Organkultursystem zur Beurteilung der Toxizität von intraokularen Behandlungshilfsstoffen und Arzneimitteln

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Veränderungen der Stoffwechselaktivität und der Brechfunktion der Linse als Reaktion auf eine experimentelle Behandlung zu bewerten.

Als Hauptursache für Erblindung sind Katarakte eine erhebliche Belastung für die zig Millionen Menschen, die weltweit von dieser Erkrankung betroffen sind. Chemische Belastungen sind neben anderen Umweltfaktoren eine nachgewiesene Ursache für Katarakte. Mit der Untersuchung der Augentoxizität kann beurteilt werden, ob Arzneimittel und ihre Bestandteile zu Linsenschäden beitragen können, die zu Katarakten führen können, oder die Behandlung von Katarakten unterstützen können.

In-vitro-Studien und In-vivo-Tierversuche können zur Bewertung der Sicherheit von Chemikalien vor klinischen Studien herangezogen werden. Der Draize-Test - der derzeitige In-vivo-Standard für die Prüfung der Augentoxizität und -reizung - wurde wegen mangelnder Sensitivität und objektiver Messungen zur Bestimmung der Augentoxizität kritisiert. In vitro zellbasierte Assays sind begrenzt, da Zellkulturen eine intakte funktionelle Linse nicht angemessen modellieren können.

Die hier beschriebene Methode ist eine empfindliche In-vitro-Alternative zu Tierversuchen, die entwickelt wurde, um das Ansprechen der intakten Rinderlinse auf die Behandlung sowohl auf dem Niveau der zellulären Aktivität als auch für die allgemeine Brechungsleistung zu bewerten. Das ungiftige Reagenz Resazurin wird proportional zum Grad der Zellaktivität metabolisiert. Der Linsen-Laser-Scanner-Assay misst die Fähigkeit der Linse, einfallende Lichtstrahlen mit minimalem Fehler auf einen einzigen Punkt zu brechen, der für ihre natürliche Funktion direkt relevant ist. Die Methode kann verwendet werden, um sowohl akute als auch verzögerte Veränderungen der Linse sowie die Erholung der Linse von chemischen oder Umwelteinflüssen zu bestimmen.

Mit mehr als 20 Millionen Menschen ist der Graue Star die häufigste Ursache für Erblindung weltweit ^1,2. Katarakte sind am häufigsten auf altersbedingte Veränderungen der Linse zurückzuführen, werden aber auch durch Traumata, genetische Bedingungen, Krankheiten oder toxische Expositionen induziert². Derzeit umfasst die Behandlung einen chirurgischen Eingriff, um die Linse zu ersetzen, ein teures und invasives Verfahren, das vor allem in Industrieländern zugänglich ist. Die umfangreiche Belastung durch den Grauen Star hat die jahrzehntelange Forschung auf die Kataraktprävention und die Entwicklung nicht-chirurgischer Behandlungen ausgerichtet. In beiden Fällen ist die Bedeutung präklinischer Tests auf Toxizität, Wirksamkeit und Pharmakokinetik von Augenarzneimitteln von größter Bedeutung. Dieser Prozess der Arzneimittelentwicklung stützt sich stark auf die Informationen aus Tierstudien.

Der derzeitige Standard für die Prüfung der Augentoxizität in vivo ist der Draize-Test, bei dem eine Prüfsubstanz in den Bindehautsack eines lebenden Tieres abgegeben wird. Der Test wurde erheblich kritisiert, insbesondere in Bezug auf Tierethik, Subjektivität, schlechte Wiederholbarkeit und Variabilität³. Darüber hinaus gibt es keine Komponente des Draize-Tests, die die Auswirkungen der Testsubstanzen auf die Linse direkt überwacht. Es wurden erhebliche Anstrengungen in die Entwicklung alternativer In-vitro-Modelle investiert⁴. Keines davon ist jedoch ausreichend validiert, um den Draize-Test⁵ zu ersetzen. In ähnlicher Weise stoßen viele dieser Modelle auf Einschränkungen in Bezug auf die direkte Anwendung auf Katarakte und andere komplexe Pathologien⁶. Zum Beispiel sind Methoden, die die Transparenz von Linsen abstufen, wenn sie über einem Raster platziert werden, von Natur aus subjektiv⁷. Zellkulturstudien sind zuverlässig und sehr gut nutzbar, obwohl die Eigenschaften der Zellmonoschicht von denen der primären Gewebekultur abweichen können⁸.

Ganze Linsen können aus den Augen von Tieren präpariert und kultiviert werden, um ihre ursprüngliche Struktur und Funktion zu erhalten. Ein Assay, der nützlich ist, um die Linsenfunktion zu beurteilen und gleichzeitig den Zustand des Organs zu erhalten, ist der Linsen-Laser-Scanner-Assay mit einem Scanner, der an der University of Waterloo in Kanada entwickelt wurde. Bei dem Assay handelt es sich um ein Scansystem, das eine Reihe von Laserprojektionen verwendet, um die optische Qualität oder Brechungsleistung der Linse zu messen. Die Linsen werden in ihren speziell entwickelten Zwei-Segment-Kulturkammern gescannt, so dass Strahlen von unten durch die Linse gelangen können (Abbildung 1A). Eine im Inneren des Scanners befestigte Kamera erfasst das Bild des Lasers, der an zahlreichen Stellen durch das Objektiv geht. Die Scanner-Software berechnet den Abstand hinter der Linse, in dem sie sich mit einer Mittelachse schneidet (Back Vertex Distance, BVD), und erzeugt eine Reihe von Messungen, die anzeigen, wie gleichmäßig die Linse das Licht auf einen einzigen Punkt fokussiert (Abbildung 1).

Die zellulären Eigenschaften der Linse, wie z. B. die enge und geordnete Anordnung ihrer Zellen, tragen dazu bei, die Transparenz zu erhalten und die Streuung zu minimieren, so dass die Linse das Licht funktional fokussieren kann⁹. Mit diesem Maß kann interpretiert werden, wie stark eine Chemikalie die wesentliche Struktur der Linse, wie z. B. den Gradientenbrechungsindex, stört und wie stark die Funktion durch die induzierten Trübungen beeinträchtigt wird. Andere Studien, die die Reaktion von kultivierten Linsen und Linsenvesikeln verfolgt haben, deuten darauf hin, dass die Lichtstreuung im Vergleich zu metabolischen Veränderungen ein Produkt struktureller Veränderungen ist und dass Störungen der Linsenlipide und -proteine den Brechungsindex beeinflussen und folglich die Streuung erhöhen können^10,11.

Der Linsen-Laserscanner kann in Verbindung mit metabolischen Reagenzien in Assays verwendet werden, um biochemische Messungen der Zelltoxizität zu bestimmen. Resazurin ist ein ungiftiges chemisches Reagenz, das von aktiven Zellen metabolisiert wird und ein reduziertes Produkt (Resorufin) mit einer messbaren Fluoreszenz erzeugt¹². Die Linse ist weitgehend frei von Organellen, mit Ausnahme der metabolisch aktiven Mitochondrien, die im vorderen Epithel konzentriert sind, und der oberflächlichen kortikalen Faserzellen, die den Energiebedarf der Linse decken^13,14. Eine Schädigung der Linse auf zellulärer Ebene kann den Stoffwechsel stören und geht oft dem Auftreten von pathogenen strukturellen Veränderungen und Katarakt^{voraus 15}.

Der Zweck dieser Methode besteht darin, die Wirkung von xenobiotischen und Umwelteinflüssen auf die Linse zu bewerten, die zur Entwicklung des Grauen Stars beitragen können. Das Protokoll umfasst zwei Assays, um die Wirkung einer Behandlung mit der kultivierten Rinderlinse zu bewerten. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er sowohl eine zelluläre als auch eine funktionelle Bewertung dessen ermöglicht, wie die Linse als primäres Gewebe auf die Behandlung anspricht. Es handelt sich um eine empfindliche und objektive Bewertung der Linse im Vergleich zu anderen gängigen Methoden 16,17,18.

Das Modell wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen verschiedener Expositionen zu bewerten, darunter Tenside, Konsumgüter, Alkohole und ultraviolette Strahlung 17,19,20. Veränderungen der optischen Qualität sind bei kultivierten Linsen als Reaktion auf toxische Exposition durchweg vorhanden²¹. Die Fähigkeit dieser Methode, eine langfristige Linsenkultur aufrechtzuerhalten, ist gut geeignet, um die potenziell verzögerte Wirkung einer Verbindung und die Erholung der Linse von induzierten Schäden oder Katarakt zu überwachen ^22,23. Die Ergebnisse der Anwendung dieses Protokolls können genutzt werden, um die Abhängigkeit von Tierversuchen bei der Entwicklung von ophthalmologischen Produkten zu verringern.

Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den Ethikrichtlinien der University of Waterloo für die Forschung mit tierischem Gewebe durchgeführt. Die Rinderaugen für die aktuelle Studie wurden vom Schlachthof zur Verfügung gestellt, innerhalb weniger Stunden nach dem Tod von Nicht-Milchkühen gewonnen und sofort präpariert, ein Prozess, der bis zu 8 Stunden nach der Gewinnung der Augen dauert. Die Augen sollten sofort präpariert werden, um die Sterilität und die Präparierqualität zu erhalten. Das Kulturmedium wird auf einen pH-Wert von 7,4 vorbereitet und vor der Supplementierung mit FBS²¹ sterilfiltriert. Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wobei die Material- und Gerätequellen in der Materialtabelle aufgeführt sind.

1. Kultur von Rinderlinsen

1. Präparieren Sie Linsen, indem Sie extraokulare Muskeln und Gewebe aus der Sklera entfernen, die hintere Hälfte des Globus und den Glaskörper entfernen, die Iris und den Ziliarkörper zusammen mit der Linse entfernen, dann die zonulären Ansätze wegschneiden und den letzten Schnitt so positionieren, dass die Linse in die mit Medium gefüllte Kulturkammer fällt.
2. Kultivieren Sie die präparierten Linsen in speziellen Kammern mit einer an das Laserscanning-System angepassten Basis mit 21 ml sterilfiltriertem Medium bei 37 °C und 5 % CO₂. Verwenden Sie 3 % mit fötalem Rinderserum (FBS) supplementiertes Kulturmedium mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 9,4 g/l M-199, 0,1 g/l L-Glutamin, 5,96 g/l HEPES, 2,2 g/l Natriumbicarbonat und 7 ml/l NaOH. Bewahren Sie unbenutzten Nährboden bis zu 7 Tage im Kühlschrank auf.
3. Tauschen Sie das Nährmedium alle 1-2 Tage aus. Erwärmen Sie das Nährmedium vor der Verwendung eine Stunde lang auf 37 °C. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette mit Absauganschluss, um das Medium aus einer einzelnen Kulturkammer zu aspirieren und sofort mit dem supplementierten Medium aufzufüllen.
4. Kultivieren Sie die Linsen nach der Dissektion 48 Stunden lang, um Zeit zu haben, bis sich physische Schäden manifestieren. Prüfen und scannen Sie die Linsen auf ihre optische Qualität gemäß Abschnitt 4, bevor Sie sie in einen Versuch aufnehmen.
   HINWEIS: Die Linsen werden zur Vorbereitung auf den Laserscanner-Assay mit der Vorderseite nach unten ausgerichtet.

2. Kontrollverfahren

1. Bereiten Sie eine Lösung mit der gewünschten Konzentration eines Lösungsmittels vor, die mit der chemischen Verbindung und dem Nährmedium kompatibel ist.
2. Bereiten Sie eine Lösung für die Fahrzeugsteuerung vor, indem Sie das Lösungsmittel zu einem ergänzten Medium hinzufügen. Erwärmen Sie die Kontrolllösung vor dem Versuch eine Stunde lang bei 37 °C.
3. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, die an die Absaugung angeschlossen ist, um das Nährmedium aus den Kontrolllinsenkammern abzusaugen. Füllen Sie die Kammern mit der Steuerungslösung auf. Führen Sie diesen Schritt bei Bedarf mit Proben in dreifacher Ausfertigung durch.
   HINWEIS: Ein Mindestvolumen von 7 ml ist erforderlich, um die Linse in der vorderen Position mit der Vorderseite nach oben vollständig zu bedecken. Die Bedingungen für die Kontrollen in der aktuellen Studie waren 21 mL unbehandelte Mediumkontrolle, 21 mL eines Vehikel-Kontrollmediums und 7 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
4. Die Linsen werden 2 Tage lang in Kontrollmedium kultiviert und dann durch ein neues Kontrollmedium gemäß Abschnitt 1 ersetzt. Bei kurzfristiger Exposition ist die Kontrolllösung aus den Kammern abzusaugen und mindestens dreimal mit unsupplementiertem Nährmedium zu spülen, bevor das Linsenkulturprotokoll wie in Abschnitt 1.0 beschrieben fortgesetzt wird.
5. Lassen Sie die Linsen im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ mindestens 3,5 h akklimatisieren, bevor Sie die optische Qualität beurteilen.

3. Verfahren zur Exposition

1. Bereiten Sie eine Lösung mit der gewünschten Konzentration eines Lösungsmittels vor, die mit der chemischen Verbindung und dem Nährmedium kompatibel ist. Kombinieren Sie die Chemikalie mit dem Lösungsmittel und lassen Sie bei Bedarf die entsprechende Zeit für die Interaktion.
   HINWEIS: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin wurde in der aktuellen Studie verwendet, um die Löslichkeit von Lanosterol (0,033 g/L) in Medium zu verbessern. Die Lösung von Benzalkoniumchlorid (BAK 0,0075%) wurde unter Verwendung von PBS hergestellt.
2. Bauen Sie die lösliche Chemikalie in das Kulturmedium ein. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen vor, das ausreicht, um allen Linsenproben 21 ml Medium zuzuführen. Das Versuchsmedium wird vor dem Versuch eine Stunde lang auf 37 °C erwärmt.
3. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, die an eine Absaugung angeschlossen ist, um das Nährmedium aus den Linsenkammern abzusaugen. Füllen Sie die Kammern sofort mit der Testlösung auf. Nach dem Expositionsintervall durch supplementiertes Nährmedium ersetzen und bei Bedarf zuerst eine Spülung durchführen. Führen Sie diesen Schritt bei Bedarf mit Proben in dreifacher Ausfertigung durch.
   HINWEIS: In der aktuellen Studie waren die Testbedingungen 21 ml mit Lanosterol supplementiertes Medium und 7 ml einer BAK 0,0075% Lösung. Ein Mindestvolumen von 7 mL ist erforderlich, um die Linse vollständig zu bedecken. In diesem Fall müssen die Linsen zunächst mit der Vorderseite nach oben ausgerichtet werden. Eine Pasteur-Pipette kann verwendet werden, um mit einem Teil des umgebenden Kulturmediums einen Strom in der Kulturkammer zu erzeugen, um die Linse neu zu positionieren.
4. Legen Sie die Linsen für mindestens 3,5 Stunden in den Inkubator, um sich vor der Beurteilung der optischen Qualität zu akklimatisieren.
   HINWEIS: Die Linsen werden zur Vorbereitung auf den Laserscanner-Assay mit der Vorderseite nach unten ausgerichtet.

4. Optischer Qualitätsassay (Linsen-Laser-Scanner)

1. Stellen Sie sicher, dass die Linsen mit der vorderen Vorderseite nach unten ausgerichtet und in der Kulturkammer visuell waagerecht sind, indem Sie die Technik aus Schritt 3.3 verwenden, um die Position der Linse bei Bedarf anzupassen.
   HINWEIS: Diese Position stellt sicher, dass der einfallende Strahl durch den Kammerboden nach oben reflektiert wird und durch die Linse von der vorderen zur hinteren Oberfläche gelangt.
2. Positionieren Sie eine Linsenkulturkammer so in den Laserscanner, dass der Stift des Kammerschlittens in den Schlitz im Kammerboden passt.
3. Wählen Sie das Objektiv und den Scanpunkt aus, für die ein Scan durchgeführt werden soll, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Scanobjektiv und warten Sie, bis der Scanner Sie auffordert, den Strahl zu finden und auszurichten. Wählen Sie für den Strahl hinter der Linse einen weit entfernten Anfang und Endpunkt aus. Stellen Sie sicher, dass der zentrale Strahl mit den Brutto - und Feineinstelltasten in der Scannersoftware und dem Einstellknopf am Scanner ausgerichtet ist. Wenn der Balken ausgerichtet ist, klicken Sie auf Kalibrieren , und geben Sie eine entsprechende Auswahl an radialen Schritten und Balkenabständen ein.
   HINWEIS: Für diese Studie mit der Rinderlinse wurden die Einstellungen für radiale Schritte und Strahlabstand auf 10 Schritte bzw. 0,5 mm eingestellt. Der erste Scan, den der Scanner durchführt, dient der Kalibrierung des Laserscanners. Dies ist einmal erforderlich, und alle zusätzlichen Linsenscans können direkt nach der Ausrichtung durchgeführt werden.
4. Nachdem der Scanner kalibriert wurde, klicken Sie auf Scannen. Warten Sie, bis die Werte für den BVD-Mittelwert, die Standardabweichung und den Fehler entlang einer Achse generiert werden, nachdem der Linsenscan abgeschlossen ist und der Umfang des Strahls eingestellt wurde. Stellen Sie das Zielfernrohr von der Stelle, an der die Strahlen das Objektiv verlassen, auf den gewünschten Endpunkt ein, indem Sie den maximalen Abstand hinter dem Objektiv auswählen, ohne sichtbare Interferenzen zu verursachen.
5. Verwenden Sie das generierte Diagramm, um die einzelnen hinteren Eckpunktabstände für jeden Balken anzuzeigen.
   HINWEIS: Strahlen, die durch Linsennähte verlaufen, ausschließen. Um einen Balken auszuschließen, klicken Sie in der Legende auf dem Bildschirm mit der rechten Maustaste auf einen einzelnen Balken, und wählen Sie Ausschließen aus.
6. Schwenken Sie die Position des Kulturkammersockels im Inneren des Scanners manuell um 90°, so dass der zweite Scan entlang der vorderen Linsenoberfläche senkrecht zum vorherigen Scan verläuft. Stellen Sie sicher, dass der Mittelstrahl wie in Schritt 4.3 beschrieben ausgerichtet ist, und scannen Sie dann die Linse.

5. Assay der metabolischen Aktivität (Resazurin)

1. Bereiten Sie das Medium ohne FBS vor. Das Medium eine Stunde lang auf 37 °C erwärmen. Bereiten Sie 50 ml 8%iges Resazurin-Reagenz in einem nicht supplementierten Medium vor.
   HINWEIS: Es reicht aus, 50 mL vorzubereiten, um alle Wells in einer 12-Well-Platte zu füllen. Die Lösung sollte steril unter dunklen Bedingungen in einem undurchsichtigen Behälter hergestellt werden, da Resazurin lichtempfindlich ist.
2. Geben Sie 3,8 ml 8%ige Resazurinlösung in jede Vertiefung in einer sterilen 12-Well-Platte mit klarem Boden, um die Linse abzudecken.
3. Verwenden Sie sterile Metallschaufeln, um die Linsen vorsichtig unter der hinteren Oberfläche hervorzuheben, und spülen Sie sie mit einer Pasteurpipette ab, um die Linse mit einer kleinen Menge nicht ergänztem Nährmedium zu waschen. Platzieren Sie die Linsen einzeln in jeder Vertiefung.
4. Die Well-Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ 5 h inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Linsen mit Metallschaufeln aus den Vertiefungen und legen Sie sie in einen Entsorgungsbehälter für tierische Abfälle. Übertragen Sie eine 100-μl-Probe aus jeder Vertiefung in eine sterile 96-Well-Platte mit klarem Boden.
   HINWEIS: Linsen können mit dem Stoffwechselaktivitätstest mehrfach beurteilt werden. In diesem Fall werden die Linsen zur Inkubation mit frischem Medium in die Kulturkammern zurückgebracht. Der Stoffwechselaktivitätstest wird am besten durchgeführt, wenn alle Scans abgeschlossen sind, da der Farbstoff die BVD-Messungen beeinflussen kann.
5. Messen Sie die Endpunktfluoreszenz der 100-μl-Proben mit einem Fluoreszenzplatten-Reader, wobei die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 560 nm bzw. 590 nm eingestellt sind.

6. Datenanalyse

1. Berechnen Sie für den optischen Qualitätsassay den Durchschnitt der softwareberechneten Werte für den BVD-Fehler²⁴ aus den beiden Scans, die zu jedem Zeitpunkt durchgeführt wurden. Führen Sie diese Berechnung für alle Objektive und alle Scanpunkte durch.
2. Erfassen Sie für den Stoffwechselaktivitäts-Assay die relativen Fluoreszenzwerte des Endpunkts, die vom Platten-Reader generiert wurden. Normalisieren Sie die Daten, indem Sie den Durchschnitt aller Kontrollwerte an einem Scanpunkt auf 100 % festlegen. Berechnen Sie die Aktivität jeder Linse als Prozentsatz des durchschnittlichen Kontrollwerts für diesen Scanpunkt.
3. Führen Sie einen Normalitätstest für alle Versuchsgruppen durch. Unter der Annahme, dass die Daten normal sind, analysieren Sie die BVD-Fehlerunterschiede zwischen Kontroll- und experimentellen Objektiven mit der bidirektionalen ANOVA. Führen Sie außerdem den Post-hoc-Mehrfachvergleichstest von Tukey durch. Führen Sie eine unidirektionale ANOVA und den Post-hoc-Test von Dunnett für die Daten zur Stoffwechselaktivität durch.

Abbildung 2 und Abbildung 3 (n = 6) zeigen die Ergebnisse einer Studie, in der die Wirkung einer chemischen Behandlung (Lanosterol) auf die Rinderlinse untersucht wurde. Lanosterol ist ein natürlich vorkommendes Sterol in der Linse, das einst vielversprechende Ergebnisse als potenzieller pharmazeutischer Eingriff bei Katarakten zeigte²⁵, obwohl dies noch nicht bewiesen wurde²⁶. Da...

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Auswirkungen von Chemikalien oder Umwelteinflüssen auf die Linse in der primären Gewebekultur direkt zu bewerten. Zunächst werden Linsen präpariert und auf optische Qualität gescannt. Die Vermeidung von Kontaminationen und die Sicherstellung der Präparierqualität sind von entscheidender Bedeutung. Die Linsen werden in regelmäßigen Abständen gescannt, um Veränderungen der Brechfunktion in Bezug auf die Kontrollgruppe oder die Präe...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Vielen Dank an den Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) und den Canadian Optometric Education Trust Fund (COETF) für die Mittel für dieses Projekt.