Die Autoren möchten die unschätzbare Hilfe zu bestätigen: Dr. Neal First und Kourtney Wilkinson für Manuskript-Bearbeitung; Dr. Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford und Mike Basett für die Unterstützung bei Ausbildung und Pflege der Tiere an der MSU ALAC akkreditierten Maus-Anlage, Dr. Dwayne Wise für seine Unterstützung bei der Mikroskopie und Bilderfassung; Cesar Monroy, Hannah Swoope und Bobbie Huddleston für ihre Unterstützung mit Video-Produktion an der MSU. Diese Arbeit wurde vom Office of Institutional Research und dem Department of Biological Sciences an der Mississippi State University gefördert.

Teil 1: Schwangere Maus Laparotomie <ol><li> Mit Genickbruch, euthanize eine schwangere C57BL6J weiblichen Maus bei 10,5-11,5 dpc. </li><li> Reinigen Sie den Bauch mit antimikrobieller Seife, und dann rasieren sie. </li><li> Nach der Rasur, waschen den Bauch mit einer Kochsalzlösung. </li><li> Dann trocknen die Bauchhöhle mit einer sterilen Gaze. </li><li> Decken Sie die Maus mit einem neuen sterilen Bereich. </li><li> Machen Sie eine ventrale Inzision mit einer Pinzette und Schere Dissektion. </li><li> Und entfernen Sie die gesamte Gebärmutter aus der Bauchhöhle. Maus-Embryonen wird sichtbar in der Gebärmutter. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale mit D-PBS gefüllt, und bewahren Sie sie auf Eis. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell und Pinzette, entfernen Sie die Plazenta und zusätzliche embryonale Gewebe eines jeden Embryos. </li><li> Transfer-Embryonen in eine frische Petrischale mit D-PBS gefüllt. </li><li> Messen Sie die Länge der Maus-Embryonen. Wir fanden, dass die Größen nach dem Embryo das Alter unterschieden. Beispielsweise 8,5 DPC bei einem Durchschnitt von 6 mm gemessen, gemessen 10,5 dpc bei einem Durchschnitt von 11mm und 12,5 dpc bei einem Durchschnitt von 16 mm gemessen. </li><li> Dann entfernen Sie ihre Schwänze zur DNA-Extraktion. </li></ol> Teil 2: Gonadenmissbildungen Ridge Dissection Unter Stereomikroskop und Lichtquelle Schott Fostec <ol><li> Legen Sie ein Filterpapier in einer Petrischale. Legen Sie dann die Maus-Embryo auf dem Filterpapier in den Embryo trocken und unbeweglich für die Präparation. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell, einen Schnitt quer durch die Maus-Embryo über den Ursprung der Nabelschnur. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, mit einer sterilen feinen Pinzette und einer sterilen feinen Hänseleien Nadel, entfernen Sie den Darm und Leber, so dass die Harnwege sichtbar ist. Die Nieren sind seitlich in der Bauchhöhle befindet, und die Blase befindet sich medial und kaudal im Vergleich zu den Nieren. Der Embryo kann als männlich identifiziert werden, da die Gonaden Rippen auf beiden Seiten der Blase befinden. In der weiblichen, sind die Gonaden Grate fest an der Schwanzflosse seitlichen Ende der Nieren angebracht. </li><li> Schälen Sie die Gonaden Grat aus, indem Sie eine Nadel dahinter. Die Gonaden Grat ist durch Wegschneiden der Gewebe, die es unterstützen entfernt. </li><li> Übertragen Sie die Gonaden Grate, um eine neue Petrischale mit frischem D-PBS gefüllt. Mikroskopisch, sollte die männlichen Keimdrüsen Grat werden abgestreift, groß und oval. Im Gegensatz dazu die weiblichen Keimdrüsen Grat gesichtet werden sollte, haben längliche Form und kleiner im Vergleich zu den männlichen Keimdrüsen Kamm. </li></ol> Teil 3: Gonadenmissbildungen Ridge Verdauung Unter Stereomikroskop: <ol><li> Mesonephros Dissection: Trennen Sie die Gonade aus dem Mesonephros und Rücken mit einem feinen und spitzen Nadel. <ul><li> Es ist wichtig, die Urniere aus der Gonaden Grat zu entfernen, weil es sich um eine somatische Gewebe, das in der PGC Ableitung Prozess überwuchern Wille ist. </li></ul></li><li> Gonaden Ridge Verdauung: Collect sauber Gonaden Bergrücken in einer 0.5ul Tropfen frischen D-PBS. 20 ml Collagenase / Dispase-Lösung (Endkonzentration an 1mg/ml). <ul><li> Embryonen sollten einzeln bearbeitet werden. Jeder Embryo sollte über eine eigene getrennte und beschriftet Petrischale. </li></ul></li><li> Gonaden Ridge Mincing: Schneiden Sie die Gonaden Grat in kleine Stücke mit einer sterilen Nadel und sterilen feinen Pinzette Nr. 4. </li><li> Inkubation: Petrischalen werden in einen Inkubator bei 37 übertragen ° C für 15 Minuten. <ul><li> Die Inkubationszeit kann zwischen Geweben variieren. </li></ul></li><li> Pipettieren: Nach 15 Minuten kann das Gewebe werden durch Pipettieren dissoziiert. Mit gezapftes Kapillarpipetten mit Durchmessern zwischen 40 -100 mm Break up die Stücke durch Auf-und Abpipettieren. Dies bildet kleine Klumpen. Übertragen Sie die Klumpen zu 0,5 ml einer vorher erwärmt D-PBS Drop für eine endgültige waschen. </li><li> Nach dem Waschen, übertragen Sie die Klumpen auf Eppendorf-Röhrchen. <ul><li> Nicht zu entlarven das Gewebe Kollagenase. </li><li> Machen Sie nicht einen einzigen Zellsuspension. Dies ist für die Kolonie-Bildung wichtig. Wenn es eine einzige Zellsuspension wird, neigen PGCs zu differenzieren und zu migrieren. </li><li> Dieser Vorgang sollte nicht länger als 20 Minuten, oder Ihre Zellen Lebensfähigkeit verlieren. </li></ul></li><li> Zentrifugation bei 2000 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand und das Pellet in 0,5 ml ergänzt knock out Medien (bei 37 ° C vorgewärmt). </li></ol> Teil 4: Primordial Keimzellen Kultur &quot;Sie sollten die nächsten Schritte rasch durchzuführen, um die Lebensfähigkeit der PGCs für die Isolierung und die Ableitung zu erhalten. <ol><li> 24 Stunden vor diesem Prozess sollten Sie bereiten mitotisch inaktivierten MEF-CF1 Feeder-Schicht nach dem Protokoll von Zhang J. et al 2008. <ul><li> Es werden 20 Gerichte für eine pregnant weiblichen Maus (6-8 Embryonen). </li><li> MEFs verlieren die Fähigkeit, eine Feeder-Schicht werden (Förderung von Wachstum und Differenzierung zu verhindern) nach 5-6 Passagen. </li><li> Verwenden Sie keine MEFs älter als 48 Stunden. </li></ul></li><li> Unmittelbar vor dem Ausplattieren PGCs, muss der MEF Medium langsam aus dem MEF Feeder-Schicht entfernt werden. </li><li> Dann fügen Sie 0,5 ml / well vorgewärmtes ergänzt Knockout Mediums auf die MEF Feeder-Schicht. <ul><li> MEF Medium enthält Rinderfötenserum dass eine Differenzierung der PGCs induziert. </li><li> Knockout Medium muss mit specie spezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt werden unmittelbar vor Gebrauch, um die Aktivität der wachsen-Faktor sorgen. </li></ul></li><li> Mit symmetrische Verteilung, Platte PGCs über die MEF Feeder-Schicht. <ul><li> Wenn diese Stücke zu nahe sind, neigen sie zu aggregieren und bilden dichte Kolonien, die schlecht anbringen oder beginnen differenzieren. </li><li> Kulturschalen muss mit embryonalen Germinal Zelllinie Namen, Durchgang Nummer und Datum beschriftet werden. </li></ul></li><li> Vorsichtig, überweisen Sie den Kulturschalen in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Überwachen Sie die Zellen alle 24 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden zu entfernen 250 ml von Medien aus der Spitze der Kultur nicht zu stören der Kolonie Anhang. Dann fügen Sie 250 ml frischem ergänzt Knock-out-Medien (bei 37 ° C vorgewärmt). </li><li> Nach Schritt 7, warten weitere 48 Stunden, und dann vollständig zu entfernen alle Medien und ersetzen Sie es mit frischen ergänzt Knock-out-Medien (bei 37 ° C vorgewärmt). Tun Sie dies alle 2 Tage für 8-10 Tage, bis PGC Kolonien zu bilden. </li></ol> Teil 5: Embryonale Keimzellen <ol><li> Nach 10 Tagen PGC Isolation, sind embryonale Keimzelle Kolonien gebildet. </li><li> Embryonale Keimzelle Linien sind am Leben gehalten durch manuelle Passagen alle 8-10 Tage. Sie fahren fort, eine undifferenzierte Morphologie präsentieren und ausdrücken Pluripotenz Marker wie alkalyne Phosphatase, Oct-4, SSEA-1 und SOX-2 </li></ol> Hinweise <ul><li> Sterile / aseptischen Bedingungen sind unerlässlich in der Kultur Raum. </li><li> Für die Ableitung und Kultur, sind PGCs in einem Luftreiniger Class II Bio Sicherheit Kabinett verarbeitet. </li><li> Inkubationen werden in einem befeuchteten 37 ° C und 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Alle Medien und Reagenzien sind vor in einer 0,2 um Filter, Lagerung bei 4 ° C verwenden, filtriert und bei 37 vorgewärmten ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Während der Dissektion Schritte müssen alle Embryonen und Gewebe auf Eis gehalten werden. </li><li> Alle Reagenzien Flaschen werden mit Ethanol, bevor sie in einem Schrank dekontaminiert. </li><li> Verwendung von Handschuhen, Kittel und Krankenschwester caps sind Pflichtfelder. </li></ul> Abschluss Wir haben ein Video, das Ihnen zeigt, wie zu isolieren, zu leiten und Kultur embryonalen Keimzellen von Gonaden Grate 10,5-11,5 dpc Maus-Embryonen zur Verfügung gestellt. Die reproduzierbare Isolierung und langfristig Kultur der embryonalen Keimzelle Linien bietet eine entscheidende Grundlage für das Studium der frühen Embryonalentwicklung, genetischen und epigenetischen germinal Muster, Gonade Bildung, Umwelt-Auswirkungen der umliegenden Organe während des Entwicklungsprozesses der Gametogenese in der männlichen und weiblichen Embryonen, und Bestimmung der Wege, die zu Krebs und Unfruchtbarkeit führt. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Abbildung 1" />

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	<li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).</li><li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells.">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li><li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+12:+Mouse+Primordial+Germ+Cells:+isolation+and+in+vitro+culture.">Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture.</a> Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).</li><li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis.">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li><li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification.">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li><li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+MEFs+to+Matrigel+I:+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs.">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li></ol>

An der Mississippi State University: Diese Arbeit wurde nach Überprüfung und Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Genehmigung unserer Maus-Protokoll # 08030 (Holding und Zucht-Protokoll Die Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies-ROS in der Keimbahn Entwicklung und Tumorbildung) durchgeführt.

Zange Nr. 14 und 15, Skalpell 35 mm, Dissektion Scheren, chirurgischen Bereichen, antimikrobielle Seife, Kochsalzlösung 0,9%, Gaze, Eis-Schaum-Behälter, Rasierklinge, Skalpell 35 mm, feinen Pinzette Nr. 4 und 5, feine Hänseleien Nadel mit Griff-, Filter-Papierbögen, und zog Glaspipetten.<br /<br /&gt; Equipment: Sezieren Stereomikroskop Lichtquelle Schott Fostec, inverse Mikroskop Mikropipette 10 und 200 &amp;mgr; l, Zentrifuge, bio Sicherheit Kabinett.

isolation and derivation of mouse embryonic germinal cells

Die Fähigkeit von embryonalen Keimzellen (EG) in primordialen Keimzellen (PGC) und später in Keimzellen während der frühen Entwicklungsstadien zu unterscheiden, ist eine perfekte Modell, um unsere Hypothese über Krebs und Unfruchtbarkeit Adresse. Dieses Protokoll zeigt, wie Ur-Keimzellen aus Entwicklungsländern Gonaden in 10,5-11,5 Tage nach coitum (DPC) Maus-Embryonen zu isolieren. Die Entwicklung der Gonaden Kämme aus Maus-Embryonen (C57BL6J) wurden durch mechanische Störungen mit Kollagenase, dann in einem Maus-Embryo-Fibroblasten-Feeder-Schicht (MEF-CF1), die zuvor mitotisch mit Mitomycin C wurde in Anwesenheit von Knockout-Medien inaktiviert und ergänzt mit Leukämie Inhibitor vernickelt dissoziiert Factor (LIF), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Stem Cell Factor (SCF). Mit diesen optimierten Methoden für PCG Identifikation, Isolierung und Etablierung der Kulturbedingungen ermöglicht langfristig Kulturen von EG-Zellen für mehr als 40 Tage. Die embryonalen Keimzelle Linien zeigten embryonalen Phänotyp und die Expression von häufig verwendeten Marker der pluripotenten Zustand. Isolation und Ableitung von Keimzellen in der Kultur ein Instrument, um ihre Entwicklung in vitro zu verstehen und bieten die Möglichkeit, kumulative Schäden an genetischen und epigenetischen zu überwachen nach der Exposition gegenüber oxidativem Stress.

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Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Die Fähigkeit von embryonalen Keimzellen in primordialen Keimzellen während der frühen Entwicklungsstadien zu unterscheiden, ist eine perfekte Modell, um unsere Hypothese über Krebs und Unfruchtbarkeit Adresse. Dieses Protokoll zeigt, wie Ur-Keimzellen aus Entwicklungsländern Gonaden in 10,5-11,5 Tage nach coitum Maus-Embryonen zu isolieren.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Aufrufe.  Mississippi State University. Die Fähigkeit von embryonalen Keimzellen in primordialen Keimzellen während der frühen Entwicklungsstadien zu unterscheiden, ist eine perfekte Modell, um unsere Hypothese über Krebs und Unfruchtbarkeit Adresse. Dieses Protokoll zeigt, wie Ur-Keimzellen aus Entwicklungsländern Gonaden in 10,5-11,5 Tage nach coitum Maus-Embryonen zu isolieren.

Serie: Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation and cell fate specification using aggregates of mouse embryonic stem cells (mESCs) in suspension culture. Small numbers of mESCs are aggregated in basal medium for 48 hr in non-tissue-culture-treated, U-bottomed 96-well plates, after which they are competent to respond to experimental signals. Following treatment, these aggregates begin to show signs of polarized gene expression and gradually alter their morphology from a spherical mass of cells to an elongated, well organized structure in the absence of external asymmetry cues. These structures are not only able to display markers of the three germ layers, but actively display gastrulation-like movements, evidenced by a directional dislodgement of individual cells from the aggregate, which crucially occurs at one region of the elongated structure. This protocol provides a detailed method for the reproducible formation of these aggregates, their stimulation with signals such as Wnt/&#946;-Catenin activation and BMP inhibition and their analysis by single time-point or time-lapse fluorescent microscopy. In addition, we describe modifications to current whole-mount mouse embryo staining procedures for immunocytochemical analysis of specific markers within fixed aggregates. The changes in morphology, gene expression and length of the aggregates can be quantitatively measured, providing information on how signals can alter axial fates. It is envisaged that this system can be applied both to the study of early developmental events such as axial development and organization, and more broadly, the processes of self-organization and cellular decision-making. It may also provide a suitable niche for the generation of cell types present in the embryo that are unobtainable from conventional adherent culture such as spinal cord and motor neurones.

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Generation von Aggregaten von embryonalen Stammzellen der Maus, die Symmetriebrechung, Polarisation und Emergent Collective Verhalten anzeigen<em&gt; In-vitro-</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Isolierung von Zellkernen aus kardialen Vorläuferzellen der Maus mit Einzelzellauflösung

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Autor im Rampenlicht: Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Isolierung und Genotypisierung von gastrulierenden Mausembryonen für die Einzelzellsequenzierung

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor im Rampenlicht: Eine Pipeline zur Analyse linienspezifischer mutierter Embryonen mit Einzelzellauflösung

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Generation von Aggregaten von embryonalen Stammzellen der Maus, die Symmetriebrechung, Polarisation und Emergent Collective Verhalten anzeigen

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation