Die Autoren möchten an das Labor von Prof. Anthony Windebank für die gemeinsame Nutzung ihrer Expertise auf DRG Dissektion und Kultur zu danken, sowie Prof. Shaochen Chen für hilfreiche Diskussionen über die DMD-Setup. Diese Arbeit wurde teilweise durch Tulane University und Zuschüsse aus dem Louisiana Board of Regents finanziert (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) und der NIH (NS065374).

1. DMD-Setup <ol><li> Die DMD Bord, UV-Lichtleiter (mit Kollimator) und 4x Objektiv sind alle senkrecht auf einer Schwingungsisolierung Tisch montiert. </li><li> Das UV-Licht führen sollte so eingestellt sein, dass das Licht den Spiegel Array trifft in einem Winkel von 45 ° gegenüber der Ebene der Spiegel, und 24 ° unterhalb der Ebene der Spiegel (Abbildung 1). </li><li> Das Objektiv ist so montiert, dass der Abstand von der DMD auf das Objektiv der Brennweite mit dem Objektiv verbunden entspricht. </li><li> Eine inverse Mikroskop unter dem Objektiv, so dass das gebündelte Licht von der DMD reflektiert wird, kann sichtbar gemacht werden durch das Mikroskop gelegt. Der Abstand vom Objektiv, um die Polymerisation Oberfläche sollte ungefähr dem Arbeitsabstand des Objektivs entspricht. Die Bühne auf dem Mikroskop kann dann verwendet werden, um diesen Abstand anzupassen, um fein Fokus des Bildes werden. Dieser Abstand kann je nach der gewählten Polymerisationstemperatur Oberfläche. </li></ol> 2. Dual-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Explantation Kulturen A. DRG Explantation Haftung <ol><li> Streichen Sie die Wände des 6-well Kollagen beschichteten Zellkultur-Einsätze (Corning) mit Regen-X, wobei darauf zu achten die Membran selbst zu vermeiden. (Alternativ kann auch eine hydrophobe Barriere Stift verwendet werden.) </li><li> Hydrate Einsätze über Nacht mit 1,5 ml Haftung Medium in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Adhesion Medium Neurobasalmedium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 20 pg / mL NGF. </li><li> Ernte embryonalen Spinalganglien (DRG) von E-15 Rattenbabys. DRG sollte auf Kollagen beschichtet 6-well-Einsätze beschichtet werden, so viele wie vier pro Einsatz. </li><li> Inkubieren Einsätze für 2 Stunden bis zur DRG Einhaltung der Membran zu ermöglichen. </li></ol> B. Dynamische Maske Photopolymerisation Eine digitale Mikrospiegel (DMD) ist ein 1024 x 768 Array einzelner Spiegel, ähnlich wie in der Projektion Fernsehgeräte, die selektiv reflektiert das Licht auf Spiegel Position. Für unsere Zwecke ist der DMD zu Muster ultravioletten (UV) Licht auf photovernetzbaren Hydrogele verwendet, wodurch vorgebbare Hydrogel-Geometrien in eine einfache und schnelle Weise. Abbildung 1 zeigt den Aufbau des DMD-und UV-Licht-Pfad. Obwohl unsere DMD ist eine eigenständige Einheit, kann das Gerät auch für den Einsatz mit vielen vorhandenen Mikroskope integriert werden. <ol><li> Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit aus einfügen, und fügen Sie 500 ul der Polymerisationsmedium Inneren des Einsatzes. Polymerisation Medium enthält 10% PEG (MW 1000) und 0,5% Irgacure 2959 in Neurobasalmedium mit 20 ug / mL NGF und 1% Pen / Strep ergänzt aufgelöst. </li><li> Den Einsatz unter dem DMD-Gerät auf einem Regen-X behandelt Glasträger. </li><li> Legen Sie das entsprechende Schwarz-Weiß-Bild, das als &quot;Fotomaske&quot; auf dem DMD eingesetzt werden, durch den Einsatz der mitgelieferten ALP-3 grundlegenden GUI-Programm. Für unsere Zwecke war ein gabelnden Form gewählt, um für die Umsetzung der Neuriten Leitsysteme ermöglichen. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop zur Visualisierung, richten Sie das Gewebe Explantate mit den entsprechenden Speicherort auf der Photomaske mit einer sichtbaren Lichtquelle reflektieren die DMD. </li><li> Schalten Sie das sichtbare Lichtquelle für die UV-Lichtquelle, und beleuchten die PEG-Lösung bis Vernetzung ausreichend ist. (Für den gegebenen Bedingungen und 5,0 Watt / cm 2 trifft auf den DMD, Vernetzung kann in weniger als 55 Sekunden abgeschlossen sein.) Wiederholen Sie für alle vier DRG an dem Einsatz. </li><li> Wash jeder Einsatz dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Wachstumsmedium unter der Zellkultur-Einsätzen, und lassen Sie sie in einen Inkubator für 30 Minuten ausgleichen. Growth Medium Neurobasalmedium mit 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0,5 mM L-Glutamin und 20 pg / mL NGF. </li></ol> C. Secondary Hydrogel Puramatrix <ol><li> Für neuronale Anwendungen, beträgt 1% Puramatrix nach den Anweisungen des Herstellers zu 0,15% in sterilem H 2 O verdünnt und ergänzt mit 1 pg / mL löslich Laminin. </li><li> Alle überschüssige Medien müssen von der PEG Hohlräume, die die DRG Explantate enthalten, mit einem sterilen Wattestäbchen, Kimwipe oder Mikropipette entfernt werden. </li><li> Puramatrix ist es, die PEG Hohlräume mit einer Mikropipette zugesetzt, um den leeren Raum ohne überzulaufen füllen. Je nach Porenvolumen, typischerweise ~ 1 ul pro Konstrukt verwendet wird. </li><li> Puramatrix beginnt der Prozess der Selbstorganisation sofort bei Kontakt mit einer physiologischen Kochsalzlösung, dh die geschwollenen PEG, aber 1,5 ml Wachstumsmedium wird unter dem Einsatz aufgenommen und in den Inkubator für eine Stunde auf insgesamt Gelierung zu gewährleisten. </li><li> Zunächst Puramatrix leicht sauer ist, so verändern die Medien nach einer Stunde, damit der pH-Wert ins Gleichgewicht. </li><li> Medien Veränderungen sind etwa alle 48 Stunden erforderlich. Achten Sie darauf, dass alle Medienaufgenommen unter dem Einsatz, um die Integrität der mechanisch schwach Puramatrix schützen. </li></ol> Agarose <ol><li> Für neuronale Anwendungen ist Agarose auf eine 1% ige Lösung in Wachstumsmedium verdünnt und in einem 60 ° C Wasserbad, bis die Agarose vollständig gelöst hat (~ 1 h). Die Lösung wird dann mit 1 pg / mL löslich Laminin ergänzt. </li><li> Alle überschüssige Medien müssen von der PEG Hohlräume entfernt werden. </li><li> Agarose ist die PEG Hohlräume hinzugefügt, um den leeren Raum ohne überzulaufen füllen. Je nach Umfang der Leere, in der Regel ca. 1 mL pro Konstrukt wird verwendet. </li><li> 1,5 ml Wachstumsmedium vorgekühlte (8 ° C) in einer 6-Well-Platte und die Agarose mit Einsätzen an den gekühlten Medien überführt und im Kühlschrank bei 8 ° C für mindestens 3 Minuten auf Agarose zu ermöglichen Gel. </li><li> Schließlich sind die Einsätze auf 1,5 mL vorgewärmtes Nährmedium (37 ° C) überführt und im Brutschrank bei 37 ° C, mit den Medien erforderlichen Änderungen alle 48 Stunden. </li></ol> 3. Dual-Hydrogel 3D-Zell-Encapsulation Dual-Hydrogel-Verkapselung ist angebracht, wenn mit jeder sich selbst organisierenden Gel. Die photovernetzbaren Gel, in diesem Fall PEG, dient als strukturelle Unterstützung für die geometrische Darstellung des sich selbst organisierenden Gel, zum Beispiel Puramatrix oder Agarose. Einige der Methoden, insbesondere die Art des Gels und die Wahl der Photomaske, wird auf den jeweils gewünschten Anwendung ab. <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. Für unsere Anwendung das Überleben der Zelle, wir haben einfach eine zylindrische Präsentation Puramatrix in der Bildgebung von Zellen zu unterstützen. Forscher studieren Zellsignalisierung interessiert sein könnte in einem Kompartiment Geometrie für die Verbreitung von chemotaktischen Molekülen ermöglichen. Zusätzlich wurde eine grobe Annäherung an eine Arterie dargestellt, um mögliche Anwendung Blutgefäß Forschung zu vertreten. </li><li> Behandeln Sie die Wände aus einem Polyester Zellkultureinsatzes mit Regen-X und unter DMD auf Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Add 500 ul der Polymerisation Medium, um die Einlage. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden. </li><li> Wash dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Entfernen Sie alle überschüssige Medien aus dem PEG Hohlräume. </li><li> Spin down Zellen in die gewünschte Dichte zu einem Pellet. Es muss darauf geachtet, alle Mittel aus dem Zellpellet vor dem Mischen zu entfernen, da Puramatrix beginnt self-assembly sofort bei Kontakt mit einer Salzlösung werden. Suspend die Zellen im Inneren 0,15% Puramatrix in sterilem H 2 O verdünnt mit 10% Saccharose. </li><li> Spritzen Sie die Puramatrix / Zelle / Saccharose-Gemisch im Inneren Hohlräume in PEG. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Wachstumsmedium unter dem Einsatz, und lassen Sie Gel in Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Ändern Medien nach einer Stunde, und ~ alle 48 Stunden danach. </li></ol> 4. Einzel-Hydrogel 3D-Zell-Encapsulation Ein einziger Hydrogel Kapselung wäre angemessen für jede Situation, wo die Zellen im Inneren kann ein photovernetzbaren Hydrogel untersucht werden. <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. Für das Überleben der Zelle Studien haben wir wieder wählte eine grundlegende runde Maske, um einen Zylinder darstellen. Masken ähnlich wie in Methode 4 gezeigt werden konnte wieder für die entsprechende Forschung Feld angelegt werden. </li><li> Gönnen ein Polyester Zellkultureinsatzes mit Regen-X und unter DMD auf Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Zellen bei jeder gewünschten Konzentration kann direkt an die 10% PEG-Lösung zugegeben werden, gut mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Add 500 ul der Polymerisation Medium, um die Einlage. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden. </li><li> Wash dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Füllen Sie mit Nährmedium sowohl unterhalb als auch auf der Oberseite des Einsatzes, ändert sich jeden ~ 2 Tage. </li></ol> 5. Thin Film Hydrogel-Polymerisation <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. </li><li> Gönnen eine Kollagen-beschichtete Polyester-Zellkultur-Einsatz mit Regen-X, und am Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Ausreichend Polymerisationsmedium gerade bedeckt den Boden des Einsatzes (~ 250-300 ul für 6-Well-Platte-Einsätze). Lassen Sie die Medien, um den Einsatz Membran für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur durchziehen. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Polymerisationsmedium aus dem Einsatz mit einer Mikropipette oder Kimwipe. Fügen Sie eine ausreichende Menge an UV-transparent Öl vollständig bedecken den Boden des Einsatzes. Lassen Sie die Einlage für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, lange genug für die Öl zu einer deutlichen Schicht über dem Polymerisationsmedium Sättigung des Einsatzes Membran bilden. </li><li> Den Einsatz und schieben Sie unter der DMD. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht. Aufgrund der geringen Dicke der PEG-Schicht kann die Vernetzung in weniger als 15 Sekunden bei 5,0 Watt / cm 2 trifft auf den DMD abgeschlossen sein. </li><li&gt; Waschen Sie die Einlage dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. (Wenn das Fortbestehen eines öligen Rückstandes ist ein Anliegen, können Sie ein mildes Reinigungsmittel wie Tween 20 (1%) auf den Waschpuffer hinzugefügt werden.) </li><li> Bewahren Sie den Einsatz in einer 6-well Gewebekulturplatte. Add Wachstum mittel-bis suspendierten Zellen, in der gewünschten Konzentration und Pipette ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in der Zellkultur einfügen, um die gewünschte Zelldichte zu erhalten. Dann fügen Sie genug Wachstumsmedium unter dem Einsatz vollständig zu erhalten Lebensfähigkeit der Zellen (~ 1,5 mL). </li><li> Nach 48 Stunden vergangen sind, waschen Sie die Einlage dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep keine unadhered Zellen zu entfernen. Ändern Medien etwa einmal alle 48 Stunden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für Dual-Hydrogel-Konstrukten, die DRG Explantate werden in Abbildung 2 dargestellt. Beachten Sie, dass zelluläre Migration und Neuriten Erweiterung der Zelle permissive Region des dualen Hydrogel-Konstrukt ist begrenzt. Abbildung 3 zeigt dissoziierten Zellen ähnlich im Dual-Hydrogel-Konstrukte gekapselt. Aufgrund der dynamischen Natur des DMD Photomaske ist die Geometrie für Kapselung nur durch die Abmessungen und die Auflösung der Optik beschränkt. Verkapselung von Zellen wurde auch in einem einzigen photopolymerisierbaren Hydrogel, PEG möglich ist, und eine Live / Dead Lebensfähigkeit Test wurde durchgeführt, wie in Abbildung 4 zeigt. Encapsulation in PEG ist nur als Beispiel gemeint, wie PEG stellt kein ideales Umfeld für Nervenzellen. Daher ist die Lebensfähigkeit der Zellen in unserem PEG-Konstrukte realisiert verständlicherweise gering. Schließlich werden Beispiele zur Nutzung dünne PEG-Filme als gemusterte restriktive Schicht für die Zelladhäsion auf Zellkultur-Einsätzen in Abbildung 5 dargestellt. Darüber hinaus werden Beispiele für mögliche &quot;schlechte&quot; Ergebnisse in Abbildung 6 angeboten. Die Ergebnisse stellen nur einen kleinen Bruchteil der möglichen Anwendungen der Methoden in unserem Labor entwickelt. Sie sollen die Benutzerfreundlichkeit und Vielseitigkeit und die Lebensfähigkeit unseres Ansatzes zu demonstrieren, und könnte als &quot;proof of principle&quot; behandelt werden, für die Forscher ihre eigenen möglichen Anpassungen zu entwickeln. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Lichtweg für die Photolithographie verwendet. Kleines Bild: Das UV-Licht beleuchtet die DMD in einem Winkel von 45 ° und 24 ° unterhalb der Ebene des Spiegels Array. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Labeled Wachstum und die Vermehrung in DRG mit Dual-Hydrogel-Konstrukte. AD) Bilder porträtieren polymerisiert PEG-Konstrukte (grau) mit Neuriten mit Beta III Tubulin (grün), DAPI gefärbten Zellkerne (blau) gekennzeichnet. Die DRG Explantate werden in Puramatrix enthalten und befindet sich in der kreisförmigen Bereiche des Musters, mit Neuriten wachsen in Richtung der Bifurkation (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Dual-Hydrogel-Konstrukten, die Zellen mit Calcein AM, ein Live-Zell-Marker, nach 48 Stunden in Wachstumsmedium gekennzeichnet. AD) Verschiedene PEG Formen, mit Puramatrix mit dissoziierten DRG-Neuronen (~ 5x10 3 Zellen / ml) gefüllt. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Einzel-Hydrogel-Konstrukt, das lebende Zellen mit Calcein AM (grün) und toten Zellen mit Ethidium Homodimer-1 (rot) nach 24 Stunden in Wachstumsmedium beschriftet (5x10 3 Zellen / ml) markiert. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Zelle restriktive PEG als dünner Film mit einer &quot;Testbild&quot;, um selektiv haften dissoziierten Zellen, die Kollagen-beschichtete Membran durchlässiger unterstützt polymerisiert. A, B) Lebende Zellen werden nach 48 Stunden mit Calcein AM (grün) gekennzeichnet, während tote Zellen mit Ethidium Homodimer-1 (rot) gekennzeichnet sind. Minimal Zelladhäsion tritt in den Bereich mit der dünnen PEG-Film. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Repräsentative Bilder unerwünschten Ergebnissen führen. A) Teilweise Polymerisation von PEG, was zu einem unbrauchbaren PEG konstruieren. Unsachgemäße Polymerisation kann durch die Anwesenheit eines Meniskus in der Pre-Polymer-Medium, unzureichende Mengen an Polymerisationsmedium, unzureichende UV-Bestrahlung oder unsachgemäße Brennpunkt der Optik auftreten. B) Bild porträtiert polymerisiert PEG-Konstrukte (grau) mit Neuriten mit Beta III Tubulin (grün), DAPI gefärbten Zellkerne (blau) gekennzeichnet. Die Neuriten konnten außerhalb der gemusterten PEG-Kanäle wachsen. Dies geschieht häufig in der Bedingung, dass Puramatrix Overflows auf dem PEG Teil während der Injektion.

<ol>
	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li><li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+three+dimensions:+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine.">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li><li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses.">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li><li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+neural+constructs:+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation.">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li><li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties.">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures.">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration.">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li><li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel.">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li><li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds.">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method.">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li><li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels.">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li><li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tectonics:+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems.">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li><li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex,+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds.">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li><li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays.">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li></ol>

Das hier beschriebene Verfahren kann von jedem Forscher, die einfache und reproduzierbare Zellkultur-Systeme verwendet werden. Theoretisch aufgrund der Vielzahl von photopolymerisierbare Hydrogele zur Verfügung, könnte der Umgebung zugeschnitten für den Einsatz mit jedem Zelltyp, darunter ganze Gewebe Explantate zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Dual-Hydrogel-System für verbesserte räumliche Steuerung in der Präsentation der Selbst-Polymerisation von Hydrogelen, die zu amorphen Formen auf ihren eigenen neigen. Die daraus resultierende &quot;2.5D&quot; mikrostrukturierten Hydrogel-Konstrukte bieten eine 3D-Matrix für neuronale Wachstum in einem 2D-Konfiguration, die praktische mikroskopische Auswertung ermöglicht vorgestellt. Der Untergrund, auf dem die Gele polymerisiert werden kann auch variiert werden, was eine größere Kontrolle in experimentellen Designs. Unsere Methoden sind für die Verwendung mit Zellkultur durchlässig unterstützt optimiert, da haben wir eine verbesserte Rentabilität (Abbildung 4) im Vergleich zur Polymerisation auf Glasplättchen (Daten nicht gezeigt). Jedoch können auch andere Polymerisation Flächen werden eher für unterschiedliche Anwendungen: Fertigung auf Glasplättchen in der Mikrofluidik Experimente oder Zellverbandes Formationen, zum Beispiel verwendet. Unsere Erfahrungen mit diesen Systemen Kultur hat zur Identifizierung von potenziellen Problembereichen geführt. Erstens sind sorgfältige Techniken erforderlich, um die Sterilität der Konstrukte zu erhalten. Aufgrund der sperrigen Natur des DMD-Setup, ist es schwierig, Polymerisation Schritte unter sterilen Bedingungen arbeiten. Zur Bekämpfung dieses Problems ist die Spülschritt in den beschriebenen Methoden hilfreich, und Antibiotika sollten in allen Medien verwendet werden. Darüber hinaus ist die endgültige Dicke und Form der polymerisierten konstruieren stark abhängig von der Flüssigkeit Verhalten der Pre-Polymer-Mischung, und das Vorhandensein eines Meniskus kann in Gel-Konstrukte, die zu dünn oder unvollständig polymerisiert (Abbildung 6) sind das Ergebnis. Zwei Schritte können unternommen werden, um die Bildung eines Meniskus in der Zellkultur-Einsätze zu minimieren. Für dicke Hydrogele (&gt; 200 Mikrometer), eine einfache Beschichtung von Regen-X um die Innenwand des Einsatzes ist ausreichend. Doch wie kurz erwähnt, für dünne Konstrukte (&lt;200 um) beschrieben, ist eine Ölschicht erforderlich, um beide zu minimieren des Meniskus und negieren Sauerstoff Abschrecken der radikalischen Polymerisation. Resolution wurde festgestellt, dass abhängig von der Dicke, mit einer Abnahme der Strukturgröße mit immer dickeren Gelen realisiert. Die Auflösung variiert je nachdem, ob die Funktion ein positives oder negatives Relief dargestellt in dem Hydrogel. Allerdings erzielten wir eine ausreichende Auflösung für Konstrukte mit minimalen Strukturbreiten in der Größenordnung von ~ 100 pm nur mit Mikroskop-Objektive als Fokussieroptik. Unsere Experimente haben gezeigt, dass die Dual-Hydrogel-Konstrukte beschrieben hier eine hervorragende Basis für die Bildung von grundlegenden In-vitro-Modelle von Neuritenwachstum und Beratung zu vertreten. Die Mikrostrukturierung verwendete Technik ist eine Anpassung der bestehenden Methoden 18,19, aber unser Set-up betonte ein einfach zu bedienendes Design implementieren und wurde für die Produktion von Dual-Hydrogel-Konstrukte auf Zellkultur-Einsätze optimiert, Zellkultur-Inserts wurden von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie als Vernetzer rund zuvor anhaftendem Gewebe Explantate. Der Umfang der Ergebnisse wird um die Interessen unserer Labor beschränkt, aber wir glauben, dass die Methoden in dieser Publikation beschrieben werden als nützlich erweisen, um Forscher auf der Suche nach einem relativ billig, schnell und einfach zu bedienen Methode für die Herstellung von 3D-Zellkultur Modelle.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Zunehmend werden gemusterte Zellkultur-Umgebungen zu einer relevanten Technik, um zelluläre Eigenschaften zu studieren, und viele Forscher glauben an die Notwendigkeit für 3D-Umgebungen, um in vitro-Experimenten, die besser in vivo Qualitäten 1-3 Mimik darstellen. Studien in Bereichen wie der Krebsforschung 4, Neural Engineering 5, Herzphysiologie 6 und Zell-Matrix-Interaktionen 7,8 haben gezeigt, das Verhalten der Zelle unterscheidet sich wesentlich von traditionellen Monolayerkulturen und 3D-Konstruktionen. Hydrogele sind als 3D-Umgebungen aufgrund ihrer Vielfalt, Vielseitigkeit und die Fähigkeit, maßgeschneiderte molekulare Zusammensetzung durch Funktionalisierung 9-12 verwendet. Zahlreiche Techniken existieren für die Erstellung von Konstrukten als Zell-unterstützenden Matrizen, einschließlich Elektrospinnen 13, Elastomer-Stempel 14, Inkjet-Druck 15, additive Photostrukturierungsverfahren 16, statische Photomaske Projektions-Lithografie 17 und dynamische Maske Mikrostereolithographie 18. Leider beinhalten diese Verfahren mehrere Produktionsschritte und / oder Geräte nicht ohne weiteres zu herkömmlichen Zell-und Gewebekultur-Methoden. Die Technik in diesem Protokoll verwendeten passt die beiden letztgenannten Methoden, mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel (DMD), um dynamische Photomasken für die Vernetzung von geometrisch bestimmten Poly-(Ethylenglykol) (PEG)-Hydrogele, durch UV-initiierte radikalische Polymerisation induziert erstellen. Die daraus resultierende &quot;2.5D&quot;-Strukturen bieten eine eingeschränkte 3D-Umgebung für neuronale Wachstum. Wir beschäftigen ein Dual-Hydrogel-Ansatz, bei dem PEG dient als Zell-restriktiven Region liefern Struktur einer ansonsten formlose, aber Zell-permissive selbst organisierenden Gel entweder Puramatrix oder Agarose hergestellt. Der Prozess ist eine schnelle einfache Schritt Fabrikation, die in hohem Maße reproduzierbar und leicht angepasst für den Einsatz mit konventionellen Zellkultur-Methoden und Substraten. Ganze Gewebe Explantate wie embryonalen Spinalganglien (DRG), können in das duale Hydrogel-Konstrukte für experimentelle Tests wie Neuritenwachstum integriert werden. Darüber hinaus können dissoziierten Zellen in der photovernetzbaren oder selbst Polymerisation Hydrogel verkapselt werden, oder selektiv auf die durchlässige Trägermembran mit Zell-restriktiven Photostrukturierungsverfahren eingehalten werden. Mit der DMD, haben wir Hydrogel-Konstrukte bis ~ 1 mm dick, aber dünner Film (&lt;200 um) PEG-Strukturen wurden durch Sauerstoff Abschrecken der radikalischen Polymerisationsreaktion begrenzt. Daraufhin haben wir eine Technik entwickelt, unter Verwendung einer Schicht von Öl über die Polymerisation Flüssigkeit, die dünn PEG-Struktur Polymerisation erlaubt. In diesem Protokoll, beschreiben wir die rasche Erstellung von 3D-Hydrogel-Systeme zur Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Zell-und Gewebekulturen. Die Dual-Hydrogel-Konstrukte zeigten hier vertreten vielseitig in-vitro-Modellen, die nützlich für Studien im Bereich der Neurowissenschaften mit Überleben der Zelle, Migration und / oder Neuritenwachstum und-richtlinien können. Außerdem ist, wie das Protokoll kann für viele Arten von Hydrogelen und Zellen arbeiten, sind die potenziellen Anwendungen sowohl vielfältig und umfangreich.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography at JoVE.com

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K Aufrufe.  Tulane University. Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Serie: Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Herstellung und Implantation von Miniatur-Zweielement Dehnungsmessstreifen für Mess<em&gt; In Vivo</em&gt; Magen-Darm-Kontraktionen in Nagetiere.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gentransfektion in Richtung Spheroid Zellen auf mikrostrukturierten Kulturplatten für genetisch veränderte Zelltransplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ökologische dynamische mechanische Analyse um die Erweichung Verhalten der neuronale Implantate

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...