本研究旨在建立一种有效的方案，用于在肺部感染模型中保留小鼠的气道内容物。我们正在开发回答吸入真菌孢子在肺部何处的问题的能力。最近，许多研究小组已经确定了各种气道上皮细胞在感知感染和启动保护性免疫反应中的作用。
这些上皮细胞的范围从支气管中的俱乐部细胞到末端肺泡中的 II 型上皮细胞。常见的肺部制备技术是用液体固定剂给肺部充气，以保存肺组织以供下游组织学分析。然而，这种技术会置换气道内容物，例如吸入的真菌孢子。
我们的方案保留了吸入真菌孢子在肺部的自然位置，同时通过空气充气保持适当的肺形态，并通过血管灌注保持适当的肺固定。我们希望使用这个协议来表征孢子似乎落在我们的模型中的支气管肺泡连接处，但我们将利用孢子靠近各种上皮细胞的位置并研究由此产生的免疫反应。首先，在 30 摄氏度下，用 6 个 Coccidioides posadasii 孢子和 5 微摩尔浓度的 CFSE 的 10 次方染色 30 分钟。
染色后，用 PBS 洗涤孢子。以 12， 000 g 离心孢子，并将沉淀重悬于 25 微升 PBS 中，用于适当浓度的孢子接种。准备一个装有 25 微升孢子接种物的移液管。
在 Nalgene 罐中麻醉小鼠后，用一只手将鼠标置于仰卧位，让它定期喘气 3 到 5 次。将移液器吸头放在小鼠口咽部的后部，并在吸入过程中释放接种物。用手和拇指感受小鼠胸部前后的湿啰音，以确认接种物的吸入。
用 70% 乙醇喷洒深度麻醉的小鼠。用剪刀小心地剪掉老鼠的皮肤，然后将其拉开以露出腹膜。然后，将上半部分的皮肤拉到鼠标头上，释放手臂。
现在，沿着胸腔的下侧切开胸骨的腹膜，露出腹膜。将肝脏向下移位，露出隔膜。用剪刀小心地将隔膜从肺实质上刺出。
接下来，切开左侧的胸腔，露出心脏。使用 30 号针头，将 5 至 10 毫升 PBS 注射到右心室。拔出针头后，使用新针头将 5 毫升 10% 中性缓冲福尔马林注射到右心室。
用剪刀去除胸腔的前半部分。要暴露气管，请切开颈部左右两侧的上肋骨和锁骨，避开气管所在的中线。使用镊子，将剩余的上肋骨和锁骨紧紧扣在颈部中线附近，然后向上拉，直到气管暴露出来。
准备一根 10 厘米的缝合线并将其拉到气管下方。在暴露的气管的下端预先打一个松散的结。然后，准备一个带有 18 号导管的 1 毫升空气注射器。
使用 18 号针头，在暴露区域的上端的气管上打一个孔。现在，将导管插入孔中，确保紧密配合以防止空气逸出。然后，在 10 秒内缓慢地将 1 毫升空气注入肺部，观察所有肺叶的充气情况。
完全充气导致肺部略微包裹心脏并填充未穿刺的横膈膜所占据的体积。将肺部与小鼠分离后，将其放在装有 20 毫升 10% 中性缓冲福尔马林的 50 毫升锥形管的顶部边缘。将缝合线放在管子外面，然后拧下盖子。
首先，用 PBS 冲洗分离的小鼠肺，并将它们置于 30% 蔗糖 PBS 溶液中，在 4 摄氏度下放置 72 至 96 小时。然后，去除多余的组织，并将肺放入含有 OCT 培养基的 Cryomold 中。在零下 80 摄氏度下冷冻样品。
在零下 20 摄氏度的 OCT 冻存块中平衡标本 1 小时，然后以 20 至 100 微米的厚度对冻存块进行切片。将切片收集到载玻片上，让它们干燥 30 分钟到 1 小时。将玻片放入室温下的 PBS 浴中 30 分钟，以从组织中去除 OCT。
然后，使用抹布去除组织标本周围载玻片周边的任何多余液滴。使用疏水性 PAP 笔在载玻片上的标本周围画一个周边，并让其干燥 5 分钟。接下来，将 300 μL 新鲜制备的无动物封闭溶液添加到玻片上，并在室温下孵育。
现在，将玻片在 300 μL 初级 Alexa Fluor 647 偶联的大鼠抗小鼠 EpCAM 抗体溶液中，在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，去除抗体溶液，用 300 μL PBS 洗涤玻片两次，每次 5 分钟。干燥后，向每块纸巾中加入一滴室温软固化 SlowFade 玻璃封固剂。
将盖玻片盖在组织上，确保其超出样品和疏水标志物周边。首先，将真菌孢子接种、免疫染色的小鼠肺切片置于多通道荧光显微镜下，并选择合适的物镜。要捕获整个肺叶，请收集足够的图像图块并将它们合并在一起。
使用显微镜的软件，导出整个肺叶的图像以进行下游处理。在 QuPath 中，创建一个项目文件并将荧光图像添加到该文件中。通过依次选择分类、像素分类和创建阈值器，将 EpCAM 阳性像素分类为上皮。
选择分辨率、通道、平滑 Sigma 和阈值以识别目标区域。将分类器保存在唯一名称下，然后选择 Create objects。在新的 Create objects 窗口中，选择 New object type as Annotation。
对于肺上皮，将最小物体大小和最小孔尺寸设置为 100 平方微米。选择 OK 后，将创建注释，并可以使用画笔工具进行修改。要对孢子进行分类，请重复肺上皮注释所示的步骤。
然后，从 Create objects （创建对象） 窗口中，选择 Detection （检测） 作为新的对象类型。将最小对象大小和最小孔大小设置为 0 平方微米，然后选择 Split objects（分割对象）。接下来，要按顺序对孢子进行空间分析，请选择 Analyze、Spatial analysis 并计算到注释的有序距离二维。
将计算每个检测到的孢子到 EpCAM 阳性上皮的距离。最后，单击 测量，然后单击 导出测量 导出结果。Coccidioides posadasii 的孢子主要积聚在远端支气管和充气肺的肺泡附近间隙。
与充气肺相比，孢子在正式和液体充气的肺中似乎更分散在远离支气管的地方。与生理性充气相比，液体充气肺中孢子与 EpCAM 阳性细支气管上皮之间的距离更大，表明孢子更分散。
