使用 iChip 技术分离土壤微生物

我们正在尝试发现新型化学来对抗农业病原体。使用 iChip 技术，我们分离出了新型生物体，我们希望这将带来新的化学反应。将这些生物体和/或其天然产物与农业病原体进行检测可能会导致发现新的生物农药候选生物体和/或化合物。

iChip 方法使我们能够通过提供一段时间的驯化和与自然环境的接触来分离在常规条件下无法培养的微生物。我们改进的 iChip 构建简单、便宜，并且降低了微生物污染的风险，使其易于实现各种研究目标。我们的 iChip 结果提出了一些问题，例如哪些机制驱动新型微生物抑制病原体？

这些生物活性化合物在实际试验中能否可靠地发挥作用？环境因素如何影响其功效？解决这些问题将指导可持续的生物农药开发，改变植物病害管理，并减少对合成杀菌剂的依赖。

该实验室将应用 iChip 技术从覆盖作物产生的抑制疾病土壤中分离出新型细菌，识别新型微生物和生物活性化合物。这些将在受控植物病害研究中进行测试，以开发创新、可持续的合成杀菌剂替代品来管理农业病害。要使用 5 毫米琼脂打孔工具构建改良的 iChip，请从 96 孔板中取出孔的底部。

将 0.05 微米的聚碳酸酯膜切割成矩形，确保尺寸与 96 孔板的底部区域相匹配。涂上硅酮密封剂，将聚碳酸酯膜粘附到 96 孔板的底部。确保胶粘剂密封孔，但不要完全覆盖孔的开口。

让板干燥 24 小时。向标有 A 至 D 的 15 毫升离心管中加入 4.5 毫升无菌水，向标有 E 至 H 的 50 毫升离心管中加入 1 克土壤。然后向试管中加入 10 毫升水，涡旋混合物 10 分钟。

让土壤悬浮液沉降 10 分钟。接下来，将 0.5 毫升土壤上清液移液到试管 A 中并充分混合。现在，将 0.5 毫升细胞悬液从试管 A 转移到试管 B 中并充分混合。

对所有剩余的离心管重复此作，在 8 个试管上完成一系列 10 倍稀释。首先，将 iChips 完全浸入 95% 乙醇中。15 分钟后，从乙醇中取出板，并将其放在层流罩中的无菌纸巾上。

让乙醇蒸发，同时打开层流罩中的紫外线消毒器 15 分钟。将 360 微升无菌琥珀酸盐、最低盐或 SMS 培养基移液到板的第一列中，作为对照。将 45 毫升 SMS 加入管 E.Mix 中的细胞悬液中，充分混合，使细胞悬液与琼脂混合。

将 360 微升琼脂细胞混合物移液到 96 孔板的所有剩余孔中。培养基凝固后，用 PCR 板盖密封板的顶部。使用试管 F、G 和 H 填充板，以制备总共四个浓度差异为 10 倍的板。

将板放入装有约 1 英寸土壤的容器中，膜面朝下。将板放在有盖容器内，在 25 摄氏度的黑暗中孵育。六周后，检查 iChips 的微生物生长情况。

用无菌水冲洗改性的 iChip 三次，以去除所有污垢颗粒。用 95% 乙醇擦拭板的顶部和侧面，避开带有半透膜的一侧。使用无菌刀片，切开含有菌落的孔周围的板盖，然后用无菌镊子去除方块。

使用无菌划线工具，刺穿菌落，并使用四象限法在 SMS 琼脂平板上划线。将板在 25 摄氏度下孵育一周或直到观察到菌落生长。孵育后，检查菌落以确认培养物的分离。