Ein ex vivo Mastzell-Degranulationsassay unter Verwendung von rohen peritonealen Exsudatzellen und natürlicher Antigenstimulation

Wir haben einen ex vivo Mastzell-Degranulationsassay etabliert, bei dem rohe peritoneale Exsudatzellen inkubiert werden, die von Mäusen isoliert, mit einem pharmakologischen Wirkstoff von Interesse behandelt und zuvor Anti-Dinitrophenol (DNP) IgE mit DNP auf einem Trägerprotein verabreicht wurden.

Mastzellstabilisatoren sind ein wesentlicher Bestandteil von Allergiemedikamenten. Die passive systemische Anaphylaxie (PSA) ist ein Tierassay, der häufig zur Untersuchung der Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs von Interesse auf Mastzellen in vivo verwendet wird. Da die anaphylaktischen Symptome in erster Linie auf die Exozytose der Granulate aus Mastzellen zurückzuführen sind, wird angenommen, dass das Mittel zur Verbesserung der Symptome eine mastzellstabilisierende Wirkung hat. Trotzdem ist es ratsam, die Aktivität durch direkten Nachweis des Rückgangs der funktionellen Aktivität von Mastzellen nach ihrer Behandlung zu bestätigen. Zu diesem Zweck werden routinemäßig In-vitro-Degranulationsassays mit einer immortalisierten Mastzelllinie oder kultivierten primären Mastzellen eingesetzt. Die Ergebnisse der In-vitro- und der In-vivo-Assays sind möglicherweise nicht immer miteinander identisch. da jedoch die Behandlungsbedingungen (z. B. Behandlungsdosis, -zeit, Umgebungsumgebungen) für die In-vitro-Assays häufig von denen für den In-vivo-Assay wie PSA verschieden sind. Auf der Suche nach einem in vitro (oder ex vivo) Assay, um die Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs auf Mastzellen in vivo genauer widerzuspiegeln, haben wir den ex vivo Mastzell-Degranulationsassay entwickelt, bei dem rohe peritoneale Exsudatzellen (PECs), die aus den Mäusen isoliert, mit dem Wirkstoff behandelt und mit Anti-Dinitrophenol (DNP) IgE verabreicht wurden, direkt mit DNP auf einem Trägerprotein inkubiert wurden. Es stellte sich heraus, dass der Assay nicht nur nützlich war, um die Mastzell-stabilisierende Aktivität eines pharmakologischen Wirkstoffs zu validieren, der durch den In-vivo-Assay angezeigt wurde, sondern auch praktisch und hochgradig reproduzierbar war.

Mastzellen spielen eine zentrale Rolle bei Allergien ^1,2. Wenn IgE, das sich auf der Oberfläche von Mastzellen befindet, über Wechselwirkung mit dem hochaffinen Rezeptor für IgE (FcεRI) auf ein verwandtes Allergen trifft, wird eine Signalkaskade ausgelöst, die die Freisetzung des Granulats veranlasst. Infolgedessen wird eine Vielzahl von Allergieeffektormolekülen, darunter Monoamine (z. B. Histamin, Serotonin), Zytokine (z. B. TNF-α) und proteolytische Enzyme (z. B. Tryptase, Chymase), freigesetzt, um eine Reihe von immunologischen, neurologischen und vasomuskulären Reaktionen zu verursachen ^3,4.

Eine Klasse von Arzneimitteln wird als Mastzellstabilisator bezeichnet, der die Allergiesymptome lindert, indem er die Mastzellfunktion abschwächt⁵. Die passive systemische Anaphylaxie (PSA) ist ein Tiermodell, das häufig zur Untersuchung der mastzellstabilisierenden Aktivität pharmakologischer Wirkstoffe verwendet wird. Da die anaphylaktischen Symptome in erster Linie aus der Aktivierung von Mastzellen nach Interaktion von passiv übertragenem Hapten-spezifischem IgE mit dem Hapten auf einem später in das Tier injizierten Trägerprotein resultieren, ist es gut anzunehmen, dass ein pharmakologischer Wirkstoff von Interesse eine mastzellstabilisierende Wirkung zeigt, wenn seine Behandlung zu einer Verbesserung der Symptome führt⁶. Dennoch ist es oft zwingend erforderlich, eine Beeinträchtigung der Mastzellfunktion durch den Wirkstoff in einem separaten Experiment direkt nachzuweisen, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Verbesserung der Symptome auf einen anderen Mechanismus als die Unterdrückung der Mastzellfunktion zurückzuführen ist.

Der Mastzell-Degranulationsassay, der durch Stimulieren von Mastzellen mit einem chemischen Reagenz oder einem spezifischen IgE-Antigen, das einen Komplex mit FcεRI auf der Oberfläche von Mastzellen bildet, durchgeführt wird, um eine Exozytose von sekretorischen Granulaten (d. h. Degranulation) zu induzieren, wird im Allgemeinen zur Bestimmung einer mastzellstabilisierenden Aktivität eines pharmakologischen Reagenzes in vitro^{verwendet 7}. In diesem Assay werden verschiedene Zelltypen verwendet, darunter die Basophile Leukämie (RBL)-Zelllinie⁸ der Ratte, die aus dem Knochenmark stammenden Mastzellen (BMMC)⁹ und die aus Peritonealzellen stammenden Mastzellen (PCMC)¹⁰. RBL ist zwar nützlich, da eine große Anzahl von Zellen leicht gewonnen werden kann, aber es handelt sich um eine immortalisierte Krebszelllinie, deren zelluläre Eigenschaften nicht mehr mit denen von Mastzellen im Körper vergleichbar sind. Die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von BMMC oder PCMC ist oft kostspielig und zeitaufwändig, auch wenn ihre zellulären Eigenschaften denen von Mastzellen im Körper ähneln.

Ein Degranulationsassay mit aufgereinigten primären Mastzellen ist eine wünschenswerte Alternative¹¹. Nichtsdestotrotz ist die Verwendung eines solchen Assays nicht weit verbreitet, da es sich um eine einfache Methode zur Reinigung von Mastzellen aus tierischem Gewebe, insbesondere aus Mausgewebe, mit einer hohen Ausbeute handelt und die Reinheit noch nicht verfügbar ist. Da die Konzentration und Dauer der Behandlung mit einem pharmakologischen Wirkstoff zur Hemmung der Mastzellfunktion in vitro nicht immer mit denen in vivo übereinstimmen können, können die mit einem In-vitro-Degranulationsassay erzielten Ergebnisse die Ergebnisse eines In-vivo-Assays wie PSA falsch darstellen und umgekehrt. Daher ist ein neuartiger Degranulationsassay sehr gefragt, der nicht nur die Art und Weise der Mastzellaktivierung in vivo nachahmt, sondern auch die Auswirkungen eines pharmakologischen Reagenzes, das in vivo auf Mastzellen ausgeübt wird, genau widerspiegelt. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, haben wir einen ex vivo Mastzell-Degranulationsassay entwickelt, bei dem Mastzellen in peritonealen Exsudatzellen (PECs), die aus den Mäusen isoliert und mit einem pharmakologischen Wirkstoff von Interesse behandelt und zuvor mit Dinitrophenol (DNP) spezifischem IgE verabreicht wurden, mit DNP-konjugiertem Rinderserumalbumin (BSA) stimuliert werden.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) der Chungnam National University (Tierprotokollnummer: CNU-00996) durchgeführt.

1. Quantifizierung mastzellspezifischer Moleküle im Lysat von rohen PECs

1. Isolieren Sie die Zellen aus der Bauchhöhle^{der Maus 12}.
   1. Betäuben Sie eine Maus (8 Wochen alt, männlich, BALB/C) mit Isofluran. Euthanasieren Sie durch Gebärmutterhalsluxation.
   2. Platzieren Sie die Maus auf einem Schaumstoffblock. Wischen Sie den Bauch mit 70% Ethanol ab.
   3. Schneiden Sie die Bauchhaut mit einer stumpfen Schere in Längsrichtung ein. Ziehe die Haut der Maus mit einer Pinzette und einer Schere ab.
   4. Injizieren Sie 6 ml eiskalten Tyrode-B-Puffer¹³ mit einer 10-ml-Spritze und einer 26-G-Nadel in die Bauchhöhle. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein, um ein Einstechen von Organen zu vermeiden.
   5. Massieren Sie den Bauch der Maus 60-90 s lang, um Peritonealzellen in Tyrodes B-Puffer zu sammeln. Tun Sie es vorsichtig, um die Blutgefäße nicht zu beschädigen.
   6. Führen Sie die Nadel (20 G), die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, nach oben ab. Saugen Sie die Flüssigkeit langsam aus der Bauchhöhle ab (typischerweise 5-6 ml).
   7. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze. Geben Sie die Peritonealflüssigkeit in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Halten Sie die Tube auf Eis.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 - 1.1.7.
   9. Das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 10 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC). Halten Sie die Zellen 3 Minuten lang auf Eis.
   10. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit 2 mL B-Puffer von Tyrode. Das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 10 °C zentrifugieren.
   11. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 mL des A-Puffers¹³ von Tyrode.
   12. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Stellen Sie die Zellzahl mit dem A-Puffer von Tyrode auf 5 x 10⁶/ml ein.
2. Herstellung von mastzelldepletierten PECs unter Verwendung eines magnetischen Zellaufreinigungssystems¹⁴.
   1. 5 x 10⁵ rohe PECs mit 300 x g für 5 min bei 10 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBSBE-Zellaufreinigungspuffer (0,5 % BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
   2. Geben Sie 1 μl Fc-Blocker (0,5 mg/ml) in die Zellen, um eine unspezifische Bindung des monoklonalen Anti-C-Kit-Antikörpers (mAb) zu verhindern, der als nächstes hinzugefügt werden soll. Halten Sie die Zellen 5 Minuten lang auf Eis.
   3. Fügen Sie 1 μl biotinyliertes Anti-Maus-c-kit mAb¹⁵ (0,5 mg/ml) hinzu. Halten Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis.
   4. Fügen Sie 2 ml PBSBE-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 10 °C.
   5. Entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen erneut mit 2 mL PBSBE-Puffer.
   6. Resuspendieren Sie die Zellen in 90 μl PBSBE-Puffer. Fügen Sie 10 μl Streptavidin-konjugierte Mikrokügelchen hinzu. Halten Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.
   7. Fügen Sie 2 ml PBSBE-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 10 °C.
   8. Laden Sie während des Spins 500 μl PBSBE-Puffer auf eine mittlere magnetische Säule. Lassen Sie den Puffer durch die Spalte fließen.
   9. Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBSBE-Puffer.
   10. Laden Sie die Zellen in die Spalte. Sammeln Sie die Zellen, die frei durch die Säule verlaufen.
   11. Waschen Sie die Säule mit 500 μl PBSBE-Puffer. Sammeln Sie die Zellen, die die Spalte durchlaufen, erneut.
   12. Wiederholen Sie Schritt 1.2.11.
   13. Kombinieren Sie die Zellen aus den Schritten 1.2.9-1.2.11 in einem Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 10 °C.
   14. Resuspendieren Sie die Zellen in Tyrodes A-Puffer. Zählen Sie die Zellen. Stellen Sie die Zellzahl auf 5 x 10⁶ Zellen/ml ein.
3. Bereiten Sie das Lysat von PECs vor.
   1. Platten-PECs (z. B. 5 x 10⁵) in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 2 min bei 10 °C, um die Zellen zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
   2. Geben Sie 100 μl Zelllysepuffer zum Zellpellet. Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Den Teller 60 min auf Eis legen.
   3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 5 min bei 10 °C, um Zellreste zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand (das Zelllysat) auf eine neue 96-Well-Platte.
4. Messen Sie die enzymatische Aktivität von β-Hexosaminidase¹⁶.
   1. Geben Sie das Zelllysat (50 μl) in eine vorgewärmte β-Hexosaminidase-Substratlösung (50 μl) in einer 96-Well-Mikroplatte. Mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette.
   2. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C heißen Inkubator. Nach 30 Minuten werden 50 μl Stopplösung (100 mM Glycin, pH 10,7) zugegeben, um die Enzymreaktion zu beenden.
   3. Lesen Sie den Außendurchmesser der Reaktionsgemische mit einem Mikroplatten-Reader mit UV-sichtbarer Absorption in Dual-Wellenlängen-Einstellung ab; 405 nm für die Bestimmung des Niveaus der Enzymreaktion bzw. 620 nm für die automatische Hintergrundsubtraktion.
5. Messen Sie die Konzentration von Histamin¹⁷.
   1. Übertragen Sie 100 μl der geklärten Zelllysate auf die Anti-Histamin-mAb-beschichtete Platte, die mit dem Histamin-ELISA-Kit geliefert wird. Führen Sie einen kompetitiven Histamin-ELISA-Assay gemäß dem Handbuch des Herstellers durch.
   2. Lesen Sie den Außendurchmesser der Proben mit einem Mikroplatten-Reader mit UV-sichtbarer Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm ab.
6. Bestimmung des Verhältnisses von Mastzellen in PECs mit Durchflusszytometrie¹⁸.
   1. Übertragen Sie 1 x 10⁵ rohe oder mastzelldepletierte PECs in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden. Die Platte bei 300 x g für 2 min bei 10 °C zentrifugieren.
   2. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl FACS-Puffer. Fügen Sie 1 μl Anti-Maus-C-Kit (0,5 mg/ml) und Anti-Maus-IgE-mAbs (0,5 mg/ml) hinzu.
   3. Wirbeln Sie die Zellen kurz ein. Halten Sie die Zellen 20 Minuten im Dunkeln auf Eis.
   4. Füllen Sie die Wells mit 150 μl FACS-Puffer. Die Platte bei 300 x g für 2 min bei 10 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Puffer, indem Sie die Platte schnell umdrehen.
   5. Resuspendieren Sie die Zellen mit 150 μl FACS-Puffer, der Propidiumiodid (1 μg/ml) enthält. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.

2. Mastzell-Degranulationsassay mit rohen PECs

1. Bestimmen Sie das Ausmaß der Mastzelldegranulation (%-Degranulation).
   1. Injizieren Sie 3 BALB/C-Mäuse (8 Wochen alt, männlich) intravenös (i.v.) mit 3 μg Anti-DNP-mAb (Maus-IgE). Isolieren Sie PECs einen Tag nach der Ab-Injektion (siehe Schritt 1.1).
   2. Platte 90 μl rohe PECs (5,5 x 10⁶/ml) in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden (insgesamt 4 Wells). Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang in einem 37 ^°C befeuchteten CO₂ -Inkubator.
   3. Geben Sie 10 μl DNP-BSA (5 ng/ml in 1x PBS) in die Vertiefungen, die PECs enthalten. Inkubieren Sie die Platte 10 min lang in einem 37 °C_{CO 2} -Inkubator.
   4. Die Platte wird unmittelbar nach der Inkubation 5 min lang bei 10 °C bei 300 x g zentrifugiert. Nehmen Sie die Überstände (100 μL) vorsichtig mit einer Pipette auf. Bewahren Sie sie in einer neuen 96-Well-Platte mit rundem Boden auf Eis auf.
   5. Geben Sie 100 μl Zelllysepuffer (0,1 % Triton X-100 in 1 x PBS, pH 7,4) in die Mikrotiterplatten-Wells, die PECs enthalten. Den Teller 60 min auf Eis legen.
   6. Führen Sie den β-Hexosaminidase-Assay durch.
      1. Es werden zwei von vier Sätzen der Überstände und der entsprechenden Zelllysate entnommen, die nach dem Degranulationsassay in Eis gelagert wurden (siehe Schritte 2.1.4 und 2.1.5). Teilen Sie den Überstand und das Zelllysat in zwei separate Vertiefungen (jeweils 50 μl) auf, um den Assay zu duplizieren.
      2. Geben Sie 50 μl β-Hexosaminidase-Substratlösung in jede Vertiefung. Die Platte bei 37 °C 30 min inkubieren. 50 μl Stopplösung (100 mM Glycin, pH 10,7) in das Reaktionsgemisch geben.
      3. Den Außendurchmesser der Reaktionsgemische ablesen (siehe Schritt 1.4.3). Berechnen Sie das Ausmaß der Mastzelldegranulation wie folgt.
         % Degranulation =_{OD-Überstand} /(_{OD-Überstand} +_OD-Lysat) X 100%
   7. Führen Sie den Histamin-Assay durch.
      1. Geben Sie 100 μL 1x PBS in zwei weitere Vertiefungen der Überstände und die entsprechenden Zelllysate, die nach der Degranulation eingespart wurden, um das Gesamtvolumen der Proben auf 200 μL zu bringen. Teilen Sie jede Probe in zwei separate Vertiefungen in einer Histamin-ELISA-Platte auf, die mit dem Histamin-ELISA-Kit geliefert wird.
      2. Führen Sie den ELISA-Assay gemäß dem Handbuch des Herstellers durch. Lesen Sie den Außendurchmesser der Proben mit einem Mikroplatten-Reader mit UV-sichtbarer Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm ab. Berechnen Sie das Ausmaß der Degranulation wie in 2.1.6.3.
         % Degranulation = [Histamin]_sup /([Histamin]_sup + [Histamin]_Lysat) X 100%
2. Bewerten Sie die Auswirkungen von Antiallergika auf Mastzellen, die in vivo mit dem ex vivo Mastzell-Degranulationsassay ausgeübt werden.
   1. Oral (p.o.) 200 μl Dexamethason¹⁹ (DEX) bzw. Ketotifen²⁰ (KET) an Mäuse (6 Wochen alt, männlich) einmal täglich für 3 Tage (6 Mäuse/Gruppe) verabreichen.
   2. Injizieren Sie den Mäusen nach der 3^. Behandlung intravenös (i.v.) 3 μg Anti-DNP-IgE. Teilen Sie jede Gruppe von Mäusen in zwei separate Käfige (3 Mäuse/Käfig) auf; einer für den PSA-Assay und der andere für den ex vivo Mastzell-Degranulationsassay.
   3. Führen Sie einen PSA-Assay durch
      1. Injektion von DNP-BSA (80 μg) an die Mäuse einen Tag nach der Injektion von Anti-DNP-IgE. Messen Sie die Körpertemperatur mit einem rektalen Thermometer alle 15 Minuten für 1 Stunde, beginnend unmittelbar nach der Injektion von DNP-BSA.
      2. Einen Tag nach der Injektion von DNP-BSA wird das Blut entnommen. Messen Sie den MCPT-1-Spiegel im Serum mit ELISA.
   4. Ex-vivo-Mastzell-Degranulationsassay durchführen.
      1. Isolieren Sie PECs aus den Mäusen einen Tag nach der Injektion von Anti-DNP-IgE. Zählen Sie die Anzahl der isolierten PECs.
      2. Platte 90 μl rohe PECs (5,5 x 10⁶/ml) in einer 96-Well-Platte (4 Wells pro Maus). Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C befeuchteten CO₂ -Inkubator für 30 min.
      3. 10 μl DNP-BSA (5 ng/ml) zugeben. Inkubieren Sie die Platte 10 min lang bei 37 °C befeuchtetem CO₂ -Inkubator.
      4. Die Platte bei 300 x g für 5 min bei 10 °C zentrifugieren. Nehmen Sie die Überstände (100 μL) vorsichtig und lassen Sie die Zellen in den Vertiefungen zurück.
      5. Geben Sie 100 μl Zelllysepuffer in die Vertiefungen. Den Teller 60 min auf Eis inkubieren lassen.
      6. β-Hexosaminidase-Assay und Histamin-ELISA-Assay wie in 2.1.6 und 2.1.7 beschrieben durchführen. Berechnen Sie die prozentuale Degranulation wie in Schritt 2.1.6.3.

Bestimmung der optimalen Anzahl von PECs für ex vivo Mastzell-Degranulationsassays

Mastzellen (c-kit⁺· IgE⁺ doppelt positive Zellen)¹⁵ machen nur etwa 2 % der PECs aus (Abbildung 1A). Unter der Schätzung der maximalen Konzentrationen von mastzellspezifischen Molekülen, die in den Kulturüberständen nachgewiesen werden können, unter der Annahme, dass 100 % der Gra...

Die Erkenntnis, dass Mastzell-Degranulationsassays mit einer relativ kleinen Anzahl von rohen Maus-PECs durchgeführt werden können, ist von Bedeutung. Auch wenn PECs eine ausgezeichnete Quelle für primäre Mausmastzellen sein müssen, ist es anspruchsvoll, Mastzellen in PECs zu reinigen. Obwohl ein Dichtegradientenmedium wie Percoll²⁵ erfolgreich für die Aufreinigung von Mastzellen aus Ratten-PECs verwendet wurde, war seine Verwendung für die Reinigung von pe...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir danken Herrn Wonhee Lee und Frau Eunjoo Lee für ihre technische und administrative Unterstützung. Wir danken auch Dr. Thi Minh Nguyet Nguyen für ihre aufmerksamen Kommentare. Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien der Chungnam National University (CNU Research Grant 2017-2098-01) und der National Research Foundation of Korea (NRF-2019R1F1A1061894 und NRF-2019M3A9G4067293) unterstützt.