通过细胞外囊泡释放 LC3-II 与细胞内 LC3 阳性囊泡积累的关系的评价

我们的研究重点是以核蛋白 TDP-43 在细胞质中积累为特征的进行性神经退行性疾病，例如 ALS 或 FTLD-TDP。我们的目标是了解 TDP-43 病理如何以朊病毒样的方式在大脑中传播。我们之前发现 TDP-43 通过细胞外囊泡的释放是由自噬失调介导的。

FTLD-TDP 的前颗粒蛋白促进了这一过程。下一个挑战是阐明自噬如何调节含有 TDP-43 的细胞外囊泡的产生和释放，这可能导致发现 ALS 或 FTLD-TDP 的治疗靶点。首先，取培养的 HeLa 细胞，使用细胞计数器计数，并在含有培养基的 6 厘米平板上接种 1 乘以 10 至 6 个细胞的幂。

将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和控制湿度下孵育 24 小时。接下来，制备 20 μmol siRNA 溶液。在低保留管中混合 100 μL 还原血清培养基和 3 μL siRNA，制备溶液 A，然后，在低保留管中混合 100 μL 还原血清培养基和 5 μL 转染试剂，制备溶液 B，然后混合溶液 A 和溶液 B，然后在室温下孵育混合物 5 分钟。

现在将溶液 A 和 B 的混合物添加到用于培养 HeLa 细胞的培养基中，并孵育 24 小时。第二天，用 PBS 洗涤细胞，并将细胞暴露于 500 微升 0.25% 胰蛋白酶和一毫摩尔 EDTA 溶液中，在 37 摄氏度下，含 5% 二氧化碳并控制湿度 5 分钟。接下来，向细胞中加入 2.5 毫升培养基，并使用附有 20 微升移液器吸头的巴斯德移液管，制备单细胞悬液。

计数细胞后，在 10 厘米的平板上接种 1 乘以 10 到 6 个细胞的幂，然后孵育，如前所述。在孵育结束时，制备含有载体或 100 纳摩尔巴弗洛霉素 A1 的培养基。然后将细胞暴露于含有载体或 100 纳摩尔巴弗洛霉素 A1 的培养基中，并孵育 24 小时。第二天，从 10 厘米板中收集所有培养基。

将收集的培养基转移到 15 毫升试管中，并在 4 摄氏度下以 3， 000 G 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。为了分离 P1 细胞外囊泡组分，在 3， 000 G 离心后将上清液转移到离心管中。将试管在 20， 000 G 和 4 摄氏度下离心 1 小时。

为了分离 P2 细胞外囊泡组分，在 20， 000 G 离心后将上清液转移到超速离心管中。在 4 摄氏度下以 110， 000 G 离心 1 小时。用实验室擦拭擦去管内多余的水分后，将离心管中剩余的沉淀重悬于 50 微升两次样品缓冲液中，以制备 P1 细胞外囊泡组分。

然后倾析去除上清液。用实验室抹布擦去管内多余的水分，然后将超速离心管中剩余的沉淀重悬于 50 微升两次样品缓冲液中，以制备 P2 细胞外囊泡组分。将 P1 和 P2 细胞外囊泡组分在 100 摄氏度下在加热块上孵育 10 分钟。

将培养基从 10 厘米板转移到 15 毫升试管中后，用 PBS 洗涤 10 厘米培养皿中的细胞。然后将细胞暴露于 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶和 1 毫摩尔 EDTA 溶液中，在 37 摄氏度下，含 5% 二氧化碳并控制湿度 5 分钟。向细胞中加入 8 mL 生长培养基。

使用附有 200 微升移液器吸头的巴斯德移液管，移液细胞以制备单细胞悬液。将细胞悬液转移到 15 毫升试管中，并在 4 摄氏度下以 1， 000 G 离心 10 分钟。然后使用抽吸器去除上清液。

将 PBS 添加到细胞沉淀中，并在 4 摄氏度下以 1， 000 G 离心 5 分钟。去除 PBS 后，在含有 1% sarcosil 的 1 毫升 A68 缓冲液中对细胞沉淀进行超声处理。将 300 μL 细胞裂解物与 100 μL 四次样品缓冲液混合。

将混合物在 100 摄氏度下在加热块上孵育 10 分钟，以制备细胞组分。