Die vorliegenden Studien sind von National Heart, Lung, and Blood Institute Stipendium R01-HL0921, R01-DK083385 und R01-HL098294 HK Eltzschig, die 1K08HL102267-01 bis T. Eckle und Stiftung für Anästhesie Bildung und Forschung Zuschüsse an T. unterstützt Eckle und HK Eltzschig und American Heart Association Grant T. Eckle und HK Eltzschig und eine Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Forschungsstipendium an M. Koeppen. Wir bedanken uns bei Shelley Eltzschig für das Kunstwerk.

Allgemeine Bemerkungen: Alle Arbeiten sind unter einer aufrechten Präpariermikroskop (Olympus, SZX10 mit Z-Axis Crank Post mit STU2 StandBoom Stand) durchgeführt werden und mit Hilfe eines chirurgischen Koagulator. Ventilation ist von entscheidender Bedeutung für das Verfahren und damit eine gewisse Zeit sollte bei der Auswahl des Ventilators und der Optimierung der Lüftungstechnik ausgegeben werden. Temperatur, Blutdruck und Anästhesie sollte stabil sein ganz. 1. Anästhesie, Intubation und Überwachung <ol><li> Verwenden Sie C57BL / 6 Mäusen, die mindestens 10 Wochen alt sind. Induce Narkose unter Verwendung von Natrium-Pentobarbital in einer Dosierung von 70 mg / kg Körpergewicht ip Pflege Anästhesie mit ca. 10 mg / kg / h Natrium-Pentobarbital. Seien Sie vorsichtig mit einer Überdosierung, da diese deutlich geringere könnte den Blutdruck. Re-Dosierung von Pentobarbital - auch nach Stunden-können zu schweren Anstieg der Plasmaspiegel führen. Basierend auf einer starken Beweise für Isofluran als kardioprotektive Verbindung empfehlen wir die Verwendung des &quot;inert&quot; und etablierte Pentobarbital in ein Modell für Myokardischämie 46-56. </li><li> Legen Mäusen auf eine Temperatur gesteuerte beheizte Tisch (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Sonde Thermometer an thermischer Rückführung Steuerung der Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten </li><li> Nach Narkoseeinleitung sichere Mäuse in Rückenlage, mit den oberen und unteren Extremitäten an den Tisch mit einem Klebeband und eine Naht befestigt zu den Knöcheln. Machen Sie dasselbe für den Kopf durch die Zähne. Eine ausreichende einstweilige ist für eine erfolgreiche Intubation und gut kontrollierte Chirurgie wichtig. Vor der Operation, decken Sie die Maus mit Mineralöl, das Risiko der Maus Haare Allergien zu reduzieren. </li><li> Expose der Luftröhre operativ und führen Sie eine Intubation mit bluntpolyethylene Kanülen (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Sie müssen die Nadel stumpf in der Lage sein, sie als Mandrin verwenden. </li><li> Ziehen Sie die Zunge heraus mit einer Pinzette und dann vorsichtig in einem 15-Grad-Winkel zum Körper hin. Auch nach der Exposition der Luftröhre und mit Hilfe eines Mikroskops kann dafür eine Ausbildung. Seien Sie sich bewusst, dass eine kleine Beschädigung der Luftröhre kann die Unfähigkeit, das Tier während der Naht lüften führen. Also, wenn Sie stoßen Atemwegsprobleme überprüfen die Luftröhre für kleine Löcher. </li><li> Überprüfen Sie die korrekte Tubuslage durch direkte Visualisierung der Kanüle in der Luftröhre zuvor ausgesetzt über dem carina. </li><li> Verbinden Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät. Wir empfehlen einen Druck kontrollierte Lüftung Technik mit einem Servo 900 C von Siemens (DRE Veterinary, USA). Die Tiere werden dann belüftet mit inspiratorischen Spitzendruck von 10 mbar, Frequenz von 110 Atemzügen / min und einem positiven endexspiratorischen Druck von 3-5 mbar mit einer FiO 2 = 0,4 sein. Einstellungen Möglicherweise müssen einige Anpassungen, die am leichtesten, indem der Lunge beim offenen Thorax Chirurgie erreicht werden kann. Stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht zusammengebrochen oder überfordert. Trotz der Tatsache, dass die Servo 900 C als Beatmungsgerät für Menschen gebaut ist, funktioniert die Verwendung in einem Druck gesteuerter Lüfter Einstellung für die Lüftung von Mäusen ausgezeichnet. </li><li> Führen Blutgasanalyse zur normalen Gasaustausch (Sauerstoff-Partialdruck, paO 2 von 115 ± 15 mmHg und Partialdruck von Kohlendioxid, paCO 2 von 38 ± 6 mmHg) nach 4 bis 6 Stunden Ablüftzeit mit dem i-STAT bestätigen System (Abbott, USA). </li><li> Überwachen der Herzfrequenz mit einem EKG (zB Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland). Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz nicht unter 450 sinken. Wenn die Maus entwickelt bradicardia überprüfen Sie die Temperatur und die Narkose-Dosis / Konzentration. Xylacin / Ketamin Anästhesie induziert eine herz von 250 / min und wird daher nicht empfohlen. </li><li> Tragen Sie eine geeignete Flüssigkeit ersetzt werden. Eine Infusion mit Kochsalzlösung 0,1 ml / Stunde über einen arteriellen und venösen Katheter vor dem Einsetzen der Ischämie durchgeführt werden soll. Auch könnte eine Kochsalzlösung Bolus von 500 ul gegeben ip vor der Operation sein. Thorakotomie kann zu einer Senkung des Blutdrucks und kann zusätzliche Kochsalzlösung boli erfordern. Nach Ischämie, könnte eine Infusionsrate von bis zu 1 ml / h notwendig sein, einen mittleren arteriellen Blutdruck über 60 mmHg zu halten und eine ausreichende Reperfusion entscheidend für Infarkt Färbung mit TTC garantieren. </li><li> Legen Sie eine Halsschlagader (PE10, Tip OD (mm / &quot;), Tapered&gt; 0,024 mm/.011&quot;) für die kontinuierliche Aufzeichnung des Blutdrucks. Die Halsschlagader wird über stumpfe Präparation der paratracheal Muskeln ausgesetzt werden. Nach weiteren Exposition und sorgfältiger Vermeidung jeglicher Traumatisierung des Gewebes (insbesondere des Nervus vagus), wird ein Katheter in das Gefäß mit zwei Nähten und einer kleinen Klemme gesteckt. Befestigen Sie den Arm an den Körper, bevor Sie sezieren die Arterie zu starten. Dies legt ein längeres Stück der Arterie. Knot ganz am Ende des proximalen Teils der Halsschlagader. Bringen Sie eine größere Klammer an das Ende des Fadens zuerhalten Spannung. Stellen Sie ein weiteres Naht um die Arterie und sezieren die Arterie, die sehr distalen Ende. Hier legen einer kleinen Klemme. Verwenden Sie Mikro-Schere, eine kleine diagonale Öffnung in der Arterie geschnitten. Halten Sie die Öffnung mit einer feinen Pinzette (Dumont, WPI) und vorher die richtige Größe Katheter mit den Händen / Pinzette. Machen Sie einen Knoten mit dem zweiten Faden und sichern die Arterie. Lösen Sie die Klemme und vorab den Katheter weiter. Sichern Sie den Katheter mit mehreren Knoten und Band. </li></ol> 2. Technik der Okklusion <ol><li> Präparieren Sie die Haut und setzen den linken Thoraxwand mit einem stumpfen Dissektionstechnik. </li><li> Schneiden Sie die Muskeln Brustmuskeln Majors und Jugendlichen in der Thoraxwand mit einem Brenneisen aussetzen. Durch Ziehen des Pectoralis major, fällt die Lunge, wodurch eine Zange aus dem HF-Gerät kann eingesetzt werden, und, 1-3 mm oberhalb der Lunge, eine horizontale Linie über den Rippen koaguliert werden sollte. </li><li> Durch die Verwendung einer stumpfen Schere, schneiden Sie die Thoraxwand. Geändert Sicherheitsnadeln, wo der Fang Platte entfernt und ist das stumpfe Ende gebogen ist, werden dann zu halten, den Brustkorb zu öffnen. </li><li> Zur Erleichterung der endgültigen Platzierung der Naht, gerinnen und schneiden Sie die Thoraxwand entlang der Membran in Richtung der unteren linken Seite des Brustkorbs. </li><li> Expose das Herz durch Sezieren des Perikards. Um zu vermeiden, Zwerchfell-Bewegungen und den Abbau des Nervus phrenicus. </li><li> Mit einem kleinen nassen Wattestäbchen mit einer Zange und drehen Sie das Herz auf der rechten Seite. Identifizieren Sie die linke Koronararterie (LCA) und stellen Sie sicher, dass die Lungen nicht zu aufgeblasen. Optimieren Sie die Öffnung des Thorax, um einen sicheren Halt des Herzens haben bei der Platzierung der Naht. Wenn der Blutdruck zu niedrig ist die Identifizierung könnte kompliziert werden. Zusätzliche Boli von Kochsalzlösung verbessern könnte Identifizierung der LCA. Die LCA ist eine leuchtend rote Schiff überquert das Herz horizontal (im Gegensatz zu den wiederkehrenden Venen). Manchmal ist die LCA am besten ohne ein Mikroskop gesehen. Verwenden Sie nicht zu viel Licht. Dies kann zu Reflexionen machen Visualisierung unmöglich zu trennen. </li><li> Sobald das LCA visuell identifiziert wird, statt einer 8,0 Nylonfaden (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) um die LCA. Für die Zwecke der intermittierenden LCA Okklusion, haben wir eine chronische Modell der Kardiomyopathie 42 unter Verwendung einer hängenden Gewichts-System. </li><li> Thema der Naht durch ein kleines Stück Plastik (PE-10-Schlauch) mit stumpfen Kanten und befestigen Sie zwei kleine Gewichte (1g, z. B. die Verwendung Eppendorf-Röhrchen mit Wasser gefüllt) an jedem Ende. Mit dem frei hängenden Gewichte über eine Stange, sollte der LCA sofort verschlossen werden. Darüber hinaus, wenn das Gewicht entlastet wird, ist LCA Okklusion auf einmal beendet. Erfolgreiche LCA Okklusion sollte durch eine sofortige Farbänderung des Schiffes von hellrot bis dunkel violett, Veränderung der Farbe des Herzmuskels durch das Schiff (von hellrot bis weiß) und das Vorhandensein von ST-Erhebungen im EKG geliefert bestätigt werden. Während der Reperfusion, die Änderungen der Farbe sofort verschwinden. Halten Sie das Herz nass mit einem 37 ° C, Kochsalzlösung getränkt, ein Stück Watte in (siehe auch Abbildung 1). </li><li> Wählen Sie Ihre Ischämiezeit nach Ihrem primären Interesse. In der Tat, für Studien über kardioprotektive Wirkung von IP, wäre es ideal, eine Ischämie zu Zeit mit einem in Infarktgrößen von ca. 30 bis 40% der AAR verbundenen verwenden. So wäre es möglich, Änderungen in beide Richtungen, z. B. kleinere Infarktgrößen mit Herz-IP oder größer Infarktgrößen mit einem experimentellen therapeutischen oder ein bestimmtes Gen Löschung zu demonstrieren. Darüber hinaus Mäuse mit einer Infarktgröße von weniger als 50% in der Regel überleben den Versuch, während Infarkt Größen von 60 bis 80% häufig nicht überlebt haben und die Tiere sterben, bevor der Reperfusion Zeit abgeschlossen ist. Mit unserem Modell 10 Minuten einer Myokardischämie durch 2 Stunden Reperfusion führen zu einer Infarktgröße von 3,5 ± 1,3%, gefolgt von der AAR. Im Gegensatz dazu eine Ischämie von 60 Minuten ergibt eine mittlere Infarktgröße von 42 ± 5,2% der AAR (p &lt;0,01) 39. So betrachten wir eine 60 Minuten der Ischämie als ideal, um Änderungen in beide Richtungen zu studieren. Dennoch müssen Sie eventuell die Ischämiezeit in Gen gezielt Mäuse einrichtet mit einem sever Phänotyp. </li><li> Wählen Sie die richtige Reperfusion Zeit. Die Reperfusion Zeit ist von entscheidender Bedeutung für die TTC-Färbung. Die farblosen Farbstoff ist ein Backstein-rot gefärbten Niederschlag durch Dehydrogenasen in der Gegenwart des Co-Enzym NADH reduziert. Absterbenden Zellen verlieren ihre Fähigkeit, NADH und sind daher als blasse Bereiche innerhalb der rot gefärbten vitales Myokard abgegrenzt bleiben. Infarktgröße Abgrenzung von TTC setzt voraus, dass NADH wurde vollständig von den nekrotischen Bereich gewaschen. Allerdings, wenn Reperfusion nicht lang genug ist, kann die Infarktgröße Abgrenzung von TTC-Färbung in einer Unterschätzung der tatsächlichen Infarktgröße 43 Resultat. In unseren Händen, nach einer Ischämiezeit von 60 min, die Infarktgröße Messung von 11,5 ± 4,5% gestiegen nach 30 Minuten auf 42,2 ± 5,1%nach 120 Minuten. Kein weiterer Anstieg der Infarktgröße konnte mit mehr Reperfusion Zeiten (240 Minuten) 39 nachgewiesen werden. So haben wir eine 2-stündige Reperfusion Zeitraum, scheint auch im Rahmen der kardialen Enzyme determination.If man bedenkt, Ischämie Vorkonditionierung angemessenen empfehlen, empfehlen wir 4 Zyklen von IP (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion), gefolgt von einer Ischämiezeit von 60 min und einer Reperfusion von 2 Stunden. Unter diesen Bedingungen war IP mit einem 3,2-fachen Reduktion der Infarktgröße von 42,2 ± 5,1% auf 13,3 ± 3,3% der AAR 39 zugeordnet. Aufgrund der hängenden Gewichts-System könnten verschiedene Vorkonditionierung Regimenter leicht angewendet werden. </li></ol> 3. Bestimmung der Fläche At Risk (AAR) und Myokardinfarkt Größe Nach der Induktion eines Myokardinfarktes (mit oder ohne IP), ist der Bereich von der LCA (gefährdete Gebiet, AAR) und die Größe des Infarktes selbst bestimmt mit einer Maltechnik wird durchblutet. Anschließend wird Infarkt dann als Prozentsatz des Myokardinfarkts im Vergleich zu den AAR berechnet werden. Um dies zu tun, ist eine zuvor beschriebene Doppel-Maltechnik mit blauen und Triphenyltetrazoliumchlorid Evans (TTC) 44 verwendet. <ol><li> Bestimmen Sie die AAR durch retrograde Injektion von 1% blauen Farbstoff Evans in die Aorta während der LCA ist verschlossen. Alternativ, wenn ein Katheter in carotis Ort ist, verwenden Sie diese Route für Evans-Blau-Injektion. Evans-Blau färbt alle Herzmuskelgewebe blau, mit Ausnahme der AAR. Es ist entscheidend für diesen Schritt, um Luftblasen im Katheter zu vermeiden, wie sie in das Herz-Kreislauf injiziert würde und verhindern, dass Evans-Blau-Färbung. Vor der Evans-Blau-Färbung möchten Sie vielleicht Blut für Herz-Enzym-Messungen zu sammeln. Darüber hinaus ist die Entfernung von Blut durch die Injektion von 5 ml Kochsalzlösung über einen Aorten-oder carotis Katheter empfohlen. </li><li> Excise Herzen und waschen in eiskaltem 0,9% iger Kochsalzlösung </li><li> Embed in 2% Agarose. Verwenden Sie kein heißes Agarose seit dieser erfolgreichen Färbung verhindern. </li><li> Nach 30 Minuten bei +4 ° C (oder 15 Minuten -20 ° C), schneiden das Herz in Scheiben von 1 mm unter Verwendung einer Herz-Matrix oder Mikrotom. Wenn Sie das Herz in den Gefrierschrank Platz zu vermeiden trocken Einfrieren, die nicht gefärbt Herzen führen wird. </li><li> Inkubieren Sie die Schnitte mit 1% TTC bei 37 ° C für 10 min mit einer 15 ml blaue Kappe in einem Wasserbad. Dies ermöglicht dem Infarktareal als eine weiße Fläche abgegrenzt werden, während lebensfähiges Gewebe Flecken rot. </li><li> Fixieren Sie die bunten Scheiben mit 10% fomaldehyde über Nacht. Dadurch ist die Infarktareal besser kontrastiert die Verbesserung der Qualität der Bilder. </li><li> Die Fläche at-Risk (AAR) und der Infarktgröße mittels Planimetrie mit der NIH-Software-Image 1,0 45. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Infarktareal aus dem Bereich gefährdet. </li></ol> 4. Cardiac Enzyme Measurement Aufgrund von Einschränkungen mit TTC-Färbung verbunden, empfehlen wir als zusätzliche Anzeige für Herzinfarkt Schwere der Bestimmung von kardialem Troponin I (cTnI) im Serum von Mäusen. Das Blut wird aus der Pfortader und Serum cTnI Werte erhalten werden dann mit einer schnellen quantitative cTnI-Assay (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA) bestimmt. 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2526/2526fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (A) Modell der kardialen IP mit einem hängenden Gewicht System der koronaren Okklusion. Diese Technik erfordert nicht einen Knoten für Koronarokklusion. (B, C) Chirurgische Setup. (D) Bild von einer Maus Herz mit der linken Koronararterie (LCA, Pfeile) nach Okklusion. Visuelle Überprüfung der LCA ist notwendig für die Ligation und ischämische Präkonditionierung in Mäusen. Der 8,0 Nylonfaden ist rund um die LCA 1-2 mm unterhalb der linken Ohrmuschel platziert. Die Naht wird durch einen kleinen Plastikschlauch (*) eingefädelt. Das Ende jeder Naht mit einem kleinen Gewicht (1g) angebracht ist und die Naht wird über Stangen auf beiden Seiten platziert. (E) Bestimmung der AAR nach LCA Okklusion und retrograde Injektion von blauem Farbstoff Evans in die Aorta. Die AAR ungefärbt bleibt, während der Rest des Herzmuskels ist blau. Nach der Inkubation von AAR Gewebe mit TTC, das Infarktareal gebeizt weiß, während lebensfähiges Gewebe rot gefärbt.

Die vorliegende Studie beschreibt eine neue Technik, bei der IP in einer intakten Mausmodell mit einem hängenden Gewicht und damit die Vermeidung einer koronaren Okklusion durch einen Knoten. In der Tat zeigt diese Studie sehr gut reproduzierbare Infarktgrößen und Herz-Schutz von IP und minimiert so die Variabilität mit Knoten-basierte Koronarokklusion Modelle verbunden. Die Ermittler, die ein Studium Kardioprotektion von IP in Mäusen überlegen können von diesem Modell profitieren.

<table><tbody><tr><td>Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td>V.P.L. 9372</td><td>4mg/mL in saline</td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17779 Fluka</td><td>1.5 % in PBS</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td>10g in 1 L PBS</td></tr><tr><td>Insyte 22 G</td><td>BD Biosciences</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Suture, silk 4.0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>Suture, Prolene 8.0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>M8739</td><td>reusable</td></tr><tr><td>Heart Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td># HSMS001</td><td></td></tr><tr><td>Siemens 900 C</td><td>DRE Veterinary</td><td># 336</td><td>refurbished</td></tr><tr><td>dissecting microscope (SZX10 )</td><td>Olympus Corporation</td><td>n/a</td><td>consider generous working distance</td></tr><tr><td>Heating Table</td><td>Rt, Effenberger, Germany</td><td>n/a</td><td>only and single provider</td></tr><tr><td>Blood pressure device</td><td>Cyber Sense, Inc</td><td>BPM02</td><td></td></tr><tr><td>I STAT</td><td>Abbott Laboratories</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

use of a hanging weight system for coronary artery occlusion in mice

Murine Studien zur akuten Verletzungen sind ein Gebiet intensiver Untersuchung, als Knockout-Mäusen für verschiedene Gene immer sind zunehmend 1-38. Kardioprotektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) ist ein Gebiet intensiver Untersuchungen. Zur weiteren Aufklärung der molekularen Basis, ist der Einsatz von Knockout-Maus-Studien besonders wichtig, 7, 14, 30, 39. Trotz der Tatsache, dass frühere Studien haben bereits erfolgreich kardialen Ischämie und Reperfusion in Mäusen durchgeführt, ist dieses Modell technisch sehr anspruchsvoll. Insbesondere ist die visuelle Identifizierung der Koronararterie, die Platzierung der Naht um das Schiff und koronaren Okklusion durch Abbinden des Gefäßes mit einem unterstützten Knoten technisch schwierig. Darüber hinaus fügt Neueröffnung der Knoten für den intermittierenden Reperfusion der Koronararterien bei IP ohne chirurgischen Traumas zusätzliche Herausforderung. Darüber hinaus kann, wenn der Knoten nicht nach unten stark genug ist, unbeabsichtigte Reperfusion durch mangelhafte Verschluss der Koronararterien gebunden Einfluss auf die Ergebnisse. In der Tat kann dies leicht durch die Bewegung des schlagenden Herzens auftreten. Basierend auf mögliche Probleme bei der Verwendung einer verknoteten koronaren Verschluss-System verbunden sind, haben wir einen zuvor veröffentlichten Modell der chronischen Kardiomyopathie auf ein hängendes Gewicht für intermittierende Okklusion während IP 39 zu. In der Tat kann der Okklusion somit ohne die koronare durch einen Knoten verschließen erreicht werden. Darüber hinaus kann der Reperfusion des Schiffes leicht durch die Unterstützung der hängenden Gewichte, die in einem abgelegenen Lokalisierung von Herzgewebe erreicht werden. Wir testeten dieses System systematisch, einschließlich Variation der Ischämie und Reperfusion Zeiten Vorkonditionierung Regimenter, die Körpertemperatur und genetischen Hintergründen 39. Neben Färbung Infarkt, testeten wir Troponin I (cTnI) als Marker für Myokardinfarkt in diesem Modell. In der Tat, die Plasmaspiegel von cTnI mit Infarktgrößen (R2 = 0,8) korreliert. Schließlich konnten wir in mehreren Studien zeigen, dass diese Technik sehr gut reproduzierbare Infarktgrößen Ausbeuten bei murine IP und Myokardinfarkt 6, 8, 30, 40, 41. Daher kann diese Technik hilfreich sein für Forscher, die molekularen Mechanismen in Kardioprotektion von IP mit einem genetischen Ansatz in Mäusen mit gezielter Gendeletion beteiligt zu verfolgen. Weitere Studien über Herz-IP mit Hilfe transgener Mäuse können dieses Verfahren.

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice at JoVE.com

Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Ein Mausmodell für Myokardischämie und ischämische Präkonditionierung ist ein wichtiges Instrument Studie kardioprotektive Mechanismen<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier berichten wir über eine einfach anwendbare<em&gt; In situ</em&gt; Modell für kardiale IP mit einem hängenden Gewicht für Okklusion.

Die Verwendung eines Hanging Weight System für Okklusion in Mäuse

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

use-of-a-hanging-weight-system-for-coronary-artery-occlusion-in-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

21.6K Aufrufe.  University of Colorado Denver. Ein Mausmodell für Myokardischämie und ischämische Präkonditionierung ist ein wichtiges Instrument Studie kardioprotektive Mechanismen In vivo. Hier berichten wir über eine einfach anwendbare In situ Modell für kardiale IP mit einem hängenden Gewicht für Okklusion.

Serie: Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

Die Verwendung eines Hanging-weight-System für Isolated Nierenarterie Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Forschung

Medizin

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and can result in liver failure which has a high mortality rate1-2. Therefore murine studies of hepatic ischemia have become an important field of research by providing the opportunity to utilize pharmacological and genetic studies3-9. Specifically, conditional mice with tissue specific deletion of a gene (cre, flox system) provide insights into the role of proteins in particular tissues10-13 . Because of the technical difficulty associated with manually clamping the portal triad in mice, we performed a systematic evaluation using a hanging-weight system for portal triad occlusion which has been previously described3. By using a hanging-weight system we place a suture around the left branch of the portal triad without causing any damage to the hepatic lobes, since also the finest clamps available can cause hepatic tissue damage because of the close location of liver tissue to the vessels. Furthermore, the right branch of the hepatic triad is still perfused thus no intestinal congestion occurs with this technique as blood flow to the right hepatic lobes is preserved. Furthermore, the portal triad is only manipulated once throughout the entire surgical procedure. As a result, procedures like pre-conditioning, with short times of ischemia and reperfusion, can be easily performed. Systematic evaluation of this model by performing different ischemia and reperfusion times revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase serum levels3,9. Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion. Thus, this technique might be useful for other investigators interested in liver ischemia studies in mice. Therefore the video clip provides a detailed step-by-step description of this technique.

We established a novel murine model of a hanging weight system for portal triad occlusion. This technique may be useful for future investigations of ischemia in murine hepatic models.

Die Verwendung eines Hanging-Gewicht-System für Leberischämie in Mäuse

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Geändert Technik für Coronary Artery Ligation in Mäuse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

Ein Maus-Closed-Brust-Modell von Myokardischämie und Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Minimal Invasive Quer Aortakonstriktion bei Mäusen

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Induktion von Myokardinfarkt und myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In order to explore the pathophysiological changes after myocardial infarction and design future treatments, research models of MI are required. Permanent ligation of the left coronary artery (LCA) in mice is a popular model to investigate cardiac function and ventricular remodeling post MI. Here we describe a less invasive, reliable, and reproducible surgical murine MI model by permanent ligation of the LCA. Our surgical model comprises of an easily reversible general anesthesia, endotracheal intubation that does not require a tracheotomy, and a thoracotomy. Electrocardiography and troponin measurement should be performed to ensure MI. Echocardiography at day 28 after MI will discern heart function and heart failure parameters. The degree of cardiac fibrosis can be evaluated by Masson's trichrome staining and cardiac MRI. This MI model is useful for studying the pathophysiological and immunological alterations after MI.

Presented here is a surgical procedure for permanent ligation of the left coronary artery in mice. This model can be used to investigate the pathophysiology and associated inflammatory response after myocardial infarction.

Linke Koronararterienligatur: Ein chirurgisches Mausmodell des Myokardinfarkts

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...