Diese Studie wurde von CCSRI Grant # 700537 und CIHR Grant # 84535 zu JDL und NIH / NCI gewähren # CA120711-01A1 und CA120711-01A1 auf AZ unterstützt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss an der University of California San Diego, Animal Care und Nutzung an der University of Western Ontario.

1. Inokulation von Tumorzellen in Vogelembryo CAM <ol><li> Bereiten Sie Shell-less befruchteten Hühner-Embryonen, wie beschrieben 8. </li><li> Am Tag 9 der Embryonalentwicklung, montieren ein Mikro-Injektor mit einem 18-Gauge-Nadel auf 1 ml-Spritze verbunden. Schneiden Sie ein 5-6 cm Stück Tygon-Schlauch (1 / 32 &quot;Innendurchmesser, 3 / 32&quot; Außendurchmesser, 1 / 32 &quot;Wandstärke) und vorsichtig einführen Fase der Nadel in den Schlauch. Ca. 4-5 cm von Schläuchen sollte erstrecken sich von der Spitze der Nadel (Abbildung 1a). </li><li> Füllen Sie die Spritze und Schlauch mit Zellsuspension. Dann legen Sie eine Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauches und entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen. </li><li> Inject Tag 9 Embryonen (Abb. 1b) im Rahmen einer Dissektion Umfang mit einer Beleuchtung mit 10.000-100.000 Krebszellen als Bolus innerhalb der CAM (Abbildung 1c). Langsam injizieren Zellen und sorgfältig sicherzustellen, dass die Nadel an der richtigen Stelle für die Zellen ist, um eine sichtbare Bolus innerhalb der CAM zu bilden. Zellen, die tropfen auf den CAM-Oberfläche gereinigt mit Kimwipe oder andere Applikator kann. </li><li> Zurück Embryonen befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bei 60% Luftfeuchtigkeit und damit der Tumor nicht wachsen und vaskularisieren (bis zu 7 Tage). </li></ol> 2. Herstellung von Nanopartikeln <ol><li> Um fluoreszenzmarkierten CPMV Nanopartikel für die Injektion in den Hühnerembryo vorzubereiten; verdünnen das virale Nanopartikel (synthetisiert, wie in 8 in PBS, pH 7,4, zu einer Konzentration von 100 pg / ml Vortex Mischung vor Gebrauch gut und Zentrifuge für 1 Minute auf jeder zu entfernen. Aggregate. Ultraschallbehandlung kann auch nützlich sein in Abhängigkeit von Konjugaten und den Grad der Aggregation. Stocks von fluoreszenzmarkierten CPMVs sind für mindestens 1 Jahr stabil, wenn sie bei 4 ° C im Dunkeln. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen Aktien, indem Sie ein paar Tropfen auf einen Objektträger aus Glas und Prüfung für die Fluoreszenz. Transmission Electron Microscopy (TEM) kann auch verwendet werden um festzustellen, ob die Teilchen intakt geblieben nach der Konjugation werden. </li><li> Kurz gesagt, kann ein Mikrogramm des viralen Nanopartikel (in einem Endvolumen von 2 ul) zu Kupfer beschichteten Gitter hinzugefügt werden. Als Nächstes fügen Sie dem gleichen Volumen von 2% Uranylacetat für 1 Minute bei Elektronenmikroskop (Philips EM 410). </li></ol> 3. Die intravenöse Injektion von fluoreszenzmarkierten virale Nanopartikel <ol><li> Am Tag 16, montieren Mikro-Injektor, wie oben beschrieben. Erstellen Sie gewünschte Lautstärke von viralen Nanopartikel durch den Schlauch in die Spritze (&gt; 200 mL). Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen. Legen Sie Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauchs. Stellen Sie sicher, dass die Nadel so lange und konische wie möglich (Abbildung 2a) ist. Wenn die Nadel zu stumpf, wird er nicht in der Lage sein zu durchdringen Ektoderm und schlägt fehl, das Schiff eindringt. Wenn die Nadel ist zu scharf, wird die Spitze Zusammenbruch beim Eindringen Gewebe. </li><li> Intravenös injizieren 100 ul 1 mg / ml Fluorescein Dextran (MG 70.000 Da, Invitrogen) in tumortragenden Embryo distal von der gewünschten Stelle sichtbar gemacht werden (Abbildung 3d). Erfolgreiche Kanülierung CAM Vene ist offensichtlich durch die Rodung von Blut in den Pfad der Einspritzmenge (Abb. 2b). Beurteilen vaskuläre Leckage 1 Stunde nach der Injektion. </li><li> Intravenös injizieren 50 ul 1 mg / ml Lösung von CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) oder PEGylierte CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) zu Embryonen, die Tumore mit vaskulärer Leckage distal von der gewünschten Stelle zu visualisiert werden. </li><li> Bild Tumoren sofort und zu jeder Stunde nach der Injektion mit einem Zeiss-Examiner Z1 aufrechten Mikroskop mit einer Yokogawa drehende Scheibe, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-Kamera ausgestattet. </li></ol> 4. Echtzeit-Bildgebung intravital <ol><li> Zur Montage des Embryos Bildeinheit, eine dünne Schicht von Vakuumfett um den Umfang der Bildgebung Anschluss auf der Unterseite des Deckels des Embryos Bildeinheit und fit mit 18 mm Deckglas auf den Hafen. </li><li> Position des Embryos, so dass das Deckglas wird der gewünschte Bereich für die Bildgebung zu decken. Langsam senken Sie den Deckel, bis das Deckglas macht einfach Kontakt mit dem Embryo, und schrauben Sie den Deckel auf das Gerät, um es in Position zu halten (Abbildung 2c). </li><li> Fügen Sie Wasser erwärmt auf 37 ° C in den Embryo Bildeinheit außerhalb der Schale mit dem Embryo, und dann die gesamte Einheit auf die Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop mit der Innenseite Klimakammer äquilibriert bis 37 ° C. </li><li> Positionieren Sie die Bildeinheit enthält der Embryo unter dem Spinning Disk konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2e). Die bildgebende Einheit wird der Embryo in Position zu halten und halten das Blickfeld fixiert, während die Aufnahme von Bildern, so dass für beide dreidimensionalen Z-Stapel und Zeitreihen-Aufnahmen erfasst werden. Wir erfassen und analysieren dreidimensionale Zeitraffer-Bilder mit Perkin Elmer (ehemals Improvisation) Volocity Software-Paket (Abbildung 3a). Erwerben Sie eine hochauflösende dreidimensionale Stapel des Tumors und des umgebenden Gefäße zu visualisieren detailed Strukturanalysen an bestimmten Zeitpunkten. Erwerben Sie dreidimensionale Stapel in regelmäßigen Zeit-Punkte, um detaillierte strukturelle Veränderungen in der Gefäßversorgung des Tumors Karte. Bild Tumoren jede Stunde nach der Injektion. </li><li> Quantifizierung der Aufnahme von viralen Nanopartikel durch die Berechnung der mittleren Alexa Fluor (AF) 647-Signal in ausgewählten Regionen in den Tumor oder in das Stroma (Nicht-Tumor-Bereich) mit Bild Quantifizierung Software wie Volocity (Perkin Elmer). Der Tumor Stroma-Verhältnis wurde durch Division der mittleren AF 647-Signal in den Tumor über die mittlere AF 647-Signal in das Stroma berechnet. Ein Tumor / Stroma-Ratio von größer als 1 zeigt, dass die Nanopartikel wird durch den Tumor entnommen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: In dem hier beschriebenen Beispiel, injizierten wir HT-29 Kolonkarzinomzellen zu einem Bolus etwa 1mm in der Größe innerhalb der CAM von Tag 9 Hühnerembryonen (Abb. 1b). Nach der Impfung wurden die Embryonen für 7 Tage in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden, um ausreichend Tumorwachstum und Gefäßneubildung (Abbildung 1c) zu ermöglichen. Die Embryonen wurden intravenös mit einem niedermolekularen Dextran injiziert, um der Gefäßversorgung von Tumoren zu bestätigen, und die Tumore wurden unter dem Zeiss AxioExaminer Z1 aufrechten Mikroskop (Abbildung 2d) visualisiert. Nach intravenöser Verabreichung von CPMV-AF 647 oder CPMV-PEG-AF 647-Nanopartikel (Abbildung 3a und b) mit hoher Auflösung in Echtzeit konfokale Bildgebung (Abbildung 2e) ergab, dass sowohl CPMV und CPMV-PEG-Nanopartikeln schnell beschriftet das gesamte Gefäßsystem, aber die Aufnahme von CPMV-PEG durch den Tumor war etwa 3 mal höher als CPMV nach 12 Stunden (Abbildung 3a). Die relative Tumor Aufnahme von Nanopartikeln wurde mit Bildanalyse-Software (Volocity von Perkin Elmer). Regionen von Interesse waren innerhalb und außerhalb der Tumor ausgewählt (im Stroma) und die mittlere Fluoreszenzintensität der einzelnen bestimmt. Die Daten werden als Tumor / Stroma-Verhältnis ausgedrückt. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Mikroinjektion von Tumoren in den CAM eines Vogelembryo. (A) Die Mikroinjektion Vorrichtung ist aus den Komponenten zusammengesetzt wie angegeben. (B) Vogelembryonen am Tag 9 sind bereit, mit Tumor geimpft werden, wenn die CAM ausgebreitet hat, die gesamte Oberfläche bedeckt. (C) Am Tag 16 wird der Tumor gewachsen sein, bis zu 1 cm im Durchmesser (gestrichelte Linie) und ist bereit für die Injektion mit Nanopartikeln. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Nanopartikel-Einspritzung und intravital Bildgebung. Injection unter einem Dissektionsmikroskop zeigt (a) die Spitze des Mikroinjektor Nadel bereit, in die CAM Vene injiziert werden und (b) die Mikroinjektor Nadel in die Vene eingeführt (durch Pfeil gekennzeichnet) und Nanopartikel injiziert in den Blutfluss (gesehen durch das Löschen des Blutes). (C) Imaging-Einheit mit Vogelembryo mit dem Deckglas eine Schnittstelle direkt mit dem CAM. (D) Vor der Nanopartikel-Injektion wird der Gefäßversorgung von Tumoren untersucht mit Hilfe der Intravitalmikroskopie Bildgebung nach der Injektion von Fluorescein Dextran. (E) Imaging-Einheit mit dem Embryo auf der Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop in einem temperierten Gehäuse gesetzt positioniert, um 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Intravital Visualisierung von Nanopartikeln Aufnahme in menschlichen Tumoren. Tumoren sind 7 Stunden nach der Injektion von (a) CPMV-AF647 und (b) CPMV-PEG-AF647 visualisiert. d) Exzision des Tumors aus Vogelembryo für die spätere Analyse.

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	<li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Judenhofer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+PET-MRI:+a+new+approach+for+functional+and+morphological+imaging.">Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging.</a> Nat Med. 14, 459-465 (2008).</li><li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology.">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li><li>Chambers, A. F., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+for+experimental+metastatic+ability+of+heterologous+tumor+cells+in+the+chick+embryo+after+DNA-mediated+transfer.">Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer.</a> Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).</li><li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+glioma+growth,+invasion,+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model.">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151.">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li><li>Leong, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock;+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus.">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry &#38; biology. 11, 855-863 (2004).</li><li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting.">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li><li>Steinmetz, N. F., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+viral+nanoparticles+for+biomedicine:+the+impact+of+PEG+chain+length+on+VNP+cell+interactions+in+vitro+and+ex+vivo.">PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo.</a> Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).</li><li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells.">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , (2010).</li></ol>

Die Chorioallantoismembran (CAM) der Vogelembryo ist ein nützliches Modell für die vaskuläre Dynamik und Pharmakokinetik von humanen Tumoren zu bewerten. Die Struktur und die Position der CAM ermöglicht qualitativ hochwertige Bildaufnahme und bietet Platz für viele Arten von Krebs Xenotransplantate ohne invasive chirurgische Eingriffe. Darüber hinaus Krebs Tumorxenotransplantaten in der Chorioallantoismembran geworden vaskularisierten innerhalb von 7 Tagen implantiert und bietet eine schnelle, kostengünstige und semi-High-Throughput-Mittel, um die Akkumulation von Nanopartikeln in Tumorgewebe zu beurteilen. Da Krebs Xenotransplantate in der CAM des Shell-less Hühnerembryonen implantiert zugänglich hochauflösende Optik eines aufrechten Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskop, kontextuellen und zeitlichen Informationen über Nanopartikel-Aufnahme in der Gefäßversorgung des Tumors sind, können leicht erreicht werden. Cancer Xenotransplantate in diesem Modell eher zu wachsen seitlich über den CAM, was in Tumoren, die groß sind, während noch weniger als 200 m in die Tiefe. Das macht sie besonders für intravitale Bildgebung gut geeignet, da Standard-Epifluoreszenz Mikroskope effektiv durchdringen kann die gesamte Tumormasse. Im Gegensatz dazu vermehren Tumoren entweder oberflächlich oder orthotopen Stellen innerhalb der Maus implantiert in drei Dimensionen, so dass es schwierig, genau zu lokalisieren Nanopartikel tief in diesen Tumoren durch nicht-invasive Techniken. Wir haben dieses Modell benutzt, um die Aufnahme von Quantenpunkten, Liposomen und Eisenoxid-Nanopartikel in einer Reihe von menschlichen Tumorxenotransplantaten zu beurteilen, das auf das Potential für dieses Modell geeignet zu sein für die in vivo Analyse einer breiten Palette von Nanopartikel-Formulierungen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagent Name / Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Befruchteten Eier leghorn </td><td> Frey `s Hatchery, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td> Kann verwendet werden, jedes Modell </td></tr><tr><td> Dremel Trennscheiben nicht. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Inkubator </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Polystyrol wiegen Boote </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Platz Petrischalen </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid Gummi Behälter mit Deckel </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> Löcher in Seiten gebohrt </td></tr><tr><td> Vertical Pipette puller </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modell 720 </td><td> Einstellungen: 16,3 (Heizung) und 2,3 (Magnet) </td></tr><tr><td> Sodium Borosilikatglas Kapillarrohre </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-58 bis 10 </td><td> (OD, 1,0 mm; ID 0,58 mm, 10-cm Länge) </td></tr><tr><td> 1X Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (1x), flüssig </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypsin, 0,05% (1X) mit EDTA 4NA, flüssig </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Hitze inaktiviert </td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td> Hausser Scientific, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Eppendorf Modell 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Fine-Punkt Zange </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603-Schlauch </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 ft (1/32-inch Innendurchmesser, 3/32-inch Außendurchmesser, 1/32-inch Wandstärke </td></tr><tr><td> Injektionsnadeln für Injektionszwecke 18-Gauge-Nadel </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Box von 100 </td></tr><tr><td> 1 ml-Spritzen für Injektionen </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Box von 100 </td></tr><tr><td> LWL-Mikroskopbeleuchtung </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata Samen (California black-eye-Nr. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Indoor Wachstum Lichter </td><td> Sunlite, Gärtnerhaus Versorgung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methyl-PEO4-NHS-Ester </td><td> Durchstechen </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, PEG Succinimidylester, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 Carbonsäure (Succinimidylester) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Succinimidylester * 6-Isomer * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibasic Monohydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (für phopshate Puffer) </td></tr><tr><td> Einbasisches Dihydrogenphosphat </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (für phopshate Puffer) </td></tr><tr><td> Superose 6 Ausschluss-Spalte </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Explorer 100 Chromatograph </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA hohen Durchfluss-Kit </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti Rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Schwenklöffel </td></tr><tr><td> 50,2 Ti-Rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Festen Winkel </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Units </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa abgeschnitten </td></tr><tr><td> Gradient ehemaligen </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dextran, Fluorescein, 70.000 MW, anionische </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning Disk konfokalen Fluoreszenzmikroskop </td><td> Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluoreszenz wide-field-Mikroskop </td><td> Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-Kamera </td><td> Quorum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur Schrankgerät für Mikroskop </td><td> Precision Plastics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumfett </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Circular Deckgläschen nicht. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity Software </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hühnerembryo Gehäuse </td><td></td><td> individuell gefertigter </td><td></td></tr><tr><td> Delicate Schere </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> BioShop </td><td> FOR201.500 </td><td> Verwenden Sie in Abzug durchzuführen </td></tr><tr><td> Optimale Schnittbedingungen </td><td> Fisher; Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur (OCT) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffformen </td><td> Fischer </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Sie Gold mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Einweg-Klingen für Kryostat </td><td> Fischer </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging

Aktuelle Technologien für die Tumor-Bildgebung, wie Ultraschall, MRT, PET und CT sind nicht in der Lage, hochauflösende Bilder für die Beurteilung der Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren auf der mikroskopischen Ebene 1,2,3 ergeben, Hervorhebung der Nützlichkeit eines geeigneten Xenograftmodell in die detaillierte Aufnahme Analysen durchzuführen. Hier verwenden wir hochauflösende intravital Bildgebung Nanopartikel-Aufnahme in menschliche Tumorxenotransplantate in einer modifizierten, Shell-less Hühnerembryo-Modell zu bewerten. Der Hühnerembryo Modell ist besonders für diese in vivo-Analysen gut geeignet, da es das Wachstum von Tumoren beim Menschen unterstützt, ist relativ kostengünstig und erfordert keine Betäubung oder Operation 4,5. Tumorzellen Formular vollständig vaskularisiert Xenotransplantate innerhalb von 7 Tagen, wenn sie in der Chorioallantoismembran (CAM) 6 implantiert. Die daraus resultierenden Tumoren werden visualisiert durch nicht-invasive Echtzeit, hoch auflösende Bildgebung, hielten bis zu 72 Stunden mit wenig Einfluss sowohl auf dem Host-oder Tumor-Systemen werden kann. Nanopartikel mit einer breiten Palette von Größen und Formulierungen verabreicht distal des Tumors können visualisiert und quantifiziert werden, da sie fließen durch den Blutkreislauf, die von undichten der Gefäßversorgung des Tumors extravasieren und reichern sich am Ort des Tumors. Wir beschreiben hier die Analyse von Nanopartikeln aus Cowpea Mosaik-Virus (CPMV) mit Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoffe und / oder Polyethylenglykol Polymere (PEG) 7, 8, 9,10,11 dekoriert abgeleitet. Bei intravenöser Verabreichung werden diese viralen Nanopartikel rasch von Endothelzellen internalisiert, was im globalen Kennzeichnung der Gefäße sowohl außerhalb als auch innerhalb des Tumors 7,12. PEGylierung des viralen Nanopartikel erhöht ihre Plasma-Halbwertszeit, erstreckt sich ihre Zeit in den Kreislauf, und schließlich steigert ihre Anhäufung in Tumoren durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 7, 10,11. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Akkumulation von Nanopartikeln in einem Tumor ist über die Zeit gemessen anhand der Bildanalyse-Software. Diese Technik bietet eine Methode, um sowohl zu visualisieren und zu quantifizieren Nanopartikel Dynamik in menschlichen Tumoren.

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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Medicine

18.2K Aufrufe.  University of Western Ontario. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Serie: Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Forschung

Krebsforschung

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biotechnik

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Medizin

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Echtzeit-Tracking von Nanopartikeln in Hirntumoren mittels 2P-IVM bei Mäusen

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the accumulation and distribution of macromolecules in brain tumors in vivo would greatly enhance our ability to understand and optimize drug delivery in preclinical models. This protocol describes a method for real-time in vivo tracking of intravenously administered fluorescent-labeled nanoparticles with two-photon intravital microscopy (2P-IVM) in a mouse model of glioblastoma (GBM).
The protocol contains a multi-step description of the procedure, including anesthesia and analgesia of experimental animals, creating a cranial window, GBM cell implantation, placing a head bar, conducting 2P-IVM studies, and post-surgical care for long-term follow-up studies. We show representative 2P-IVM imaging sessions and image analysis, examine the advantages and disadvantages of this technology, and discuss potential applications.
This method can be easily modified and adapted for different research questions in the field of in vivo preclinical brain imaging.

Autor im Rampenlicht: Multimodale Bildgebungsstrategien zur Optimierung der Wirkstoffverabreichung und Früherkennung bei der Behandlung von Glioblastomen

We present a novel approach for two-photon microscopy of the tumor delivery of fluorescent-labeled iron oxide nanoparticles to glioblastoma in a mouse model.

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanodrug, das auf onkogene miRNA-10b zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs abzielt

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der

Viral Nanopartikel für

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

A Novel Hochauflösende

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen