Herstellung und Analyse von Sporosarcina pasteurii Biozementziegeln unter Verwendung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Formen für uneingeschränkte Kompressionstests

Sporosarcina pasteurii ist ein ureolytisches Bakterium, das Harnstoff in Karbonat und Ammonium aufspaltet. Das Karbonat verbindet sich mit Kalzium zu Kalziumkarbonat, wodurch ein Kristallgitter entsteht, das die umgebenden Partikel miteinander verankert, um Biozement herzustellen. Dies ist ein praktisches Protokoll für die Verwendung von 3D-gedruckten Formen zur Herstellung von Biozementziegeln, die für die Druckprüfung geeignet sind.

Zement ist ein wichtiger Baustoff, der in vielen Bauwerken auf der ganzen Welt verwendet wird, von Fundamenten für Häuser bis hin zu historischen Denkmälern und Straßen. Es ist ein kritisches und weltweit reichlich vorhandenes Material. Die traditionelle Herstellung von Zement leistet jedoch einen großen Beitrag zum vom Menschen_{verursachten CO 2}, was zu Treibhausgasemissionen und Klimawandel führt. Die mikrobiell induzierte Calcitfällung (MICP) ist ein biologischer Prozess, bei dem Sporosarcina pasteurii oder andere Bakterien ein Zementmaterial herstellen, das genauso stark ist wie herkömmlicher Zement, aber Biozement ist kohlenstoffneutral. Diese MICP-Methode zur Herstellung von Biozement ist eine vielversprechende Technologie und wird derzeit von vielen Unternehmen, Ländern und Forschungsgruppen aktiv untersucht. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet kundenspezifische, wiederverwendbare, 3D-gedruckte Formen für die Durchfluss-MICP-Behandlung von Boden oder Sand und stellt zylindrische Ziegel her, die den Standardspezifikationen für uneingeschränkte Drucktests entsprechen. Die einzelnen, freistehenden Formen mit Reservoirdeckel ermöglichen eine bequeme parallele Prüfung mehrerer Variablen und Replikate. Dieses Protokoll beschreibt die S. pasteurii MICP-Reaktion und die Erstellung, Montage und Verwendung der 3D-gedruckten Formen zur Herstellung von zylindrischen Biozementziegeln.

Beton ist der wichtigste Baustoff für Bauprojekte auf der ganzen Welt ^1,2. Eine Studie ergab, dass Zement nach Wasser das am zweithäufigsten verbrauchte Material der Welt ist³. Jedes Jahr werden fast 4,1 Milliarden Tonnen Zement produziert ^4,5. Die traditionelle Herstellung, Verarbeitung und Anwendung von Zement verursacht jährlich fast 8 % der weltweiten CO₂ -Emissionen⁶. Aufgrund der hohen Nachfrage und der dennoch schädlichen Auswirkungen der traditionellen Zementherstellung hat ein neuartiges kohlenstoffneutrales Verfahren zur Zementierung oberste Priorität für die globalen Nachhaltigkeitsziele 7,8,9,10.

Biozementierung ist der Prozess der Verwendung von Mikroorganismen zur Herstellung eines Zementes, Klebstoffs oder einer Substanz, die zur Herstellung einer festen Oberfläche oder Struktur verwendet werden kann ^1,11. Der am besten definierte Biozementierungsprozess beinhaltet die Verwendung von ureolytischen Bakterien zur Ausfällung von Calciumcarbonat, wodurch Partikel zu einem gehärteten Zementmaterial miteinander verbunden^{werden 12,13}.

Wenn eine umweltfreundliche Alternative zu herkömmlichem Zement in Betracht gezogen wird, muss die Alternative auch die Festigkeitserwartungen für Zement erfüllen. Der uneingeschränkte Druckversuch ist eine analytische Messung, die zur Bestimmung der Scherfestigkeit eines Gesteins, eines Baustoffs oder einer Bodenprobe¹⁴ verwendet wird. Für eine effektive Scherprüfung muss die Probe gemäß den Industriestandards vorbereitet werden, zu denen ein Durchmesser-zu-Höhe-Verhältnis von 1:2 und eine zylindrische Form¹⁵ gehören. Eine maßgeschneiderte 3D-gedruckte Form wurde entwickelt, um diese Standards zu erfüllen und die Effizienz bei der Ausführung eines MICP-Protokolls zu steigern. Diese kundenspezifischen Formen ermöglichen die Durchflussanwendung und Drainage von sequentiellen MICP-Behandlungen. Die Bakterienkultur und die Zementierungslösung können einfach auf das obere Reservoir aufgetragen werden, das dann durch die Form läuft und durch eine mit Netz ausgekleidete Öffnung am Boden der Form verläuft. Die Formen sind so konzipiert, dass sie auf einem Becherglas oder einem anderen Abfallsammelbehälter ruhen. Die Form wird vertikal in zwei Hälften geteilt, um ein einfaches Entformen des zementierten Ziegels zu ermöglichen. Es wird von acht Magneten zusammengehalten, die am Rahmen der Form befestigt und mit Epoxidharz versiegelt sind, um eine Beschädigung der Magnete durch den Kontakt mit den MICP-Lösungen zu verhindern. Die beiden Hälften enthalten auch eine eingelassene Nut zum Platzieren einer Gummidichtung, die dazu beiträgt, die Form abzudichten und ein Auslaufen zu verhindern. Auf der Innenseite der zylindrischen Form befindet sich eine Rille, um den Füllstand für Sand/Erde anzuzeigen, um einen Ziegel mit einer Höhe von 3 Zoll herzustellen; Der Raum über dieser Nut soll als Reservoir für das Auftragen von Aufbereitungslösungen genutzt werden. Ein Stück Drahtgeflecht, das über die untere Öffnung an der Innenseite der Form gelegt wird, verhindert, dass der Sand oder die Erde durch den Boden der Form herausfällt. Zusätzlich wird ein Stück Drahtgeflecht auf den Sand oder die Erde gelegt, um die gleichmäßige Verteilung der aufgetragenen Lösungen zu unterstützen und sicherzustellen, dass der geformte Ziegel eine gleichmäßige Oberseite ohne scharfe Rillen hat, die die Ergebnisse des uneingeschränkten Drucktests beeinträchtigen könnten.

Die Formen wurden mit Hilfe einer CAD-Software (Computer Aided Design) konstruiert, und aus der CAD-Datei (Zusatzdatei 3 und Zusatzdatei 4) wurde eine STL-Datei (Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) generiert. Diese STL-Datei wurde in das 3D-Druckerprogramm hochgeladen und anschließend gedruckt. Nachdem die Formen gedruckt waren, wurde ein Wasserstrahlsystem verwendet, um das aus dem 3D-Drucker erzeugte Stützmaterial zu entfernen, so dass die endgültige 3D-gedruckte Struktur übrig blieb. Die Datei für den Druck einer Stopfvorrichtung, die bei der Verdichtung des Sandes/Bodens in der Form und der Schaffung einer ebenen Oberfläche helfen soll, ist ebenfalls enthalten.

Die Details zu den verwendeten Reagenzien, Geräten und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Lösungen und Medien

1. Gehirn-Herz-Infusion (BHI) - Harnstoffmedium (1 L)
   1. 37 g BHI-Pulver mit einer Waage abwiegen und in einen 1-Liter-Kolben oder ein Becherglas geben.
   2. Wiegen Sie 20 g Harnstoff mit einer Waage ab und geben Sie ihn in denselben 1-Liter-Kolben oder Becher, der BHI-Pulver enthält.
      ACHTUNG: Materialien mit Harnstoff nicht autoklavieren oder Bleichmittel hinzufügen. Harnstoff zerfällt in Ammoniak, das als verflüchtigtes Gas schädlich sein kann und mit Bleiche zu giftigem Senfgas reagieren kann. Entsorgen Sie alle Abfälle als Sondermüll gemäß den Sicherheitsprotokollen der Institution.
   3. Der 1-Liter-Kolben oder das Becherglas mit BHI-Pulver und Harnstoff ist mit 1 l H₂O zu füllen.
   4. Mischen und filtrieren: Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,45-μM-Filter in einen autoklavierten Kolben oder ein Becherglas.
2. Zementierungslösung (1 L)
   1. 20 g Harnstoff mit einer Waage abwiegen und in einen 1-Liter-Kolben oder ein Becherglas geben.
   2. 10 g NH₄Cl (Ammoniumchlorid) werden mit einer Waage gewogen und in denselben 1-Liter-Kolben oder Becher mit Harnstoff gegeben.
      ACHTUNG: Materialien, die Ammoniumchlorid enthalten, nicht autoklavieren oder Bleichmittel hinzufügen. Ammoniumchlorid bildet ein Gleichgewicht mit Ammoniakgas, das als verflüchtigtes Gas schädlich sein kann und mit Bleiche zu giftigem Senfgas reagieren kann. Entsorgen Sie alle Abfälle als Sondermüll gemäß den Sicherheitsprotokollen Ihrer Einrichtung.
   3. 49 g CaCl_{4,2H 2}O (Calciumchlorid) werden mit einer Waage gewogen und in denselben 1-Liter-Kolben oder Becher mit Harnstoff und Ammoniumchlorid gegeben.
   4. Der 1-Liter-Kolben oder das Becherglas, das Harnstoff, Ammoniumchlorid und Calciumchlorid enthält, ist mit 1 l H₂O zu füllen.
      HINWEIS: Diese Lösung ist nicht sterilisiert; Frisch zubereiten und innerhalb von 48 h verbrauchen.
3. Ziegeldruck und -vorbereitung (einige Tage vor der MICP-Behandlung durchgeführt)
   1. Laden Sie die STL-Datei für die Ziegelform (Ergänzungsdatei 1) und das Stopfgerät (Ergänzungsdatei 2) in das entsprechende Programm für den 3D-Drucker.
      HINWEIS: Das speziell verwendete Programm kann bei Verwendung eines anderen 3D-Druckers unterschiedlich sein. Verwenden Sie das entsprechende Programm für den Drucker, den Sie verwenden.
   2. Drucken Sie die Formen und Stopfvorrichtungen (Abbildung 1).
   3. Verarbeiten Sie die Formen gemäß den Anforderungen des Druckers.
   4. Platzieren Sie jeweils einen Magneten in den entsprechenden Magnetschlitzen in der Form und achten Sie darauf, dass die Ladungen so angeordnet sind, dass sich die beiden Hälften der Form anziehen und nicht abstoßen
   5. Sobald die Magnete richtig platziert sind, versiegeln Sie jeden Magneten mit Epoxidharz.
   6. Wählen Sie zwei Kreise aus Drahtgeflecht mit einem Durchmesser von 1,5 Zoll aus und legen Sie sie beiseite.

2. Vorbereitung der Ziegel (Tag 0)

HINWEIS: Die Details zur Vorbereitung eines Ziegels finden Sie hier.

1. Der Filter sterilisiert 150 mL BHI-Harnstoff-Medium. Autoklavieren Sie einen 250-ml-Kolben.
2. Bereiten Sie 250 ml Zementationslösung vor; Legen Sie es nicht in den autoklavierten 250-ml-Kolben.
3. S. pasteurii isolierte Streifenkultur auf einer Petrischale mit BHI-Harnstoff-Agar zubereiten und bei 30° C für 24-48 h inkubieren (S. pasteurii aus gefrorenem Glycerin-Fond).
4. Starterkultur von S. pasteurii (Tag 1)
   1. Stellen Sie eine 1,6-ml-Starterkultur her, indem Sie 1,6 ml BHI-Harnstoffmedium in ein Kulturröhrchen geben.
   2. Beimpfen Sie die Kultur mit 1 Kolonie von der Tag-0-Streifenplatte.
   3. Lassen Sie die Starterkultur über Nacht in einem Shaker (150 U/min) bei 30 °C wachsen.
5. Kulturelles Wachstum (Tag 2)
   1. Untersuchen Sie die Starterkultur, um das Wachstum zu bestätigen (erkennbar an erhöhter Trübung).
   2. 40 ml BHI-Harnstoffmedium in den 250 ml-Autoklavkolben geben. Die 1,6 ml Starterkultur wird in den Kolben gegeben. Inkubieren und 7 h bei 30 °C schütteln.
   3. Geben Sie zusätzlich 40 ml BHI-Harnstoffmedium in den Kolben. Stellen Sie den Kolben über Nacht (~16 h) bei 20°C in einen Shaker.
6. Ziegelbehandlung mit S. pasteurii (Tag 3)
   1. Geben Sie weitere 40 ml BHI-Harnstoffmedium in den Übernachtkulturkolben und inkubieren Sie die S. pasteurii bei 20 °C weiter.
7. Bereiten Sie die Ziegelformen vor (Tag 3) (siehe Abbildung 2).
   1. Platzieren Sie Gummidichtungen an den entsprechenden Stellen an den Formen. Verbinden Sie die beiden Hälften der Formen und stellen Sie sicher, dass die Dichtungen abgedichtet sind und alle Magnete verbunden sind.
   2. Füge einen Kreis aus feinem Drahtgeflecht am Boden der zylindrischen Ziegelform hinzu, um zu verhindern, dass Sand durch das Loch in der Form fällt.
   3. Füllen Sie die Form mit Sand oder anderem Material bis zur Linie an der Innenseite der Form und stampfen Sie sie fest.
   4. Lege einen weiteren Kreis aus Drahtgeflecht auf die Oberseite des Sandes, um die gesamte Oberfläche zu bedecken, und stampfe erneut.
   5. Stellen Sie die Form auf einen Abfallbehälter, um den Durchfluss aufzufangen.
8. Ablauf der Behandlung (Tag 3)
   1. Gießen Sie 40 ml S. pasteurii-Kultur auf den Sand und lassen Sie sie einziehen. Warten Sie 45 Minuten.
   2. Gießen Sie 80 ml Befestigungslösung auf den Sand. Warten Sie 30 Minuten.
   3. Gießen Sie 40 ml S. pasteurii-Kultur auf den Sand. Warten Sie 30 Minuten.
   4. Gießen Sie 80 ml Befestigungslösung auf den Sand. Warten Sie 30 Minuten.
   5. Gießen Sie 40 ml S. pasteurii-Kultur auf den Sand. Warten Sie 30 Minuten.
   6. Gießen Sie 80 ml Befestigungslösung auf den Sand. Lassen Sie den Ziegel mindestens 48 h lang in Ruhe oder bis der Sand trocken erscheint.
9. Überprüfen Sie das Endprodukt (Tag 5).
   1. Öffnen Sie die Formen vorsichtig, indem Sie die Form in zwei Hälften teilen und den Druck von den Magneten lösen. Entferne den Ziegel vorsichtig aus der Form.
      HINWEIS: Wenn der Sand nass erscheint, muss die Form noch ein oder zwei Tage trocknen, bevor der Stein aus der Form genommen wird (je trockener der Stein ist, desto einfacher ist er zu entfernen).
   2. Legen Sie den Ziegel auf ein Papiertuch, um ihn 3 Wochen lang weiter zu trocknen, bevor Sie einen Drucktest durchführen.
10. Reinigung von Formen (Tag 5)
    1. Sobald der Ziegel aus der Form genommen wurde, trenne die Dichtungen und das Drahtgeflecht von jeder Hälfte der Form.
    2. Weichen Sie das Drahtgeflecht 24 Stunden lang in einer Lösung aus 70 % Ethanol ein, bevor Sie es mit Wasser spülen. Möglicherweise ist ein leichtes Schrubben erforderlich, um das Netz zu reinigen.
    3. Spülen Sie die Formen mit 70% Ethanol ab und schrubben Sie sie mindestens 3 Mal mit einer Bürste mit weichen Borsten, einem Schwamm oder einem anderen Reinigungsgerät. Dann mit Wasser und Seife reinigen und anschließend an der Luft trocknen
    4. Spülen Sie die Dichtungen mit 70 % Ethanol und reinigen Sie sie dann mit Wasser und Seife, gefolgt von Lufttrocknung.

3. Druckprüfung (Tag 25)

1. Analysieren Sie alle Steine auf ihre Festigkeit mit einem uneingeschränkten Drucktest¹⁶.
   1. Achte darauf, dass die runden Enden des Ziegels flach und gleichmäßig sind. Wenn die Enden nicht gleichmäßig sind, verwenden Sie eine Feile oder ein anderes Gerät, um die Oberflächen auszugleichen.
      HINWEIS: Die Enden des Ziegels sollten größtenteils flach sein, wenn das Drahtgeflecht korrekt angebracht wurde. Es ist wichtig, dass die Enden des Ziegels so gleichmäßig wie möglich sind, um eine genaue Messung der Festigkeit zu gewährleisten.
2. Legen Sie einen Ziegel in eine Plastiktüte mit Reißverschluss oder versiegelt und positionieren Sie den Stein so in der Plastiktüte, dass die flachen Flächen des Ziegels nicht von einer Naht verdeckt werden, um eine glatte, flache Abdeckung zu erzielen.
3. Lege den Stein auf die untere Ladeplatte. Legen Sie eine flache und ebene Ladeplatte auf den Ziegel.
4. Üben Sie über die uneingeschränkte Kompressionsprüfmaschine etwa 1 Pfund Druck auf den Stein aus.
5. Tarieren Sie die Digitalanzeige.
6. Kontinuierlich die zunehmende Last gemäß den Maschinenspezifikationen aufbringen, bis ein vollständiges strukturelles Versagen des Ziegels erreicht ist.
7. Notieren Sie die maximale Traglast für jeden Stein. Führen Sie die gewünschte statistische Analyse durch, um die Ergebnisse auszuwerten.

Der Aufbau der 3D-gedruckten Form ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu sehen. Positive Ergebnisse sollten als ein Ziegel angesehen werden, der seine Form behält, wenn er aus der Form genommen wird, und nach 3-wöchiger Trocknung als solide Struktur erscheint, die leicht und mit minimalem Materialverlust durch Berührung gehandhabt werden kann. Wenn der Ziegel nicht fest ist und zerbröckelt oder erheblicher Materialverlust dur...

Kritische Schritte
Dieses Biozementierungsprotokoll verwendet S. pasteurii MICP zur Herstellung von biozementierten zylindrischen Steinen, die für uneingeschränkte Druckprüfungen geeignet sind. Einer der kritischsten Faktoren für die uneingeschränkte Druckprüfung ist die Form und Struktur der Probe. Stellen Sie sicher, dass die Ober- und Unterseite des Zylinderprodukts flach sind und die Höhe des Ziegels so nah wie möglich an 3 Zoll liegt. Es ist bess...

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Dieses Manuskript wurde zur Veröffentlichung freigegeben. PA-Nummer: USAFA-DF-2024-777. Die in diesem Papier geäußerten Ansichten sind die der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Position oder Politik der US-Regierung, des Verteidigungsministeriums oder des Ministeriums der Luftwaffe.

Dieses Material basiert auf Forschungsarbeiten, die von der United States Air Force Academy und dem Air Force Research Lab unter der Vertragsnummer FA7000-24-2-0005 (MG) gesponsert wurden. Die US-Regierung ist berechtigt, Nachdrucke für staatliche Zwecke zu vervielfältigen und zu verteilen, ungeachtet etwaiger Copyright-Vermerke darauf.