在肺纤维化小鼠模型中口咽给药博来霉素

我们的研究旨在了解肺纤维化发病机制背后的免疫机制。该领域最大的挑战之一仍然是将体外和体内模型转化为人类肺纤维化。存在许多动物模型来研究肺纤维化。

我们寻求对最常用的模型之一博来霉素小鼠模型进行标准化，以便它易于适应其他实验室使用。我们提出了一种在肺纤维化小鼠模型中施用博来霉素的微创、高度可重复且安全的方法。这种动物模型在体外人类研究中得到了补充。

它涉及运行对发病机制至关重要的细胞类型，并在生理上复制损伤期间发生的通气、灌注和气体交换的变化。我们预测，严重降低体内组织病理学严重程度的干预措施可能表明更好的临床结果。继续在化学罩中制备博来霉素溶液，同时遵循适当的化疗预防措施。

首先将博来霉素粉末溶解在无菌 PBS 中，制备每毫升 10 单位的储备液浓度。根据所使用的特定博来霉素和实验目标，根据体重根据所需剂量制备最终工作浓度。为了调整最终给药体积，将博来霉素稀释至每毫升 0.375 单位，确保 25 克小鼠的总体积为 50 毫升。

将适当麻醉的鼠标以 60 至 80 度角悬挂在手术平台上，将其悬挂在前门牙上，以有效打开口咽部。使用光滑的微血管夹阻塞鼻道，以迫使呼吸通过口咽部。使用镊子将舌头从口咽部缩回。

使用带有短诱饵短头的步进移液器，将所需体积的博来霉素或盐水对照轻轻放入口咽后部。确保可见的液体气泡非常明显。继续将舌头保持在原位，直到鼠标吸出溶液，这是可见的，通常是听得见的。

确认抽吸后，小心地取下鼻夹。在将鼠标放回笼子之前，观察鼠标处于悬挂位置 15 秒，以确保博来霉素溶液没有回流。然后将动物侧卧放在笼子里，下面放一个加热垫，以保持热中性。

轻轻捏住脚趾，确保动物保持体温正常，以促进醒来。监测小鼠直到它们恢复完全意识，这通常需要一到两个小时，具体取决于氯胺酮剂量以及动物的大小和新陈代谢。每天临床监测小鼠的体重、梳理、活动水平和呼吸状态的变化。

跟踪体重作为模型有效性的关键标志。在适当的时候，从适当安乐死的小鼠身上收获肺。对于组织学，解剖封闭的肺部并将它们固定在 4% 多聚甲醛中 24 小时。

使用苏木精和伊红或 Masson 三色进行石蜡包埋、切片和染色。对于可溶性胶原蛋白测量，将右肺匀浆。对于流式细胞术，使用组织解离剂和酶溶液消化右肺以获得单细胞悬液。

按照标准方案进行流式细胞术染色和分析。与 PBS 对照相比，到第 7 天，在博来霉素处理的肺样本中观察到肺泡间隔和小炎症或纤维化区域的纤维化变化。到第 14 天，出现更大、更汇合的纤维化区域，正常肺泡结构明显破坏。

到第 21 天，纤维化变化持续存在，没有更显着的增加。改良的 Ashcroft 评分系统证实，第 14 天和第 21 天之间的纤维化水平相似。第 14 天进行的羟脯氨酸测定表明，与对照组相比，博来霉素处理的肺中总可溶性胶原蛋白含量增加。

定量聚合酶链反应分析显示，促纤维化基因 Col1A1 和 TGFB 响应博来霉素后上调。流式细胞术分析显示骨髓细胞强烈浸润，包括肺间质巨噬细胞、单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞和中性粒细胞。