen Metastasierung von Krebszellen in entfernte Organe, wie das Küken Leber und Lunge zu analysieren. Zusätzlich hatte der Alu-PCR-Protokoll zeigen wir die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Tests als Instrument zur Analyse und Quantifizierung intravasation, Verhaftung, Extravasation und Kolonisierung als einzelne Elemente der Metastasierung.

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Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

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Serie: Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Einem orthotopen Modell des Murine Blasenkrebs

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Forschung

Medizin

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Quantitative Visualisierung und Erkennung von Hautkrebs mit Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Ein orthotopen Blasenkrebs-Modell für Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...