Dieses Verfahren folgt weitgehend der Transplantation Technik zur Höhle Fische durch das Labor von Bill Jeffrey entwickelt.

Teil 1: Vorbereitung der Embryonen In diesem Protokoll werden wir die jj xy Symbol, um eine hypothetische Zebrafisch-Mutante Linse bezeichnen. <ol><li> Zebrafisch-Stämme sind in Standard-Fisch-Anlage Bedingungen bei 28,5 C auf einem 14h light/10h Dunkel-Zyklus gehalten. </li><li> Am Abend statt Männchen und Weibchen der Zebrafisch-Stamm jj xy: AB / TU; tg (mGFP) in einem Tank mit einem Teiler, um sie voneinander zu trennen. Die Nachkommen dieser Kreuzung wird zum Ausdruck der GFP-Transgen in allen Geweben und wird als Spender verwendet werden. Parallel dazu verwenden die gleiche Prozedur, um Kreuzungen zwischen nicht-transgenen Wildtyp-Tieren. Je nach Zweck dieses Experiments kann man Tiere Wildtyp-Kreuz am jj xy locus als Spender oder Hosts. </li><li> Innerhalb einer Stunde nach dem Licht am Morgen dreht, entfernen Sie die Teiler, um die Fische zu paaren können. </li><li> Nach 15-30 Minuten sammeln Embryonen in 100 x 15 mm Petrischalen, reinigen Sie sie, und ändern Sie das Medium (Ei Wasser). </li><li> Halten Sie die Embryonen in einem 28,5 C Inkubator bis die gewünschte Zeit. </li><li> Wenn Sie bereit sind für eine Transplantation, entfernen Sie das Chorion manuell mit zwei Paaren von scharfen Zangen, und inkubieren die Embryonen in 0,2% EDTA in Calcium-freier ZFR für 30 Minuten. </li></ol> Teil 2: Herstellung von dissection Nadeln <ol><li> Die Transplantation Verfahren erfordert zwei Arten von Nadeln: eine geschärfte eine, die verwendet werden, um Gewebe um die Linse geschnitten, entfernen Sie das Chorion, und lassen Embryonen aus Agarose ist, und einer stumpfen Nadel verwendet werden, um den Spender Linse bewegen und setzen Sie es in den Host. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Nadeln zu machen. </li><li> Zuerst muss die Spitze einer Pasteurpipette abgeschnitten werden mit einer Diamant-Messer. Dann legen Sie eine Glaskapillare in den Pasteur Pipette so dass etwa die Hälfte seiner Länge in ihm ist. Dadurch wird es einfacher, die Wolfram-Draht durch Schmelzen in das Glas in den nächsten Schritt zu immobilisieren. </li><li> Dann führen Sie einen dünnen Wolframdraht in das offene Ende der Kapillare. Melt das Glas über den Draht mit einem Bunsenbrenner. Mit einer Pinzette, stabil halten das Glas Ende mit dem Metalldraht, während Drehen Sie das andere Ende der Nadel mit der Hand. Der erweichte Glas sollte spiralförmig um das Metall Greifen Sie ihn. </li><li> Wenn Sie eine stumpfe Spitze Nadel sind, dann ist dies das Ende des Verfahrens. So erstellen Sie einen geschärften Nadel, halten Sie die Wolfram-Draht über einem Bunsenbrenner für 1-1.5 Minuten, Abbrennen der Metall so eine sehr feine Spitze entsteht. Prüfen Sie die Qualität der Spitze von microscropy.It ist eine gute Idee, beide Nadeln in die Flamme ein paar Sekunden sofort sterilisieren vor der Transplantation. </li></ol> Teil 3: Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Calcium-freie Zebrafisch Ringer (ZFR) Lösungen (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7,2) </li><li> 0,2% EDTA in Calcium-freier Zebrafisch Ringer-Lösungen (pH 7,2) </li><li> 1,2% Agarose (niedrige Schmelzpunkt) in Calcium-freier ZFR </li><li> 0,2% Agarose (niedrige Schmelzpunkt) in Calcium-freier ZFR </li><li> Embryo Medium (pH 7,0, pro Liter enthält: 10 ml Hanks Solution # 1, 1 ml Hanks Solution # 2, 10ml Hanks Solution # 4, 10ml Hanks Solution # 5, 0,35 g Natriumbicarbonat, 300 uL von 2M HCl, Penicillin-Streptomycin 500.000 U) wie in der Zebrafisch-Book (University of Oregon Press, 2000). </li><li> Tungsten Draht, vergoldet, 0,1 mm Durchmesser, Alfa Aesar </li><li> Kapillarrohr, 1,0 mm Durchmesser, World Precision Instruments </li></ol> Teil 4: Transplantation Verfahren <ol><li> In einer Kunststoff-Zentrifugenröhrchen, bereiten 1,2% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in Calcium-freier ZFR vorgewärmt auf 40 C in einem Wasserbad. </li><li> Bei der gewünschten Stufe (30 hpf, zum Beispiel), nehmen die Embryonen in einer Pasteurpipette langsam zu vertreiben sie in die Zentrifugenröhrchen, und langsam zu vertreiben sie in die Zentrifugenröhrchen und Inkubation für ca. 5 Sekunden. Die Spender und Techniker sollten getrennt inkubiert werden. </li><li> Mit einer Pipette nehmen die Embryonen in 1,2% Agarose aus dem Zentrifugenröhrchen und ordnen sie in zwei parallelen Reihen in einem 100mm Polystyrol-Petrischale, halten Wirte und Spender zu trennen. Durch Pipettieren sie langsam und sorgfältig, werden die meisten Embryonen auf ihren Seiten in der Agarose liegen. Sie müssen diejenigen, die nicht in dieser Position liegen, mit der stumpfen Nadel so, dass das Auge nach oben, bevor die Agarose erstarrt neu zu orientieren. </li><li> Warten Sie auf die 1,2% Agarose zu verfestigen, und dann überlagern sie mit 0,2% niedrig schmelzenden Agarose-Lösung. </li><li> Mit dem geschärften Nadel, entfernen Sie alle Agarose um die Augen, und sehr vorsichtig schneiden Sie die Linse aus dem Host und Spender Embryonen mit kleinen Strichen. Achten Sie darauf, nur nahe genug geschnitten, um das Objektiv, es nicht zu zerreißen, aber auch so nicht zu entfernen zuviel Gewebe aus dem Rest der Host Auge. </li><li> Einmal frei, wird Linsen in das Medium schweben. Mit der stumpfen Nadel vorsichtig drücken Sie den SpenderObjektiv bis knapp über den Ort, an dem der Host-Objektiv würde normalerweise, und dann drücken Sie ihn in das Auge mit der stumpfen Nadel. Der Host-Objektiv kann verworfen werden. </li><li> Lassen Spender und Wirt Embryonen in 1,2% Agarose für 30-60 Minuten, dann lassen Sie sie von der Agarose mit der spitzen Nadel, und übertragen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit Embryo Medium. Jeder Embryo sollte einen getrennten gut. Achten Sie darauf, in die Vertiefungen richtig, so dass es klar ist, welche Host, mit dem Spender entspricht Etikett. </li><li> Inkubieren bei 28,5 C. Der Spender stammenden Linse aus dem Host-Objektiv kann auf der nicht operierten Seite des gleichen Tieres auf GFP-Fluoreszenz unterschieden werden. Die Abschnitte können auch auf die Linse Größe zu messen und festzustellen, ob es richtig differenziert werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abb.. 1 Low Vergrößerung Bild eines geschärften Nadel für Objektiv Transplantation verwendet. Eine Glaskapillare (B) wird in die Pasteurpipette (A) eingesetzt und ein dünner Wolframdraht (C) ist in das offene Ende der Kapillare eingesetzt. Das Glas über den Draht wird mit einem Bunsenbrenner aufgeweicht. Mit einer Pinzette, stabil halten das Glas Ende mit dem Metalldraht, während Drehen Sie das andere Ende des Pasteur-Pipette mit der Hand. Der erweichte Glas sollte spiralförmig um die Metall-, Greifen Sie ihn. <img src="/files/ftp_upload/1258/fig2 1258.png" alt="" width="600" height="204" /> Abb.. 2 Die Spitzen der beiden Arten von Nadeln für Objektiv Transplantation verwendet. <img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abb.. 3 Embryonen unterzog Objektiv Transplantation bei 30hpf. Gezeigt sind ein Spender Embryo (A, B), eine Vielzahl Auge mit transplantierten Linse (C, D), und der Seite der Steuerung des Host-Embryo (E, F). Jedes Auge ist in beiden Durchlicht und UV-Beleuchtung gezeigt, wie angegeben. Die Fotografien wurden bei 48 hpf genommen. Das Q01 [9] transgene Linie wurde in diesem Experiment verwendet.

<ol>
	<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration.">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289, 631-633 (2000).</li><li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+vision+in+the+zebrafish(Danio+rerio).">The development of vision in the zebrafish(Danio rerio).</a> Dev Biol. 180, 646-663 (1996).</li><li>Schmitt, E., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+morphogenesis+in+the+zebrafish.+Brachydanio+rerio.">Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio.</a> J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).</li><li>Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+forward+genetics--analysis+of+neuronal+diversity+and+patterning+in+the+zebrafish+retina.">Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina.</a> Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).</li><li>Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+to+the+analysis+of+eye+development+in+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish.</a> Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+study+neurogenesis+in+the+zebrafish+retina.">Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina.</a> Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutagenesis+yields+eye+morphological+mutants+with+retinal+and+lens+defects.">Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects.</a> Vision Res. 42, 535-540 (2002).</li><li>Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).</li></ol>

Mehrere Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit bei der Linse Transplantationen. <ol><li> Geschärft Nadeln: Es ist besser, mehrere Nadeln vor der Durchführung Objektiv Transplantation vorzubereiten, und die Spitze der Nadeln sind so dünn wie möglich. Eine dickere Nadel reißt mehr Gewebe wegen seiner größeren Durchmesser, so dass ein Ausfall in die Augen zu heilen. </li><li> Die Anordnung der Embryonen: Kurz vor der Transplantation müssen die Embryonen Position, so dass sie auf ihren Seiten liegend sind. ...

<table><tbody><tr><td>0.1mm diameter tungsten wire</td><td>A Johnson Matthey</td><td>45086</td><td></td></tr><tr><td>Agarose(low melting point)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-4</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Cardinal Health</td><td>D1906</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

lens transplantation in zebrafish and its application in the analysis of eye mutants

Das Objektiv spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Augenbecher [1,2]. Mit der Zebrafisch als Modellorganismus, können Fragen zur Linse Entwicklung angesprochen werden. Der Zebrafisch ist nützlich für genetische Studien durch mehrere vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich der kleinen Größe, hohe Fruchtbarkeit, kurzen Lebenszyklus und Pflegeleichtigkeit. Objektiv Entwicklung erfolgt rasch im Zebrafisch. Um 72 HPF, ist die Zebrafisch-Objektiv funktionell ausgereift [3]. Reichlich genetischen und molekularen Ressourcen zur Verfügung stehen, die Forschung im Zebrafisch zu unterstützen. Darüber hinaus bietet die Ähnlichkeit der Zebrafisch-Auge mit denen anderer Wirbeltiere Grundlage für seine Verwendung als ein hervorragendes Tiermodell der menschlichen Mängel [4-7]. Mehrere Zebrafisch-Mutanten weisen Objektiv Anomalien, einschließlich hohe Zelltod, der in einigen Fällen zu einer vollständigen Degeneration der Linse Gewebe [8]. Um festzustellen, ob Objektiv Anomalien aufgrund von inneren Ursachen oder fehlerhafter Interaktionen mit dem umgebenden Gewebe, ist die Transplantation einer Mutante Objektiv in einem Wildtyp-Auge durchgeführt. Mit Feuer-poliertem Metall Nadeln, mutierte oder Wildtyp-Objektive sind sorgfältig aus dem Spendertier seziert, und in die Host. Zur Unterscheidung Wildtyp und Mutante Gewebe, ist eine transgene Linie als Spender verwendet. Diese Linie drückt Membran-gebundenen GFP in allen Geweben, einschließlich der Linse. Diese Transplantation Technik ist ein wichtiges Instrument in den Studien von Zebrafisch-Mutanten-Objektiv.

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Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Objektiv Entwicklung beinhaltet Wechselwirkungen mit anderen Geweben. Mehrere Zebrafisch Auge Mutanten sind durch eine abnormal kleine Linse Größe aus. Hier zeigen wir eine Linse Transplantation experimentieren, um festzustellen, ob dieser Phänotyp durch inneren Ursachen oder defekte Interaktion mit Gewebe, die das Objektiv umgeben ist.

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

lens-transplantation-zebrafish-its-application-analysis-eye

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Aufrufe.  The Second Teaching Hospital of Jilin University. Objektiv Entwicklung beinhaltet Wechselwirkungen mit anderen Geweben. Mehrere Zebrafisch Auge Mutanten sind durch eine abnormal kleine Linse Größe aus. Hier zeigen wir eine Linse Transplantation experimentieren, um festzustellen, ob dieser Phänotyp durch inneren Ursachen oder defekte Interaktion mit Gewebe, die das Objektiv umgeben ist.

Serie: Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, eine innovative automatisierte Ansatz zur oculomotorius Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Neurowissenschaften

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Biologie

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

<meta charset="utf8"></head><body>Robuste Zebrafischzelltransplantation für die Regenerations- und Entwicklungsforschung

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Kartierung der zellulären Konnektivität im Nervensystem des Zebrafisches während der Entwicklung und Regeneration

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

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Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

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Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem