Präklinische Bewertung von Koronararterien-Stents

Neue Designs und Materialien für Koronararterien-Stents müssen vor dem klinischen Einsatz in relevanten präklinischen Modellen getestet werden. Hier beschreiben wir ein atherosklerotisches Kaninchen-Aorta-Modell und ein Schweine-Koronararterien-Modell für die Stent-Forschung mit in vivo und histologischen Analysen.

Die koronare Herzkrankheit trägt wesentlich zur Morbidität und Mortalität weltweit bei. Während Änderungen des Lebensstils und Medikamente die Eckpfeiler der Behandlung sind, werden Ballonangioplastie und Stenting der Koronararterien routinemäßig bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom und chronischer koronarer Herzkrankheit durchgeführt, die bei optischer medizinischer Behandlung symptomatisch bleiben. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Generationen von koronaren Stents entwickelt. Die Ballonangioplastie und das Stenting werden durch die Verwendung von pharmazeutischen Wirkstoffen unterstützt, die auf Ballons und die Stentoberfläche aufgetragen werden, entweder um die heilenden Eigenschaften der Arterie nach dem Eingriff zu verbessern oder um die Bildung von Restenose zu verhindern. Neue Produkte müssen rigoros auf Sicherheit und Wirksamkeit getestet werden, bevor sie in die klinische Praxis aufgenommen werden können. Daher besteht weiterhin ein Bedarf an zuverlässigen und reproduzierbaren präklinischen Methoden der Stent-Bewertung. Wir beschreiben hier ein Modell der Koronararterien des Schweins sowie ein atherosklerotisches Kaninchenmodell für die Stentforschung an Koronararterien und beschreiben grundlegende Schritte in der intravaskulären Bildgebung und Stenthistologie.

Die atherosklerotische koronare Herzkrankheit stellt eine erhebliche Belastung für die Gesundheitssysteme von Ländern auf der ganzen Welt dar¹. Eine Ballonangioplastie und ein Stenting der Koronararterien werden routinemäßig bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom sowie bei symptomatischen Patienten mit stabiler koronarer Herzkrankheit^{durchgeführt 2}. Die Ballonangioplastie war eine revolutionäre Erfindung zur Revaskularisierung verengter oder sogar verschlossener Koronararterien. Koronararterien-Stents verbesserten die Ergebnisse der perkutanen Koronarinterventionen (PCIs) weiter, indem sie einen akuten Rückstoß der Arterie nach einer Ballonangioplastie verhinderten³. Die Ergebnisse der PCIs wurden durch die Einführung von medikamentenfreisetzenden Stents (DESs) oder mit antiproliferativen Medikamenten beschichteten Stents zur Bekämpfung der In-Stent-Restenose (ISR) – der erneuten Verengung eines zuvor eingesetzten Stents – weiter verbessert. DESs wurden weiterentwickelt, um dünnere, aber haltbarere Stentstreben und biologisch abbaubare Polymere für die Wirkstofffreisetzung zu haben. Konzeptionell wird die starre Plattform des Stents nur für wenige Wochen bis Monate benötigt, um einen Rückstoß der Arterie zu verhindern. Dies hat zu einer neuen Generation von Gerüstgeräten geführt, die vollständig biologisch abbaubar sind. Früh biologisch abbaubare Stents und Gerüste haben einige Rückschläge erlitten, da Studien über eine erhöhte Inzidenz von Stentthrombosen^{berichtet haben 4}. Dies hat zur Folge, dass biologisch abbaubare Stents nicht weit verbreitet sind.

Allein in den Vereinigten Staaten werden jährlich fast eine Million PCIs durchgeführt. Die Entwicklung neuer Stentmaterialien und -designs wird weitergehen, da immer mehr Patienten intravaskulär behandelt werden. Die Evaluierung neuer Produkte erfordert Tests in einer biologisch relevanten Umgebung, was die Verwendung eines geeigneten Tiermodells erfordert. Präklinische Tiermodelle sind bei der Untersuchung biologisch abbaubarer Geräte noch wichtiger, da die Abbaueigenschaften dieser Geräte möglicherweise unvorhersehbar sind. Die Evaluierung sollte in Großtiermodellen durchgeführt werden, in denen Produkte untersucht werden können, die groß genug sind, um für den Patientengebrauch bestimmt zu sein.

Wir beschreiben hier ein Modell der Koronararterie des Schweins und ein atherosklerotisches Kaninchen-Aortenmodell für die präklinische Stent-Bewertung ^5,6. Beide Modelle können Geräte und Ausrüstungen aufnehmen, die für den klinischen Einsatz konzipiert sind. Wir stellen in vivo Bildgebungsmodalitäten zur Beurteilung der Stentleistung, der Stentthrombose und der ISR vor. Darüber hinaus zeigen wir Methoden zur histologischen Analyse von plastisch eingebetteten Geweben, einschließlich der Immunhistologie⁷.

Alle Tierversuche wurden von der Tierversuchskammer in Finnland genehmigt. Erwachsene 3,0-4,0 kg schwere neuseeländische weiße (NZW) Kaninchen wurden für das atherosklerotische Kaninchenmodell verwendet. Für die Koronarstudie am Schwein wogen die Tiere zu Beginn des Versuchs 30-40 kg. Das Protokoll für das atherosklerotische Kaninchenmodell und das Modell der Koronararterien des Schweins wird getrennt beschrieben, gefolgt von der Beschreibung, wie die Histologie für nicht abbaubare Koronarstents durchgeführt werden kann, unabhängig vom verwendeten In-vivo-Modell .

1. Atherosklerotisches Kaninchenmodell

HINWEIS: Um schnelle atherosklerotische Veränderungen in der Aorta zu induzieren, werden die Tiere mit einer cholesterinreichen Diät gefüttert, und die Aorten werden vor der Stentimplantation einer Entendothelisierung unterzogen. Stents und Bildgebung werden durch die Halsschlagadern durchgeführt, und die Stents werden für die Histologie wie unten beschrieben aufbereitet. Der intravaskuläre Ultraschall (IVUS) ist bei der Aorta des Kaninchens besser geeignet als die optische Kohärenztomographie (OCT), da keine arterielle Spülung erforderlich ist.

1. Diät mit hohem Cholesterinspiegel (Abbildung 1)
   1. Wandeln Sie das normale Kaninchenfutter in ein cholesterinreiches Futter um, indem Sie Cholesterin hinzufügen. Cholesterin mit einem Teil Ethanol und einem Teil Diethylether (250 g Cholesterin auf 2 l 96 % EtOH und 2 l Diethylether) auf einem Magnetrührer in einem großen Becherglas mischen.
   2. Wenn sich das Cholesterin aufgelöst hat, gießen Sie die Mischung über 25 kg Kaninchenfutter in ein großes Becken in einer Haube. Mischen Sie das Futter 3-4 Tage lang mehrmals täglich, bis die Mischung getrocknet ist.
   3. Dadurch entsteht ein Futter mit 1 % Cholesterin. Um 0,025 % Cholesterinfutter herzustellen, wird das 1 % Cholesterinfutter im Verhältnis 1:40 in normales Kaninchenfutter gemischt.
2. Ballon-Denudation der Kaninchen-Aorta
   1. Mischen Sie Aspirin in das Kaninchentrinkwasser, beginnend 3 Tage vor der Denudationsverletzung und fahren Sie bis zum Ende des Versuchs fort (100 mg Aspirin auf 1 l Trinkwasser). Wasser wird ad libitum angeboten.
   2. Betäuben Sie die Kaninchen mit 0,3 mg/kg Medetomidin und 20 mg/kg Ketamin subkutan (s.c.). Entfernen Sie das Fell aus dem Leistenbereich und dem inneren Oberschenkelbereich des rechten Hinterbeins mit einer Pflegeschere und sterilisieren Sie die Haut mit einem Desinfektionsmittel auf Ethanolbasis.
   3. Verabreichen Sie ein perioperatives prophylaktisches Antibiotikum (125 mg Cefuroxim s.c.).
   4. Tragen Sie vor Hautschnitten ein Lokalanästhetikum mit 10 mg/ml Lidocain s.c. entlang des inneren Oberschenkelbereichs entlang der Rille auf, die die Hauptblutgefäße und Nerven im Femurbereich hält.
   5. Machen Sie einen Hautschnitt und dringen Sie mit einer Operationsschere und einer Präparierschere vorsichtig durch das Unterhautgewebe und die Beinmuskulatur vor.
   6. Legen Sie die Oberschenkelarterie frei und trennen Sie sie vom umgebenden Gewebe sowie von der Vene und dem Nerv.
   7. Führen Sie eine 5-0 nicht resorbierbare chirurgische Naht zweimal unter der Arterie in der proximalen Oberschenkelarterie durch. Heben Sie die Arterie vorsichtig mit der Nahtlinie an (es wird keine Ligatur gemacht, sondern die chirurgische Naht wird mit einem Paar Nadeltreibern oder einer Mückenzange gehalten). Diese Leitung wird verwendet, um den Blutfluss in die Oberschenkelarterie vorübergehend zu stoppen.
   8. Führen Sie eine nicht resorbierbare 5-0-Nahtlinie zweimal unter dem distalen Teil der Oberschenkelarterie durch und binden Sie eine Ligatur fest, um die distale Oberschenkelarterie zu verschließen (z. B. mit einem Miller-Knoten).
   9. Machen Sie mit einer mikrochirurgischen Schere oder einem feinen Skalpell einen kleinen 1-2 mm großen Schnitt oder Arteriotomie in die Arterie, während die Arterie von einem Assistenten von den proximalen und distalen Operationslinien gestützt und an Ort und Stelle gehalten wird.
   10. Führen Sie einen Fogarty 3F-Embolektomie-Ballonkatheter in die Arterie ein, die proximal in Richtung der Beckenarterie verläuft. Bereiten Sie vor dem Einführen den Embolektomiekatheter vor, indem Sie ihn an eine 1-ml-Spritze anschließen, die mit 0,6 mL Luft gefüllt ist (Kochsalzlösung kann auch verwendet werden, aber ein luftgefüllter Ballon ist nachgiebiger). Die proximale chirurgische Leitung wird abgesenkt, um die Passage des Embolektomiekatheters zu ermöglichen.
       HINWEIS: Für den Eingriff wird ein Fogarty-Embolektomiekatheter ohne Führungsdrahtlumen verwendet.
   11. Führen Sie den Embolektomie-Katheter 30 cm in die Arterie ein (wie anhand der Markierungen auf dem Katheterschaft zu beurteilen). Blasen Sie mit der Spritze auf und ziehen Sie den aufgeblasenen Katheter, bis er mindestens die Beckengabelung erreicht, wo an diesem Punkt ein Widerstand am Katheter zu spüren ist.
   12. Lassen Sie die Luft aus dem Embolektomiekatheter und führen Sie ihn wieder in die Aorta ein. Wiederholen Sie den Rückzug insgesamt dreimal.
   13. Nachdem die Denudation abgeschlossen ist, ziehen Sie den Embolektomiekatheter zurück und verschließen Sie die Oberschenkelarterie mit der proximalen Nahtlinie. Die Oberschenkelarterie wird somit nach dem Eingriff verschlossen. Aufgrund der guten Kollateralzirkulation in der Hintergliedmaße des Kaninchens gibt es jedoch selten gesundheitliche Bedenken im Zusammenhang mit Ischämie.
   14. Lizieren Sie den Muskel, der die Oberschenkelarterie mit 4-0 resorbierbaren Nähten bedeckt, und die Haut mit einer intrakutanen Naht mit einer 4-0 resorbierbaren Nahtlinie.
   15. Die Tiere werden überwacht, bis sie wach und wachsam sind und trinken oder füttern. Erleichtern Sie die Genesung von Kaninchen durch die Verwendung einer beheizten Kammer mit Zugang zu Wasser und Heu.
   16. Verabreichen Sie Carprofen nach chirurgischen Eingriffen für 1-3 Tage oder länger, falls erforderlich (2 mg/kg s.c., einmal täglich) zur Analgesie.
3. Stenting der Aorta des Kaninchens
   1. Beginnen Sie Clopidogrel am Tag des Stents mit einer Aufsättigungsdosis von 30 mg und fahren Sie bis zum Ende des Versuchs mit 15 mg täglich fort. Gemahlene Clopidogrel-Tabletten in einem Mörser, in Leitungswasser mischen (5 ml Wasser für eine 75 mg Clopidogrel-Tablette; die Aufsättigungsdosis beträgt 2 ml, gefolgt von 1 ml täglich) und über eine Magensonde verabreichen.
      HINWEIS: Clopidogrel löst sich nicht vollständig in Leitungswasser auf; Machen Sie täglich eine frische Dosis, bevor Sie die Kaninchen medikamentös behandeln. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass den Kaninchen nach der Denudationsverletzung täglich Aspirin verabreicht wird.
   2. Betäuben Sie die Kaninchen mit 0,3 mg/kg Medetomidin und 20 mg/kg Ketamin s.c.
   3. Verabreichen Sie ein perioperatives prophylaktisches Antibiotikum (125 mg Cefuroxim s.c.).
   4. Entfernen Sie die Haare an der vorderen Seite des Halses mit einer Rasierschere und sterilisieren Sie die Haut mit einem Desinfektionsmittel auf Ethanolbasis.
   5. Tragen Sie Lidocain als Lokalanästhetikum entlang der Mittellinie des Halses (3-5 ml) auf und machen Sie einen Längsschnitt von 4-5 cm durch die Haut.
   6. Öffnen Sie das Platysma, indem Sie mit einer Präparierschere in Längsrichtung schneiden. Koagulieren Sie kleine blutende Arteriolen durch Zusammendrücken mit einer chirurgischen Pinzette oder durch Koagulation mit einem unipolaren oder bipolaren Gerinnungsgerät.
   7. In den Muskeln des Halses ist eine natürliche Rille zu erkennen, zwischen der sich die Halsschlagader zusammen mit dem Vagusnerv befindet (zwischen dem Musculus sternomastoideus und dem Musculus sternohyoideus) (Abbildung 2A). Präparieren Sie die Arterie vorsichtig und trennen Sie sie von anderen Geweben. Die rechte Halsschlagader wird bevorzugt, da sie einen direkteren Zugang zur absteigenden Aorta bietet.
   8. Führen Sie zweimal eine 5-0 nicht resorbierbare Nahtlinie unter dem distalen Teil der Halsschlagader durch und ligieren Sie die Arterie sicher. Halten Sie die Operationslinie hoch, um den distalen Teil der Halsschlagader anzuheben.
   9. Führen Sie einen nicht resorbierbaren 5-0-Operationsschlauch zweimal unter dem proximalen Teil der Halsschlagader hindurch. Ohne eine Ligatur anzulegen, heben Sie die Halsschlagader mit der proximalen chirurgischen Leitung an, um den Blutfluss zur Halsschlagader im Operationsbereich vorübergehend zu blockieren.
   10. Machen Sie mit einer mikrochirurgischen Schere eine kleine Arteriotomie von 1-2 mm in die Halsschlagader zwischen den Operationslinien.
   11. Führen Sie eine vollständig vorbereitete 5F- oder 6F-Einführschleuse in proximale Richtung ein.
       1. Spülen Sie die Schleuse mit Kochsalzlösung, führen Sie den Dilatator in die Schleuse ein und spülen Sie vor dem Einführen der Schleuse in die Arterie. Um das Vorschieben der Schleuse zu erleichtern, führen Sie zusätzlich einen kurzen Führungsdraht durch den Dilatator, um eine konische Spitze für die Schleuse zu erhalten.
       2. Sobald sich die Spitze der Schleuse (oder besser gesagt der Dilatator) in der Halsschlagader befindet, senken Sie die proximale chirurgische Linie, damit die Schleuse in die Arterie gelangen kann.
   12. Schieben Sie die Schleuse 2-3 cm in die Halsschlagader vor.
   13. Entfernen Sie den Obturator und den Draht aus der Einführschleuse.
   14. Bestätigen Sie die Platzierung der Schleuse in der Arterie, indem Sie die Schleuse öffnen und eine kleine Menge (1-2 ml) Blut aus der Schleuse lassen.
   15. Spülen Sie die Schleuse mit heparinisierter Kochsalzlösung (5000 I.E. pro 1000 ml, 0,9 % NaCl) und nähen Sie sie, um sie in den OP-Abdecktüchern oder der Haut des Kaninchens zu befestigen. Heparinisieren Sie das Kaninchen, indem Sie unfraktioniertes Heparin durch die Scheide (150 I.E./kg) verabreichen.
   16. Bringen Sie das Tier auf den Kathetertisch, wenn die Operation nicht auf dem Tisch des Katheterlabors durchgeführt wurde.
   17. Schieben Sie einen dünnen Koronarführungsdraht (0,014 Zoll) über die Einführschleuse vor und führen Sie ihn unter Durchleuchtung in die absteigende Aorta. Schieben Sie einen 5F-Führungskatheter über den Führungsdraht.
       HINWEIS: Ein Führungskatheter mit einer Biegung kann verwendet werden, wenn man Schwierigkeiten hat, von der Halsschlagader in die absteigende Aorta zu navigieren.
   18. Wenn ein Führungskatheter mit einer abgewinkelten Spitze für den Zugang zur absteigenden Aorta verwendet wurde, tauschen Sie ihn gegen einen geraden Führungskatheter über dem Führungsdraht aus, um Stents oder bildgebende Katheter zu verabreichen.
   19. Es wird ein angiographisches Bild der Bauchschlagader durch Kontrastmittelinjektion durch den Führungskatheter mit einem jodhaltigen Kontrastmittel (250-350 mgI/ml) aufgenommen.
   20. Wählen Sie einen geeigneten Abschnitt zwischen den Lendenarterien in der infrarenalen Aorta für den Einsatz des Stents. Setzen Sie den Stent im Verhältnis 1,1:1 (der Stent ist zur Arterie hin leicht überdimensioniert, um zu verhindern, dass sich der Stent beim Zurückziehen des Ballonkatheters bewegt) mit Hilfe eines Indeflators gemäß den Anweisungen des Stentherstellers in die Aorta ein (für alle Stents, die auf Ballonkathetern montiert sind, wird eine Größentabelle mit dem Stent geliefert). Lassen Sie die Luft aus dem Ballon und ziehen Sie den Stentkatheter heraus (Abbildung 2B).
   21. Führen Sie eine erneute Angiographie mit dem Kontrastmittel durch, um die Platzierung des Stents zu bestätigen.
   22. Entfernen Sie die Einführschleuse nach dem Stenting und der Bildgebung. Verschließen Sie die Arterie mit der proximalen Nahtlinie in der Halsschlagader. Dadurch wird die Halsschlagader vollständig verschlossen.
   23. Verschließen Sie die Muskelschichten des Halses (in der Regel zwei Nahtschichten) mit resorbierbaren Nähten 4-0 und die Haut mit resorbierbaren intrakutanen Nähten 4-0.
   24. Überwachen Sie die Genesung des Tieres und verabreichen Sie Analgetika, wie in der Ballon-Denudationsoperation (Schritte 1.2.15-1.2.16) beschrieben.
4. Bildgebung der Aorta von Kaninchen mit IVUS
   1. Verschaffen Sie sich einen Gefäßzugang und positionieren Sie einen geraden Führungskatheter in die absteigende Aorta, wie für die Stentoperation für die Kaninchen-Aorta beschrieben.
      HINWEIS: Die Bildgebung wird zum Zeitpunkt des Stents über denselben Gefäßzugang durchgeführt. Ein zweiter Bildgebungszeitpunkt kann unter Verwendung der linken Halsschlagader erstellt werden.
   2. Schieben Sie den bildgebenden Katheter über einen Führungsdraht in die distale Aorta über das Stent-Segment hinaus (oder an der Stelle, an der der Stent platziert wird, wenn eine Prä-Stent-Bildgebung durchgeführt wird).
   3. Führen Sie einen Pullback entweder manuell durch, während die IVUS-Daten aufgezeichnet werden, oder starten Sie den automatischen Pullback (siehe Anleitung für das IVUS-System). Während des Rückzugs bewegt sich die Bildgebungseinheit automatisch über den Zielbereich, wenn dies durch das Bildgebungssystem aktiviert ist, oder manuell, indem der Bildgebungskatheter während der Aufzeichnung der Bildgebungsdaten über den interessierenden Bereich (den Stent) gezogen wird.
   4. Speichern Sie die Bildgebungsdaten und entfernen Sie den Bildgebungskatheter, den Führungsdraht und den Führungskatheter.
   5. Entfernen Sie die Schleuse und verschließen Sie die Operationswunde, wie für das Stent-Verfahren beschrieben (Schritt 1.3).
   6. Überwachen Sie die Erholung des Tieres wie zuvor beschrieben. Verabreichen Sie Analgetika wie zuvor beschrieben (Schritte 1.2.15-1.2.16).
5. Gewebeperfusion und -fixation (Kaninchenmodell)
   1. Opfern Sie die Tiere unter Ketamin-Medetomidin-Anästhesie mit einer intravenösen Injektion von 20-30 ml gesättigtem Magnesiumsulfat (MgSO₄).
   2. Perfusion mit Kochsalzlösung oder, wenn Proben nur für die Histologie mit einem 1%igen Paraformaldehyd-Gemisch entnommen werden, mit einer speziellen Pumpe.
   3. Perfusionieren Sie die Kaninchen-Aorta, indem Sie das Perfusionssystem über eine Nadel oder Kanüle direkt in die absteigende Aorta oberhalb der Nierenarterie einführen oder indem Sie die Nadel durch den linken Ventrikel des Herzens in die Aorta einführen (wodurch das ganze Tier durchblutet wird).
   4. Legen Sie eine Klemme über die Aorta, wo sich die Spitze der Nadel oder Kanüle befindet, um sie während des Perfusionsvorgangs in der Aorta zu befestigen.
   5. Perfundieren Sie mit 1000 mL (aus der absteigenden Aorta) oder 1500 mL (von der aufsteigenden Aorta durch den linken Ventrikel) mit Kochsalzlösung oder 1% PFA.
   6. Entnehmen Sie das Stent-Segment der Aorta, indem Sie vorsichtig vom umgebenden Gewebe disparieren.
      HINWEIS: Erwägen Sie, proximale und distale Segmente der Aorta für die Histologie zu sammeln. Sammeln Sie auch alle notwendigen Sicherheitstücher.
   7. Das entnommene Gewebe, das für die histologische Analyse bestimmt ist, wird 4 h lang bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd gelegt.
   8. Zur weiteren Lagerung 24 h lang auf 50 % EtOH bei 4 °C und dann 70 % EtOH bei 4 °C übertragen, bis es für die Histologie vorbereitet ist.

2. Modell der Koronararterien des Schweins

HINWEIS: Das Schweineherz ähnelt anatomisch und physiologisch dem menschlichen Herzen. Die Koronararterien sind ebenfalls ähnlich - sie verlaufen epikardial und bilden drei Hauptkoronararste (die rechte Koronararterien (RCA) und die linke Koronararterien (LCA), die sich weiter in die linke aufsteigende Koronararterien (LAD) und die linke Zirkumflexarterie (LCX)) aufteilen). Hier ist ein Modell mit Stents, das an nativen Koronararterien von Schweinen durchgeführt wurde, und intravaskulärer Bildgebung, die mit OCT durchgeführt wurde. Schweine werden vor der Anästhesie über Nacht nüchtern.

1. Anästhesie und Gefäßzugang für koronare Stents und Bildgebung von Schweinen
   1. Sedatieren Sie die Tiere mit Azaperon (8 mg/kg intramuskulär (i.m.)) und Atropin (0,05 mg/kg i.m.) und leiten Sie die Anästhesie mit intravenösem Propofol (15 mg/kg/h) und Fentanyl (10 μg/kg/h) ein und setzen Sie diese fort. Intubieren Sie die Tiere und halten Sie sie während des gesamten Eingriffs an einem Beatmungsgerät.
   2. Der Gefäßzugang wird über die rechte Oberschenkelarterie erworben. Lokalisieren Sie die Oberschenkelarterie mit Hilfe eines Ultraschallwandlers (die Arterie kann durch die arterielle Pulsation und durch Kompression mit dem Schallkopf von der Vene unterschieden werden).
   3. Unter Ultraschallkontrolle wird eine angiographische Nadel in die Oberschenkelarterie vorgeschoben.
   4. Sobald sich die Arterie in der Arterie befindet, kommt ein starker pulsierender Blutfluss durch die Nadel. Schieben Sie einen Führungsdraht in die Arterie vor und entfernen Sie die Nadel.
   5. Schieben Sie einen zusammengebauten und gespülten Einführhebel geeigneter Größe (typischerweise 5F oder 6F) über den Draht in die Arterie ein.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass der Draht immer sichtbar ist, damit er nicht in der Arterie verloren geht.
   6. Entfernen Sie den Dilatator und den Draht aus der Einführschleuse.
   7. Spülen Sie die Hülle mit heparinisierter Kochsalzlösung (5 I.E./ml).
   8. Verabreichen Sie 1 mg/kg Enoxaparin i.v., sobald der Gefäßzugang erreicht ist.
   9. Verabreichen Sie bei jedem invasiven Eingriff ein prophylaktisches Antibiotikum (500 mg Cefuroxim i.m.).
2. Angiographie und Stenting der Koronararterien bei Schweinen
   1. Beginnen Sie die antithrombotische Medikation am Tag des Stents mit einer Aufsättigungsdosis von 300 mg Aspirin pro os (po) und einer Aufsättigungsdosis von 600 mg Clopidogrel po. Setzen Sie die Einnahme von Aspirin (100 mg täglich) und Clopidogrel (75 mg täglich) bis zum Ende des Experiments fort.
   2. Schieben Sie einen Führungsdraht mit J-Spitze unter Durchleuchtung in die aufsteigende Aorta vor.
   3. Schieben Sie einen Führungskatheter mit einem geeigneten Winkel über den J-Draht vor und greifen Sie in die rechte und linke Koronararterien ein (typischerweise AR1 für die rechte Koronararterie und AR2 für die linke Koronararterie).
      HINWEIS: Der Führungskatheter ist mit einem Y-Adapter und einem Verteiler mit einer Leitung für mindestens das Kontrastmittel verbunden, um das Risiko des Eindringens von Luft in das Bildgebungssystem zu minimieren.
   4. Führen Sie eine Koronarangiographie durch, indem Sie ein Kontrastmittel in die Herzkranzgefäße injizieren.
      HINWEIS: Die Bildgebung sollte für jede Koronararterie aus mindestens zwei verschiedenen Winkeln durchgeführt werden. Verabreichen Sie außerdem intrakoronares Nitrat vor der Bildgebung (50-300 μl).
   5. Führen Sie einen koronaren Führungsdraht (0,014 Zoll) in das entsprechende Koronarsegment ein. Platzieren Sie den Stent in der RCA und der LCX oder in der stumpfen marginalen Arterie, die von der LCX ausgeht.
      HINWEIS: Der LAD ist oft konisch geformt, und ein Stent kann leicht entweder im distalen Teil überdehnt oder am proximalen Rand unterexpandiert bleiben. Es muss sorgfältig abgewogen werden, welche Herzkranzgefäße verwendet werden. Verwenden Sie die Stenoseanalysesoftware des Röntgengeräts oder die intravaskuläre Bildgebung, um ein gutes arterielles Segment auszuwählen und die Größe des Stents anzupassen.
   6. Schieben Sie den Stent über den Führungsdraht und stellen Sie ihn mit einem Indeflator gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein Verhältnis von Stent zu Arterie von 1,1:1 ein, wobei der Stent im Vergleich zum Referenzdurchmesser der Arterie leicht überdimensioniert wird.
   7. Führen Sie gegebenenfalls eine wiederholte Angiographie und intravaskuläre Bildgebung durch.
   8. Entfernen Sie das Kathetergerät.
   9. Entfernen Sie die Einführschleuse und üben Sie entweder manuell oder mit Hilfe einer Femurkompressionsvorrichtung Druck auf die Einstichstelle aus.
      HINWEIS: Gefäßverschlussvorrichtungen funktionieren bei Schweinen im Allgemeinen nicht gut, da sich die Anatomie des Hinterbeins des Schweins im Vergleich zum Menschen unterscheidet und die Oberschenkelarterie relativ klein ist.
3. OCT-Bildgebung von Koronararterien
   1. Führen Sie die OCT-Bildgebung vor und nach dem Einsatz des Stents und während der Nachbeobachtung durch. Um mit der OCT-Bildgebung zu beginnen, verschaffen Sie sich einen Gefäßzugang, verbinden Sie die Zielkoronararterie mit einem Führungskatheter und schieben Sie einen koronaren Führungsdraht distal in die Zielarterie vor.
   2. Verbinden Sie den OCT-Bildgebungskatheter mit der Dockingstation des Bildgebungssystems.
      HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des bildgebenden Systems, da diese sowohl zwischen den Herstellern als auch zwischen den verschiedenen Generationen von bildgebenden Kathetern variieren.
   3. Legen Sie einen neuen Patienten für die Aufzeichnung mit einem ID-Code Ihrer Wahl an.
   4. Spülen Sie das Lumen des bildgebenden Katheters mit einem Kontrastmittel.
      HINWEIS: Die Bildgebung kann mit Kochsalzspülung durchgeführt werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Änderung der Bildeinstellungen des Systems, um genaue Ergebnisse zu erzielen.
   5. Führen Sie die Einschienenbahn des Bildgebungskatheters über den Führungsdraht ein und schieben Sie die Katheter-Bildgebungsmarker an die gewünschte Bildgebungsstelle.
      HINWEIS: Achten Sie immer darauf, dass der Führungsdraht weit genug in die Arterie vordringt. Lassen Sie Katheter (bildgebende Fassung, Ballon, Stent) nicht über die Spitze des Führungsdrahtes hinausführen.
   6. Führen Sie eine Bildgebung durch. Beziehen Sie den gesamten Stent sowie die distalen und proximalen Referenzgefäße in den Pullback ein.
      1. Spülen Sie das Lumen des bildgebenden Katheters mit einem Kontrastmittel.
      2. Starten Sie die automatische Rückzugssequenz.
      3. Spülen Sie die Koronararterie mit einem großen Bolus Kontrastmittel durch den Führungskatheter (250-350 mgI/ml).
4. Gewebeperfusion und -fixation (Schweinemodell)
   1. Unter Narkose wird das Schwein mit einem 50-100 ml i.v. Bolus aus gesättigtem Kaliumchlorid (KCl) getötet.
   2. Perfusion mit Kochsalzlösung oder, wenn Proben nur für die Histologie mit einem 1%igen Paraformaldehyd-Gemisch entnommen werden, mit einer speziellen Pumpe.
   3. Perfundieren Sie das ganze Schweineherz, indem Sie eine Kanüle oder Nadel, die an der Perfusionspumpe befestigt ist, locker in die aufsteigende Aorta einführen.
   4. Platzieren Sie eine Klemme außerhalb der Aorta, um die Aorta um die Nadel/Kanüle zu schließen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Aortenklappe geöffnet sind, damit die Perfusionsflüssigkeit in die Koronararterien fließen kann.
   5. Perfusion mit 750-1000 mL ausgewählter Perfusionsflüssigkeit.
   6. Entnehmen Sie die Stent-Segmente der Koronararterie, indem Sie vorsichtig vom umgebenden Gewebe präparieren.
      HINWEIS: Erwägen Sie, proximale und distale Segmente der Koronararterie für die Histologie zu sammeln. Sammeln Sie außerdem alle notwendigen Sicherheitstücher.
   7. Das entnommene Gewebe, das für die histologische Analyse bestimmt ist, wird 4 h lang bei RT oder über Nacht bei 4 °C in 4 %iges Paraformaldehyd gelegt.
   8. Zur weiteren Lagerung 24 h lang auf 50 % EtOH bei 4 °C und dann 70 % EtOH bei 4 °C übertragen, bis es für die Histologie vorbereitet ist.

3. Histologie von Stents

HINWEIS: Die Stent-Histologie von nicht abbaubaren metallischen Stents erfordert die Verwendung eines plastischen Einbettungssystems und die Probenschnitte mit einem speziellen Mikrotom. Das Embedding-System ist kommerziell erhältlich, aber um eine Antikörper-basierte Immunhistologie zu ermöglichen, müssen einige Änderungen am Protokoll vorgenommen werden. Das Einbettungsprotokoll ist für alle Proben gleich, unabhängig vom verwendeten Tiermodell. Verwenden Sie für den Einbettungsprozess ein Einbettungssystem aus Kunststoff. Arbeiten Sie in einer Haube für alle Einbettungs- und Histologieverfahren.

1. Dehydrieren Sie die Proben aus der EtOH-Lösung zu Xylol.
2. Befolgen Sie das Protokoll für das Einbettungssystem, mit Ausnahme der Verwendung einer destabilisierten Basislösung ab dem zweiten Schritt vor der Infiltration.
   HINWEIS: Die basische Lösung wird durch Abtropfen durch Ammoniumoxid destabilisiert.
3. Kombinieren Sie die Polymerisationsflüssigkeiten in Kunststoff-Probengefäßen mit den Stent-Segmenten.
   HINWEIS: Die Arterien mit Stents können fixiert werden, indem eine kleine Nadel durch die Außenseite des Behälters eingeführt wird.
4. Die Proben werden 10-15 Minuten lang vakuumiert und mindestens 48 h lang bei 4 °C polymerisiert.
5. Sägen Sie die Kanten des Kunststoffblocks ab (insbesondere bei Verwendung einer zylindrischen Form), um gerade Flächen zu erzeugen. Dies ermöglicht eine sichere Befestigung am Mikrotom.
6. Schneiden Sie mit einem speziellen Mikrotom in 5-7 μm große Abschnitte.
7. Die frisch geschnittenen Abschnitte in 50% EtOH 5-10 min ziehen lassen.
8. Sammeln Sie die Schnitte aus dem EtOH auf Standard-Mikroskopie-Objektträger (zwei oder drei Schnitte pro Objektträger).
9. Mit zwei oder drei Tropfen Haupt-Lösung bedecken und mit einer Plastikfolie abdecken. Legen Sie eine Schicht Papier auf die Plastikfolie und legen Sie eine leere Glasfolie auf das Papier.
10. Üben Sie mindestens 24 Stunden lang bei 42 °C Druck auf die Schiene aus, indem Sie die Schienen in einen kleinen Tischschraubstock legen, während sie mit Papierschichten gepolstert sind.
11. Bewahren Sie die Objektträger bei RT auf.
12. Entfernen Sie vor der histologischen Färbung das Kunststoffharz, indem Sie die Objektträger 24-48 Stunden lang in Methylmethacrylat inkubieren.
13. In Xylol (2 x 10 min Inkubation) vor dem histologischen oder immunhistologischen Standardverfahren^{klären 7,8}.

Eine erfolgreiche Stentexpansion muss durch eine Angiographie und idealerweise durch intravaskuläre Bildgebung bestätigt werden (Abbildung 3A,B). Das Modell der Koronararterien des Schweins ermöglicht mehrere Bildgebungssitzungen, und die OCT kann verwendet werden, um Nachsorgedaten mit häufiger Bildgebung zu erstellen. ISR- und Stentexpansion sowie mögliche Strebenfrakturen können leicht anhand von angiographischen und OCT-Bildgebunge...

Während die aktuelle Generation von medikamentenfreisetzenden Koronarstents ihre Vorzüge unter Beweis gestellt hat, werden neue Geräte entwickelt, um den Bedürfnissen von Patienten und medizinischem Fachpersonal besser gerecht zu werden. Die erste Runde von vollständig biologisch abbaubaren Koronargerüsten erfüllte mehrere Herausforderungen, was die Bedeutung der Erprobung neuer Geräte in biologisch relevanten Modellen weiter^{unterstreicht 9}. Die hier vorge...

Die Autoren machen keine Angaben.

Die Autoren danken Heikki Karhunen, Minna Törrönen und Riikka Venäläinen vom Nationalen Versuchstierzentrum an der Universität Ostfinnland für die fachkundige Unterstützung. Diese Studie wurde durch das Finnish Academy Flagship Grant unterstützt.