在该方案中，我们提出了一个分步教程，用于通过全血流式细胞术测量血小板相关组织因子，评估细胞内隔室、阻滞条件和细胞表面的蛋白质，无论是在静息状态还是激活状态下使用 DP，最常见的血小板激动剂组织因子之一由血小板子集表达。如果在富含血小板的 PRP 血浆或洗涤的血小板中测量组织因子阳性血小板，则在样品制备过程中可能会丢失该亚群。在墙壁上进行此评估时，不会出现此风险。
由于分析前和方法学问题，自本世纪初发表第一份报告以来，血板相关组织因子一直存在争议。该协议阐明了这些问题，并用于开展由国际血栓形成和止血学会 ISDH 支持的国际项目，以标准化血小板相关组织因子测量或对几微升血液进行血流式细胞术，允许血小板相关组织因子分析适用于临床环境。此外，可以固定样品并在之后进行标记，使这种分析适用于许多医院和实验室。
首先，为每个抗体体积准备一个试管。要进行测试，请向每个试管中加入一滴阴性珠子和一滴阳性珠子。向试管中加入 20 μL 每种抗体稀释液并涡旋。
立即将试管在室温下避光孵育 20 分钟。然后向每管中加入 1 毫升不含钙镁 pH 值为 7.4 的 PBS 并涡旋，轻轻倒置柠檬酸钠真空剂五次，以彻底混合血液和抗凝剂。将 50 μL 血液转移到 1.5 mL 试管中。
然后加入 950 微升 1% 多聚甲醛。轻轻混合样品，并在室温下孵育 90 分钟。现在，将样品以 1， 500 G 离心 5 分钟，并在室温下休息。
去除上清液 Reese 后，将沉淀悬浮在不含钙和镁的 1 毫升 PBS 中。在 pH 值为 7.4 时，将 100 μL 固定血液分配到每个试管中，并以 1， 500 G 离心 5 分钟。在室温下休息，然后取出上清液复苏。
将沉淀悬浮在 100 μL 0.1% Triton PBS 中以渗透样品，并在室温下孵育 10 分钟。首先，准备一根用于荧光减去 1 个对照的试管和 1 个用于组织因子染色的试管。将抗体添加到每管中的 100 μL 固定和通透全血中。
向每个试管中加入 300 微升 pH 值为 7.4 的不含钙和镁的 PBS 并混合。然后将染色的样品避光储存，直到流式细胞术分析稀释 α CD 1 42 HTF 一种单克隆抗体和 Alexa Fluer 6 33 山羊抗小鼠免疫球蛋白 G 在不含钙和镁的 PBS 中。接下来，准备三个样品管并分配不含钙和镁的 PBS。
在 pH 值为 7.4 时，分配 7.5 微升稀释的 α CD 1 42 htf 一种单克隆抗体，并加入 5 微升二磷酸腺苷。轻轻倒置柠檬酸盐真空剂五次，以彻底混合血液和抗凝剂。将 5 μL 全血分配到每管中。
轻轻混合样品，并在室温下孵育 20 分钟。对于样品固定，向每管中加入 300 μL 1% PFA，并以 1， 500 G 离心 5 分钟，并在室温下休息。去除上清液后，将沉淀悬浮在 90 微升不含钙和镁的 PBS 中。
在 pH 值为 7.4 时，轻轻移液，将 5 微升稀释的 Alexa Fluer 6 33 免疫球蛋白 G 和 5 微升 α CD 41 PE 分配到每支管中。将样品在室温下避光孵育 15 分钟。然后向每个试管中加入 300 微升 pH 值为 7.4 的不含钙和镁的 PBS 并混合。
首先，在显示所有事件的对数刻度上创建前向散射区和侧向散射区点图，在对数刻度上创建 CD 61 A 和侧向散射区点图，显示所有事件。为了可视化血小板数量，将侧向散射高度的阈值设置为大约 2000，将阈值设置为每 CP B 6 个 90 H 的大约 1000.根据日常质量控制调整 PE Y 5 8 5 和每个 CP B 六个 90 增益，并将流速设置为低。现在在 10 条光线的 3 次方和 10 条光线的 5 次方之间画一个区域，称为 CD 61 正。
要识别血小板群，请复制 FMO 并将其重命名为 TFIC。采集样品并记录 CD 61 阳性门内 10， 000 个事件的数据文件。在对数刻度上创建前向散射区域和侧向散射区域点图，显示所有事件。
在对数刻度上创建一个 CD 41 A 和侧向散射区域点图，显示所有事件。然后根据日常质量控制调整 Alexa floor 6 33 增益和 PE wifi 5 8 5 增益。在侧向散射高度上将阈值设置为大约 1000，在 PEY 5 85 上设置为 2， 500 H.To 可视化血小板种群，将流速设置为低。
现在画一个介于 10 条到 4 次方和 10 次方到 5 次方的区域，称为 CD 41 阳性，以识别血小板群。然后为每个样品创建一个试管，并将 TF Unstimulated 和 TF Stimulated 命名为 TF Stimulated。采集样品并在 CD 41 阳性步态离心机中记录 10， 000 个事件的数据文件。
0.129 摩尔柠檬酸钠真空剂，100 G 在室温下喷射 10 分钟，不断裂。然后从离心机中取出真空采血器。收集获得的富血小板血浆，将其转移到 10 毫升聚丙烯管中，并使用血细胞计数器在富血小板血浆中记录收集的血小板计数两次的体积。
α CD 61 抗体染色鉴定的血小板群显示，约 26.8% 的循环血小板含有细胞内组织因子流式细胞术分析表明，组织因子由约 2.8% 的静息血小板表达，并在用腺苷二磷酸激活后增加到 24.5%。较大尺寸的血小板表达较高的组织因子水平，绿点代表较大的血小板亚群。流式细胞术分析表明，使用 100 g 离心制备的富血小板血浆保留了与保留较大血小板且组织因子阳性率更高的全血相似的群体。
较高的离心力导致较大的组织因子阳性血小板丢失，如 PRP 群体中前向散射减少所示。
